一種磷脂型dha的發(fā)酵制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，它包括以下步驟：(1)以產(chǎn)DHA的菌株為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中進行高密度發(fā)酵，獲得富含甘油脂型DHA的菌體細胞；(2)向步驟(1)高密度發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中添加碳源、氮源、磷源、氨基酸，繼續(xù)發(fā)酵獲得富含磷脂型DHA的菌體細胞；(3)收集步驟(2)得到的富含磷脂型DHA的菌體細胞，經(jīng)破碎、萃取獲得富含磷脂型DHA的油脂。本發(fā)明最終得到15-40％的極性油脂，其中主要成分為磷脂，極性油脂中DHA含量達到48.16％。本發(fā)明將富含甘油酯型DHA的油脂轉(zhuǎn)化為富含磷脂型DHA的油脂，并有效提高了油脂中磷脂型DHA的含量。
【專利說明】一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種磷脂型DNA的發(fā)酵制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 二十二碳六烯酸（DHA)是一種重要的omega-3長鏈多不飽和脂肪酸，是大腦和視 網(wǎng)膜組織中細胞膜的組成成分，具有增強視力、促進腦細胞發(fā)育及預防高血壓、動脈硬化、 心血管疾病等生理功效。由于人體很難通過自身合成來滿足機體對DHA的需求，因此必須 依靠從外界食物中獲取。
[0003] 目前，DHA的主要來源是魚油，且主要以甘油三酯的形式被人體攝入。DHA的另一 種存在形式為磷脂型DHA(DHA-c〇ntaining PL)。磷脂是生物膜的主要成分，研究表明它具 有降血脂，抗動脈粥樣硬化等作用。DHA的存在形式不同，在人體內(nèi)的吸收方式和吸收效率 也不同。甘油酯型DHA在人體內(nèi)主要以被動擴散的方式被吸收，吸收率為50%左右。而磷 脂型DHA在人體內(nèi)主要以主動吸收的方式被吸收，吸收率接近100%。Kafrawy等人研究發(fā) 現(xiàn)，與其他磷脂型脂肪酸相比，磷脂型DHA對小鼠白血病細胞具有更大的毒性。研究還發(fā) 現(xiàn)，磷脂型DHA能夠有效降低小鼠血漿和肝臟中的總膽固醇和甘油三酯含量，改善正常小 鼠的血脂水平。Gisbert等人研究發(fā)現(xiàn)，磷脂型DHA較甘油酯型DHA而言，對仔魚的生長有 更好的促進作用。Schaefer等人研究發(fā)現(xiàn)，血漿中磷脂型DHA水平的增加可以有效減少癡 呆的發(fā)病率。
[0004] 磷脂型DHA只存在于蛋黃中，且含量極低。目前，國內(nèi)磷脂型DHA的研究主要集中 在以下幾個方面：（1)磷脂型DHA的應用；（2)磷脂型DHA的提?。唬?)磷脂型DHA的生理作 用研究。其中，并未發(fā)現(xiàn)利用生物發(fā)酵法制備磷脂型DHA的相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法以填補國內(nèi) 空白。
[0006] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，它包括以下步驟：
[0008] (1)以產(chǎn)DHA的菌株為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中進行高密度發(fā)酵，獲得富含甘油 脂型DHA的菌體細胞；
[0009] (2)向步驟（1)高密度發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中添加營養(yǎng)物質(zhì)，繼續(xù)發(fā)酵獲得富含 磷脂型DHA的菌體細胞；
[0010] (3)收集步驟（2)得到的富含磷脂型DHA的菌體細胞，經(jīng)破碎、萃取獲得富含磷脂 型DHA的油脂；
[0011] 其中，所述的營養(yǎng)物質(zhì)為碳源、氮源、磷源、氨基酸中的任意一種或幾種的組合。
[0012] 其中，所述的產(chǎn)DHA的菌株為裂殖壺菌屬、破囊壺菌屬、吾肯氏壺藻屬，優(yōu)選為裂 殖壺菌屬，最優(yōu)選為CCTCC No :M209059菌株（該菌株已經(jīng)公開在申請?zhí)枮?00910033869. 5 的中國專利中）。
[0013] 上述步驟（1)中的高密度發(fā)酵包括如下步驟：
[0014] (Ia)將保存在甘油管中的菌株接入裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在 20?30°C的搖床中，以150?200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24?48h，獲得一級種子液；
[0015] (Ib)將步驟（Ia)得到的一級種子液按照2?10% v/v接種量接入裝有IOOml種 子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20?30°C的搖床中，以150?200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24?48h， 獲得二級種子液；
