一株hiv-1 crf01_ae亞型毒株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株HIV-1CRF01_AE亞型毒株及其應(yīng)用。本發(fā)明公開的一株人類免疫缺陷病毒Ⅰ型CRF01_AE亞型(Human Immunodeficiency Virus Type Ⅰ subtype CRF01_AE)病毒，其保藏號為CGMCC No.8787。本發(fā)明公開的HIV-1CRF01_AE亞型臨床分離株GX002可廣泛應(yīng)用于治療艾滋病藥物的篩選，以及HIV-1復(fù)制能力相關(guān)研究，進而對艾滋病的防治研究具有重要的應(yīng)用價值和意義。
CGMCC No.8787
2014.02.18
【專利說明】-株HIV-1CRF01_AE亞型毒株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株Hiv-1CRF01_AE亞型毒株及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 由人類免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的人類獲得性 免疫缺陷綜合征（Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)自1985年傳入中國以來， 在中國的傳播范圍逐漸增大，傳播速率越來越快。其流行先后經(jīng)歷了傳入期和擴散期，目前 進入快速增長期。根據(jù)中國性病艾滋病預(yù)防控制中心2014年第一季度的疫情報告，截至 2014年3月31日，全國報告現(xiàn)存或HIV/AIDS455352例，死亡140750例，現(xiàn)存活HIV感染 者275631例，AIDS病人179721例。性傳播成為主要的傳播途徑，占全部感染的大約90% (包括異性和同性）。中國政府對艾滋病防治高度重視，"十一五"起實施了艾滋病及病毒性 肝炎等傳染病防治科技重大專項，在項目的支持下，艾滋病診斷試劑、疫苗和其他生物預(yù)防 產(chǎn)品的研發(fā)正在快速推進。
[0003]HIV具有高度的變異性，這導(dǎo)致了HIV-1的多樣性，不僅表現(xiàn)在其基于病毒基因堿 基的組成和排列而區(qū)分出的繁多的亞型，更表現(xiàn)為即使是同亞型的病毒，其感染能力、復(fù)制 能力和對環(huán)境的適應(yīng)能力也大相徑庭，這也導(dǎo)致了病毒在毒力上具有很大差別。而這些將 對艾滋病診斷試劑、疫苗和抗HIV-1藥物的研發(fā)和篩選產(chǎn)生深遠影響。
[0004] 病毒的毒力是指病毒感染宿主后能引起終末器官損傷的能力，體現(xiàn)為未經(jīng)治療的 感染發(fā)展為艾滋病的速率。作為影響病毒毒力的主要因素之一，病毒的復(fù)制能力表現(xiàn)為在 宿主細胞內(nèi)病毒顆粒增加的效率。對于抗HIV藥物來說，對臨床分離毒株復(fù)制能力的抑制， 是評價藥物藥效的重要標(biāo)準之一；對于我國HIV-1復(fù)制能力相關(guān)研究來說，也需要一株高 復(fù)制能力的病毒毒株作為標(biāo)準參考毒株來進行系統(tǒng)完善的比對分析。
[0005] 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（簡稱"國家藥監(jiān)局藥審中心"）要求，評 價抗HIV藥物藥效必須采用三種病毒（實驗株、臨床分離株、耐藥株）進行體外實驗。目前 為止還沒有應(yīng)用于艾滋病新藥評價的高復(fù)制能力的標(biāo)準HIV-1臨床分離株，另一方面，我 國的HIV-1復(fù)制能力相關(guān)研究也因缺少高復(fù)制能力的標(biāo)準HIV-1臨床分離株而受到制約。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株HIV_1CRF01_AE亞型毒株及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的 HIV-1CRF01_AE亞型臨床分離株GX002可以應(yīng)用于治療艾滋病藥物的篩選，以及HIV-1復(fù)制 能力相關(guān)研究。
[0007] 本發(fā)明提供一株人類免疫缺陷病毒I型CRF01_AE亞型（HumanImmunodeficiency VirusTypeIsubtypeCRF01_AE)病毒，其保藏號為CGMCCNo. 8787;
[0008] 所述病毒的全基因組序列如SEQIDNo.7所示；
[0009] 所述病毒為具有高復(fù)制能力的人類免疫缺陷病毒I型CRF01_AE亞型病毒。
[0010] 一種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護 范圍，該試劑盒包含上述病毒。
[0011] 一種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的方法也屬于本發(fā)明的保護范 圍，包括如下步驟：