[0016] (Ic)將步驟（Ib)得到的二級種子液按照2?10% v/v接種量接入裝有IOOml種 子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20?30°C的搖床中，以150?200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24?48h， 獲得三級種子液；
[0017] (Id)將步驟（Ic)中得到的三級種子液按照2?10% v/v接種量接入裝有發(fā)酵培 養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，然后向發(fā)酵罐中加入消泡劑，進行發(fā)酵，使菌株發(fā)酵產(chǎn)富含甘油酯型DHA 的油脂。
[0018] 上述步驟（Id)中發(fā)酵條件的通氣量為0· 2?Ivvm,優(yōu)選為0· 6vvm。
[0019] 上述步驟（Id)中發(fā)酵條件的攪拌速度為100?200rpm，優(yōu)選為200rpm。
[0020] 上述步驟（Id)中發(fā)酵條件的罐溫為20?30°C，優(yōu)選為30°C。
[0021] 上述步驟（Id)中發(fā)酵條件的培養(yǎng)時間為90?150h，優(yōu)選為120h。
[0022] 上述步驟（Id)中采用的發(fā)酵方法為間歇式發(fā)酵或補料式發(fā)酵方法。
[0023] 上述高密度發(fā)酵中的種子培養(yǎng)基的碳含量為10?30g/L，優(yōu)選為15?25g/L，最 優(yōu)選為20g/L。
[0024] 上述高密度發(fā)酵中的發(fā)酵培養(yǎng)基碳含量為20?60g/L，優(yōu)選為30?40g/L，最優(yōu) 選為40g/L ;氮含量為2. 1?2. 5g/L，優(yōu)選為1. 8?2g/L，最優(yōu)選為2g/L ;硫含量為2?3g/ L，優(yōu)選為2. 5?3g/L，最優(yōu)選為3g/L ;磷含量為0. 4?I. 5g/L優(yōu)選為1. 2?I. 5g/L，最優(yōu) 選為 I. 5g/L。
[0025] 所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源為葡萄糖、果糖或甘油，優(yōu)選葡萄糖；氮 源為酵母膏、玉米漿、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨或硫酸銨，優(yōu)選酵母膏；磷源為磷酸二氫鉀或 磷酸氫二鉀，優(yōu)選磷酸二氫鉀；硫源為硫酸鎂或硫酸銨，優(yōu)選硫酸銨。
[0026] 上述步驟（Id)所述的消泡劑為silicone SE-2,添加量為0. 3g/L。
[0027] 上述步驟（Id)中采用的發(fā)酵方法為間歇式發(fā)酵或補料式發(fā)酵方法。
[0028] 其中，營養(yǎng)物質(zhì)中，
[0029] 所述的碳源為乙醇、乙酸鈉中的任意一種或幾種的混合物；碳源的添加量為2? 4g/L，優(yōu)選為 4g/L。
[0030] 所述的氮源為酵母膏、硫酸銨、谷氨酸鈉中的任意一種或幾種的混合物，氮源的添 加量為5?20g/L，優(yōu)選為15?20g/L，最優(yōu)選為20g/L。
[0031] 所述的磷源為磷酸二氫鉀中，磷源的添加量為2?4g/L，優(yōu)選為3?4g/L，最優(yōu)選 為 4g/L。
[0032] 所述的氨基酸為脯氨酸、賴氨酸，添加量為0. 1?0. 5g/L，優(yōu)選為0. 2?0. 3g/L， 最優(yōu)選為〇. 3g/L。
[0033] 所述的營養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)選谷氨酸鈉、硫酸銨、乙醇單獨添加，硫酸銨和乙醇雙添加，硫 酸銨和脯氨酸雙添加，最優(yōu)選硫酸銨單獨添加，硫酸銨和脯氨酸雙添加。
[0034] 其中，步驟（2)中，所述的繼續(xù)發(fā)酵條件的通氣量為0· 5?lvvm，優(yōu)選為0· 6vvm。
[0035] 其中，步驟⑵中，所述的繼續(xù)發(fā)酵條件的攪拌速度100?200rpm，優(yōu)選為 170rpm〇
[0036] 其中，步驟（2)中，所述的繼續(xù)發(fā)酵條件的罐溫20?30°C，優(yōu)選為30°C。
[0037] 其中，步驟（2)中，所述的繼續(xù)發(fā)酵條件的培養(yǎng)時間為48?72h，優(yōu)選為72h。
[0038] 步驟（3)具體過程為：收集菌體細胞，采用破壁酶破碎細胞，再用有機溶劑萃提 4?8h，得到富含磷脂型DHA的油脂。
[0039] 其中，所述的有機溶劑為正己烷、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一種或幾種的混合 物，按照有機溶劑與破碎細胞液體積比1:0. 5?2的量添加。
[0040] 其中，所述的破壁酶為蛋白酶，添加量為2?8g/L。
[0041] 萃取得到油脂后，利用柱層析方法分離油脂組分，分別獲得極性脂質(zhì)和中性脂質(zhì)， 所述的柱層析方法如下：