[0012] ⑴測定藥物對宿主細胞的半數(shù)中毒濃度，記作TC5Q ;
[0013] (2)測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統(tǒng)的抗病毒活性，得到藥物對病毒 HIV-1GX002的半數(shù)抑制濃度，記作IC5Q ;
[0014] (3)將步驟⑴得到的TC5Q和步驟⑵得到的IC5Q，帶入公式TI=TC5Q/IC5Q，計算 得到藥物的治療指數(shù)TI;
[0015] 所述宿主細胞/HIV-1GX002系統(tǒng)中所述HIV-1GX002可以在所述宿主細胞中進行 復(fù)制；
[0016] 所述HIV-1GX002為上述病毒。
[0017] 上述方法中，所述宿主細胞為具有輔助受體CCR5或CXCR4的細胞，具體為離體的 人外周血單核細胞。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述步驟（1)的測定方法為MTT法；
[0019] 所述步驟（2)中的IC5Q是通過測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統(tǒng)的抗病毒活 性的細胞病變效應(yīng)觀察法得到或通過檢測HIV-1P24抗原得到；
[0020] 所述檢測HIV-1P24抗原所采用的試劑盒的商品名稱為HIV-1P24抗原檢測試劑 盒，該試劑盒購自河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心。
[0021] 上述病毒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022] 上述病毒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬 于本發(fā)明的保護范圍。
[0023] 上述試劑盒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0024] 上述試劑盒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0025] 上述病毒或上述試劑盒在制備篩選和/或評價藥物在預(yù)防和/或治療HIV-1病毒 引起的疾病的效果的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0026] 本發(fā)明提供的HIV_1CRF01_AE亞型臨床分離株GX002對艾滋病的防治研究具有 重要的應(yīng)用價值和意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為以P24抗原濃度為指標(biāo)測定的HIV-1毒株在人外周血單核細胞 (Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)上的生長動力學(xué)曲線圖。
[0028] 圖2為以逆轉(zhuǎn)錄酶RT濃度為指標(biāo)測定的HIV-1毒株在PBMCs上的生長動力學(xué)曲 線圖。
[0029] 圖3為GX002前病毒DNA的5 '半分子和3 '半分子PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。

【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032]HIST0PAQUE-1077 購自SIGMA，產(chǎn)品目錄號為 10771。
[0033]HIV-1P24抗原檢測試劑盒購自河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心。
[0034]QIAampDNAMiniKit購自德國QiaGen公司，產(chǎn)品目錄號為51306。
[0035]實施例中表 1 所示引物在參考文獻"YongjianLiu,LinLi,ShaominYang,Zuoyi Bao,HanpingLi，ZhengWang,DaominZhuang,SiyangLiu,LiliChen,YishanFan,Min Zhong，LiGao,XiaolinWang,andJingyunLi:IdentificationandCharacterization ofTwoNewHIVTypelUnique(B/C)RecombinantFormsinChina.AIDSResHum Retroviruses. 20llApr;27 (4) : 445-51. " 中公開過。
[0036]pNL4. 3 質(zhì)粒在文獻"WangC，MitsuyaY，GharizadehB，Ronaghi M，ShaferRW.Characterizationofmutationspectrawithultra-deep pyrosequencing:applicationtoHlV-ldrugresistance.GenomeRes.2007 ； 17 (8) : 1195-201.；HoffmannC,MinkahN,LeipzigJ,WangG,ArensMQ,TebasP,Bushman FD.NAbarcodingandpyrosequencingtoidentifyrareHIVdrugresistance mutations.NucleicAcidsRes. 2007 ;35 (13) :e91. "中公開過，公眾可從中國人民解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。PNL4. 3質(zhì)粒含有HIV-1B亞型野生株的全基因 組序列，轉(zhuǎn)染細胞并表達可以得到HIV-1B亞型野生株NL4-3。