[0042] 取100?200目層析專用硅膠粉于120°C烘箱內(nèi)烘24h，使其含水量在5%左右，待 用。先將30ml石油醚加入層析柱中，拍打除去砂芯中的氣泡；取一定量硅膠粉至燒杯中，力口 入一定量石油醚，攪拌至無氣泡，再緩緩倒入層析柱中，使其均勻沉降，用中性洗脫劑（石 油醚/乙醚，9:1，v/v)沖洗柱子2h，使柱子緊實。稱取2. Og左右油脂，用中性洗脫劑溶解。 將樣品沿柱壁緩緩加入層析柱內(nèi)，先用500ml中性洗脫劑洗脫獲得中性脂，再用極性洗脫 劑（甲醇）洗脫至硅膠柱發(fā)白，分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得各分離組分。
[0043] 利用氣相色譜分別檢測總油脂、中性脂質(zhì)和極性脂質(zhì)中的脂肪酸分布情況，所述 的氣相色譜分析方法采用如下方法：
[0044] 甲酯化方法：取0. 5g左右油脂，用正己燒定容至IOml ;用移液管移取Iml至IOml 容量瓶，加入3ml 0. 5mol/L的KOH-甲醇溶液，于65°C水浴15?20min，冷卻；再加入2ml 8卩3-乙醚-甲醇溶液出?3-乙醚：甲醇=3:7，￥八），水浴651：，5?1〇1^11，冷卻；再加飽和 NaCl溶液、正己烷各2ml，振蕩后靜置、分層，取上層至另一個容量瓶中，用正己烷萃取2-3 次后定容至IOml,取100 μ 1萃取液并加入100 μ 1十九烷酸甲酯（濃度已知）溶液混勻,可 用作DHA分析。
[0045] 氣相分析條件：色譜柱：DB-23 (60m*0. 25mm*0. 25 μ m);檢測器：FID ;載氣：氮氣； 分流比：30/1 ;進樣口溫度：250°C ;檢測器溫度：280°C ;進樣量：1 μ I ;升溫程序：初始柱溫 為100°C，先以25°C /min的速度升至196°C，再以2°C /min的速度升至220°C，保持12min。 柱流速：3. Oml/min ;尾吹流速：30ml/min ;氫氣流速：40ml/min ;空氣流速：400ml/min。
[0046] 有益效果：本發(fā)明提供了一種磷脂型DHA的制備方法，在海洋真菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的 基礎上，采用雙階段發(fā)酵的方法，制備富含磷脂型DHA的油脂。得到的油脂中，極性脂占總 油脂百分含量為15% -40%，極性脂中DHA含量最高可達到48. 16%，其中大部分為磷脂型 DHA。而目前利用微生物發(fā)酵制備DHA油脂的研究主要是富集胞內(nèi)的甘油酯，對磷脂的研究 很少，本專利提供的磷脂制備方法工藝簡單，生產(chǎn)成本較低，且海洋真菌生長較快，更易于 擴大生產(chǎn)規(guī)模。因此，該方法的提出，有利于我們進一步研究磷脂型DHA的生理作用，有效 提高了 DHA產(chǎn)品的應用效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1裂殖壺菌DHA單細胞油脂TLC分析：圖I-A表明裂殖壺菌單細胞油脂中中性 脂主要由甘油三酯（TAG)、甘油二酯（DAG)和甘油單酯（MG)構(gòu)成；將裂殖壺菌單細胞油脂 在極性展層劑中進行薄層分析，圖I-B表明極性脂中以卵磷脂為主。

【具體實施方式】
[0048] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本 發(fā)明。
[0049] 以下實施例中使用的產(chǎn)DHA的菌株為保藏號為CCTCC No :M209059的裂殖壺菌 (Schizochytrium sp.)〇
[0050] 實施例1 :第一階段發(fā)酵制備富含甘油酯型DHA油脂。
[0051] 將保存在甘油管中的DHA菌種接入裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在搖 床上進行種子的活化，溫度30°C，轉(zhuǎn)速170rpm，培養(yǎng)24h，獲得活力較高的種子液。按照同樣 的方法活化三代后，將種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10% (v/v)，通氣量 0. 6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，罐溫30°C，加入消泡劑silicone SE-2,添加量為0. 3g/L，發(fā)酵培 養(yǎng)120h，得到富含甘油酯DHA油脂。發(fā)酵結(jié)果見表1。
[0052] 表1第一階段發(fā)酵結(jié)果