[0037]Lipofectamine2000 購自Invitrogen公司。
[0038]NL4-3病毒由pNL4. 3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞表達獲得。該病毒的制備過程如下：用 DMEM培養(yǎng)基（含100IU/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素）重懸293T細胞，得到4X105個細 胞/ml的細胞懸液。將細胞懸液加入6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，在C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)24小 時，然后棄除上清，用PBS緩沖液洗絳兩次。按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，將質(zhì) 粒pNL4. 3轉(zhuǎn)染293T細胞，每孔轉(zhuǎn)染4微克pNL4. 3,在C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)36小時，收 集上清，將上清用HIV-1P24抗原檢測試劑盒進行P24抗原測定，結(jié)果為陽性，該上清即為 HIV-1B亞型野生株NL4-3病毒液，分裝后-80°C保存。
[0039]HIV-1B亞型參考毒株IIIB_LAI病毒在文獻"MontagnierLuc，Krust Bernard,ChamaretSolange,ClavelFrancois,ChermannJeanClaude,BarreSinoussi Francoise，A1izonMarc,SonigoPierre,StewartCole,DanosOlivier,Wain HobsonSimon:Envelopeantigensoflymphadenopathyassociatedvirusand theirapplications.PasteurInstitut，CentreNatRechScientNovember 20, 1986:EP0201540-A1. "中公開過，公眾可以從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流 行病研究所獲得。
[0040]HIV-lThai-B亞型參考毒株CNHN24 在文獻"WangZ,WangSX,LiuSY,Bao ZY,ZhuangDM,LiL,ZhangCH,ZhangL,LiJY,Lu:ImmunogenicitiesofEnv glycoproteinsfromcirculatingHIV-lisolatesinChinafocusingonthestrategy of"DNAprimeplusproteinboost".ChinMedJ(Engl). 20090ct5 ; 122 (19):2339-45?"中 公開過，公眾可以從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0041] 培養(yǎng)PBMCs所用的細胞培養(yǎng)液組成如下：含有體積百分含量10%的胎牛血清， lOOIU/ml青霉素，100iig/ml鏈霉素和lOIU/ml的白介素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0042] Reverse Transcriptase Assay, colorimetric 購自 Roche，產(chǎn)品目錄號為 11468120910。
[0043] 培養(yǎng)MT-4和H9細胞系所用的細胞培養(yǎng)液組成如下：含有體積百分含量為10%的 胎牛血清，100IU/ml青霉素，100iig/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0044] 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑齊多夫定（Zidovudine,AZT)購自SIGMA公司，產(chǎn)品目錄號為 A2169。
[0045] 蛋白酶抑制劑沙奎那韋（Saquinavir，SQV)購自上海迪賽諾生物醫(yī)藥有限公司。
[0046]MTT購自SIGMA公司，使用時用PBS配制成5mg/ml的溶液，0. 45um膜過濾備用。
[0047]HIV-13TC耐藥株在文獻"李玨，鮑作義，劉思揚，莊道民，李韓平，劉永建，李 林，楊坤，李敬云.HIV拉米夫定（3TC)耐藥毒株的體外誘導(dǎo)培育和鑒定.中華微生物和 免疫學(xué)雜志.2006 ;26 (3) : 220-223. "中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所獲得，該耐藥株的pol基因發(fā)生M184I突變，對拉米夫定（Lamivudine) (又名 3TC(2' -3'deoxy-3' -thiocytidine))的IC5(I 是 0? 018iig/ml，為HIV-lThai-B亞 型參考毒株CNHN24的113777倍。
[0048] MT-4 細胞（傳代人 T 淋巴細胞系）在文獻"Harada S, YamamotoN. Quantitative analysis of AIDS-related virus-carrying cells by plaque-forming assay using an HTLV-I-positive MT_4cell line. Jpn J Cancer Res. 1985Jun;76(6):432_5." 中公開 過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0049]H9細胞（HIV慢性感染T淋巴細胞系）在文獻"PyleSW1，BessJW，JrRobey WG,FischingerPJ,GildenRV,ArthurL0.Purificationof120000daltonenvelope glycoproteinfromculturefluidsofhumanimmunodeficiencyvirus(HIV)-infected H9cells.AIDSResHumRetroviruses. 1987;3(4):387_400?"中公開過，公眾可從中國人 民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。
[0050]人外周血單核細胞（Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)米自多人份 的HIV抗體陰性健康人，5iig/ml植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA)活化3天后使用， 用體積百分含量為10%的胎牛血清，l〇〇IU/ml青霉素，100yg/ml鏈霉素和10IU/ml的白介 素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)和傳代。
[0051] 實施例中的GX2005002和GX002是同一種病毒株，即保藏號為CGMCCNo. 8787的 病毒株。
[0052] 實施例1、GX002的分離、培養(yǎng)及全長基因組序列的測定
[0053] 一、高復(fù)制能力HIV-1CRF01_AE亞型毒株GX002的分離與傳代培養(yǎng)
[0054]( -）將中國廣西壯族自治區(qū)某艾滋病人體內(nèi)獲得的全血以250g離心8分鐘，使 血漿和血細胞分離，棄上層血漿，將下層的血細胞吸入50ml規(guī)格的離心管，加入與血漿等 體積的生理鹽水稀釋混勻，得到稀釋后的血細胞懸液；
[0055](二）向另一新的離心管中按體積比為1:1的比例緩慢先后加入分離液 HIST0PAQUE-1077和稀釋后的血細胞，加入稀釋后血細胞時用移液管靠壁緩慢加入，使稀釋 后的血細胞懸液和分離液之間形成明顯的分離液面；
[0056](三）將步驟（二）的離心管以400g離心30分鐘后，液面被分為顏色和濃度不同 的四層，所需的人外周血單核細胞（PBMCs)就在從上至下第二層的白色層中；
[0057](四）將最上面一層液面吸除，盡可能多地收集白色層中的細胞懸液進新的離心 管，用30ml的生理鹽水洗細胞三次，最后一次將分離出的病人體內(nèi)的PBMCs，用含體積百分 含量10%的胎牛血清（FBS)，100IU/ml的青霉素和100yg/ml的鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基 重懸至1〇6個細胞/ml，將其與分離于健康供血者血漿的人外周血單核細胞（PBMCs)按數(shù)量 比1:1的比例在6孔板中共培養(yǎng)28天，每7天取100ul細胞培養(yǎng)上清（從細胞培養(yǎng)板每孔 中吸取120ul細胞培養(yǎng)液（盡量少吸到底層的細胞）然后250g離心10分鐘）進行P24抗 原濃度檢測（以下P24抗原濃度的檢測均用HIV-1P24抗原檢測試劑盒測定），以觀察病毒 的生長情況，并用分離于健康供血者血液的人外周血單核細胞（PBMCs)替換孔中1/2原來 的細胞；
[0058](五）培養(yǎng)28天后，每孔吸取1ml培養(yǎng)上清接種于10ml規(guī)格細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7 天，測定其培養(yǎng)上清液中的P24抗原濃度，收取上清液，分裝入lml規(guī)格的凍存管，置于液氮 中凍存；