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，它包括以下步驟： (1) 以產(chǎn)DHA的菌株為出發(fā)菌株，在液體培養(yǎng)基中進行高密度發(fā)酵，獲得富含甘油脂型 DHA的菌體細胞； (2) 向步驟（1)高密度發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中添加營養(yǎng)物質(zhì)，繼續(xù)發(fā)酵獲得富含磷脂 型DHA的菌體細胞； (3) 收集步驟（2)得到的富含磷脂型DHA的菌體細胞，經(jīng)破碎、萃取獲得富含磷脂型 DHA的油脂； 其中，所述的營養(yǎng)物質(zhì)為碳源、氮源、磷源、氨基酸的任意一種或幾種的組合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述的產(chǎn)DHA的菌 株為破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬、吾肯氏壺藻屬。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟⑴中，所述 的高密度發(fā)酵包括如下步驟： (la) 將保存在甘油管中的菌株接入裝有IOOml種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20? 30°C的搖床中，以150?200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24?48h，獲得一級種子液； (lb) 將步驟（la)得到的一級種子液按照2?10% v/v接種量接入裝有IOOml種子培 養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20?30°C的搖床中，以150?200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24?48h，獲 得二級種子液； (lc) 將步驟（Ib)得到的二級種子液按照2?10% v/v接種量接入裝有IOOml種子培 養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在20?30°C的搖床中，以150?200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24?48h，獲 得三級種子液； (ld) 將步驟（Ic)中得到的三級種子液按照2?10% v/v接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng) 基的發(fā)酵罐中，然后向發(fā)酵罐中加入消泡劑，在通氣量為0. 2?lvvm、攪拌速度為100? 200rpm、罐溫為20?30°C的條件下培養(yǎng)90?150h，使菌株發(fā)酵產(chǎn)富含甘油酯型DHA的油 脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基 的碳含量為10?30g/L，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基碳含量為20?60g/L，氮含量為2. 1?2. 5g/L， 硫含量為2?3g/L，磷含量為0. 4?I. 5g/L ;上述培養(yǎng)基中，碳源為葡萄糖、果糖或甘油；氮 源為酵母膏、玉米漿、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨或硫酸銨；磷源為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀， 硫源為硫酸鎂或硫酸銨。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟（Id)中，所述 的消泡劑為silicone SE-2,添加量為0. 3g/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述的碳源為乙 醇、乙酸鈉中的任意一種或幾種的混合物，碳源的添加量為2?4g/L ; 所述的氮源為酵母膏、硫酸銨、谷氨酸鈉中的任意一種或幾種的混合物，氮源的添加量 為 5 ?20g/L ; 所述的磷源為磷酸二氫鉀，磷源的添加量為2?4g/L ; 所述的氨基酸為脯氨酸或賴氨酸，添加量為〇. 1?〇. 5g/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟⑵中，所述 的繼續(xù)發(fā)酵條件為：通氣量0. 5?lvvm，攪拌速度100?200rpm，罐溫20?30°C，繼續(xù)培 養(yǎng)48?72h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟⑶具體過 程為：收集菌體細胞，采用破壁酶破碎細胞，再用有機溶劑萃提4?8h，得到富含磷脂型DHA 的油脂。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述的有機溶劑為 正己烷、石油醚、乙醇和乙醚中的任意一種或幾種的混合物，按照有機溶劑與破碎細胞液體 積比1:0. 5?2的量添加。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的磷脂型DHA的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述的破壁酶為 蛋白酶，添加量為2?8g/L。
【文檔編號】C12R1/645GK104313068SQ201410547056
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】黃和, 任路靜, 趙曉艷, 莊小燕, 紀曉俊 申請人:江蘇天凱生物科技有限公司