[0059](六）將凍存后的lml上清液接種于50ml規(guī)格細胞培養(yǎng)瓶中用含有體積 百分含量10 %的胎牛血清，l〇〇IU/ml青霉素，100yg/ml鏈霉素和10IU/ml的白介 素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，7天后測定培養(yǎng)上清液中的P24含 量，收取上清液，得到各分離株，分別分裝入lml規(guī)格的凍存管，置于液氮中凍存。
[0060] 二、高復(fù)制能力HIV-1CRF01_AE亞型毒株GX002的生長動力學(xué)曲線的制作 [0061]分別取含lngP24抗原的各病毒培養(yǎng)上清（經(jīng)步驟一分離和擴大培養(yǎng)后所得）， 將其稀釋于〇. 6ml細胞培養(yǎng)液（含有體積百分含量10%的胎牛血清，100IU/ml青霉素， 10〇1^/1111鏈霉素和10幾/1111的白介素-2(11^61'16111^11，11-2)的1^]\01640 培養(yǎng)基）中 接種于24孔板（預(yù)先在24孔板上設(shè)有每孔1. 8ml濃度為106個細胞/ml的健康供血者的 人外周血單核細胞（PBMCs)重懸液），連續(xù)培養(yǎng)18天，每48小時取100ill各病毒培養(yǎng)上 清液測定P24抗原濃度，再取lml的病毒培養(yǎng)上清液，高速離心富集病毒顆粒，用Reverse TranscriptaseAssay,colorimetric測定逆轉(zhuǎn)錄酶RT的濃度。以感染后時間為橫坐標(biāo)，分 別以P24抗原濃度和逆轉(zhuǎn)錄酶RT濃度為縱坐標(biāo)繪制生長動力學(xué)曲線，分別如圖1和圖2所 /_J、i〇
[0062] 圖 1 和圖 2 中，SD2010001、BJ2010002、GX2005002、⑶2005006、⑶2005003 分別代 表步驟一得到的各分離株、CNHN24代表HIV-lThai-B亞型參考毒株CNHN24，IIIB_LAI或IIIB代表HIV-1B亞型參考毒株IIIB_LAI病毒，NL4-3代表NL4-3病毒。
[0063] 并于每次取樣時補入1. 2ml培養(yǎng)基（含有體積百分含量10%的胎牛血清，100IU/ ml青霉素，l〇〇yg/ml鏈霉素和l〇IU/ml的白介素-2(Interleukin，IL-2)的RPMI1640 培 養(yǎng)基），在第7天和第14天取上清后用新鮮的健康供血者的人外周血單核細胞（PBMCs)更 換一半數(shù)量的孔中細胞，以維持細胞的生長狀態(tài)。
[0064] 上述實驗中，HIV-1B亞型參考毒株NL4-3和IIIB_LAI病毒，以及HIV-lThai-B亞 型參考毒株CNHN24均為對照。
[0065] 圖1表明，步驟一得到的各分離株中，GX2005002病毒的培養(yǎng)上清的P24抗原含量 的峰值最高，GX2005002病毒在PBMCs上培養(yǎng)18天后，GX2005002病毒的培養(yǎng)上清的P24 抗原含量的峰值（25440.OOpg/ml)為對照毒株NL4-3峰值（4208. 32pg/ml)的6. 05倍，為IIIB_LAI峰值（4093. 06pg/ml)的6. 22倍，CNHN24沒有成功感染，失去參考價值。
[0066] 圖2表明，步驟一得到的各分離株中，GX2005002病毒的培養(yǎng)上清的逆轉(zhuǎn)錄 酶RT含量的峰值最高，GX2005002病毒在PBMCs培養(yǎng)上清液中逆轉(zhuǎn)錄酶RT含量的峰值 (3390. 50pg/ml)為毒株IIIB_LAI峰值（803. 50pg/ml)的 4. 22 倍，為NL4-3 峰值（507. 5pg/ ml)的6. 68倍，CNHN24沒有成功感染細胞，失去參考價值。
[0067] 圖1和圖2表明，GX2005002病毒為的復(fù)制能力較常用的HIV-1B亞型參考毒 株NL4-3和IIIB_LAI病毒的復(fù)制能力強，通過分型發(fā)現(xiàn)該病毒屬于CRF01_AE亞型，所以 GX2005002是擁有較高復(fù)制能力的HIV-1CRF01_AE亞型臨床分離株。
[0068] 三、GX2005002全長基因組的擴增和測序
[0069] 用QIAampDNAMiniKit試劑盒從GX2005002病毒培養(yǎng)所用的PBMCs中提取前病 毒DNA，進行GX2005002毒株全長基因組測定。
[0070]HIV-1全長基因組的擴增策略是分別擴增GX2005002基因組的兩個半分 子-5'half?和3'half，兩者之間有約100bp的重疊區(qū)域用于連接。對提取所得的前病毒 DNA進行半套式PCR擴增，以得到包含病毒基因組兩端長末端重復(fù)序列（Longterminal repeat,LTR)在內(nèi)的全部基因組序列信息。
[0071] 具體步驟如下：
[0072] 第一輪反應(yīng)：
[0073]以前病毒DNA為模板，以U-LTR5-AE(SEQIDNo. 1)和 07Rev8(SEQIDNo. 2)為引 物進行PCR擴增，得到5'半分子第一輪PCR擴增產(chǎn)物（5219bp);
[0074]以前病毒DNA為模板，以 07For7(SEQIDNo. 3)和D-MluI-AE+BC(SEQIDNo. 4) 為引物進行PCR擴增，得到3'半分子第一輪PCR擴增產(chǎn)物（4817bp);
[0075] 第二輪反應(yīng)：
[0076] 以5'半分子第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，以U-LTR5-AE(SEQIDNo. 1)和 Revll(SEQIDNo. 5)為引物進行PCR擴增，得到5'半分子第二輪PCR擴增產(chǎn)物（5066bp);
[0077] 以3'半分子第一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，以VIF1(SEQIDNo. 6)和 D-MluI-AE+BC(SEQIDNo. 4)為引物進行PCR擴增，得到3'半分子第二輪PCR擴增產(chǎn)物 (4792bp)。
[0078] 5'半分子第二輪PCR擴增產(chǎn)物和3'半分子第二輪PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電 泳如圖3所示。圖3中第5泳道為5'半分子第二輪PCR擴增產(chǎn)物，長度約為5kb;第11泳 道為3'半分子第二輪PCR擴增產(chǎn)物，長度約為4. 8kb;Marker為DNA分子量標(biāo)準。
[0079] 將5'端半分子和3'端半分子的第二輪PCR擴增產(chǎn)物分別進行測序后，使用 ContigExpress軟件拼接序列片段，得到完整的GX2005002毒株全基因組序列，如SEQID No. 7所示。
[0080] 下述實施例中將GX2005002簡稱為GX002。
[0081] 表1HIV-1CRF01_AE亞型毒株GX002全長基因組序列擴增引物
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一株人類免疫缺陷病毒 I 型 CRF01_AE 亞型（Human Immunodeficiency Virus Type I subtype CRF01_AE)病毒，其保藏號為 CGMCC No.8787。
2. -種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要 求1所述的病毒。
3. -種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的方法，包括如下步驟： (1) 測定藥物對宿主細胞的半數(shù)中毒濃度，記作TC5(I ; (2) 測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統(tǒng)的抗病毒活性，得到藥物對病毒 HIV-1GX002的半數(shù)抑制濃度，記作IC5Q ; (3) 將步驟⑴得到的TC5(I和步驟⑵得到的IC5(I，帶入公式TI = TC5(I/IC5(I，計算得到 藥物的治療指數(shù)TI ; 所述宿主細胞/HIV-1GX002系統(tǒng)中所述HIV-1GX002可以在所述宿主細胞中進行復(fù) 制； 所述HIV-1GX002為權(quán)利要求1所述的病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主細胞為離體的人外周血單核細 胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步驟⑴的測定方法為MTT法； 所述步驟（2)中的IC5Q是通過測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統(tǒng)的抗病毒活性的 細胞病變效應(yīng)觀察法得到或通過檢測HIV-1P24抗原得到。
6. 權(quán)利要求1所述的病毒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的病毒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產(chǎn)品中 的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求2所述的試劑盒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產(chǎn) 品中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求2所述的試劑盒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1所述的病毒或權(quán)利要求2所述的試劑盒在制備篩選和/或評價藥物在 預(yù)防和/或治療HIV-1病毒引起的疾病的效果的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/93GK104328091SQ201410549312
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】韓婧婉, 劉思揚, 莊道民, 李韓平, 梁淑家, 李敬云 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心