一種結(jié)合常壓室溫等離子體誘變方式高通量篩選重組酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌宿主的方法
【專利摘要】本發(fā)明闡述了一種新型結(jié)合誘變與高通量篩選高產(chǎn)重組酶菌株的方法，屬于基因工程、酶學(xué)及發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。采用ARTP誘變技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600宿主進(jìn)行誘變，利用篩選平板初篩、96孔板高通量復(fù)篩、搖瓶發(fā)酵篩選驗(yàn)證的方式獲得一株高產(chǎn)重組酶的突變株。以堿性淀粉酶為篩選模式酶，高通量篩選出產(chǎn)酶酶活力較高的突變株B.subtilis WB600-mutl2，發(fā)酵得酶活力為186.4U/mL，為出發(fā)株酶活的130.3％。過(guò)氧化氫酶在B.subtilis WB600-mut12中異源表達(dá)后，酶活力提高至出發(fā)宿主酶活的135.0％。該發(fā)明具有重要的實(shí)用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種結(jié)合常壓室溫等離子體誘變方式高通量篩選重組酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌宿主的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程、酶學(xué)以及發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及結(jié)合ARTP誘變技術(shù)和高通量篩選一株高產(chǎn)重組酶B.subtilis菌株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌是一種簡(jiǎn)單的革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽孢，遺傳學(xué)特性研究較為清楚。此夕卜，由于具有非致病性、易于發(fā)酵和具有較強(qiáng)的蛋白分泌和生產(chǎn)能力等優(yōu)點(diǎn)，是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)外源蛋白的理想宿主。
[0003]工業(yè)酶制劑作為生物催化的中心，在大宗生化品的生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用。常用的工業(yè)酶制劑可以基本分為二類:一類是水解酶類，包括淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、乳糖酶等，占市場(chǎng)銷售額的75%以上，目前約有60%以上的酶制劑已用基因改良菌株生產(chǎn)；第二類為水解酶，占市場(chǎng)銷售額10%左右，并有逐年增加的趨勢(shì)，主要為分析試劑用酶和醫(yī)藥工業(yè)用酶。在食品供應(yīng)站，淀粉加工所以的酶仍然占最大比例，為15%;其次是乳制品工業(yè)，占14%。工業(yè)酶廣泛應(yīng)用于食品、紡織、制革等工業(yè)及環(huán)境保護(hù)，因此工業(yè)酶制劑產(chǎn)量的提高有助于實(shí)現(xiàn)更大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]近幾年，利用ARTP誘變篩選突變菌株的技術(shù)發(fā)展比較迅速，已成為相當(dāng)活躍的一個(gè)交叉學(xué)科研究領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的誘變技術(shù)及其他的等離子體技術(shù)相比，ARTP生物誘變具有多種優(yōu)點(diǎn):在常壓下可以產(chǎn)生多種分布均勻的高活性粒子，能瞬時(shí)作用于微生物使其產(chǎn)生致畸突變；采用低壓射頻，有較高的安全性；產(chǎn)生的等離子體溫度接近室溫，可以避免溫度過(guò)高對(duì)微生物造成的熱損傷；另外，ARTP設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)易、運(yùn)行成本較低。目前獲得重組酶高產(chǎn)菌株的方法主要有:從自然界中篩選、利用傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法誘變、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化及構(gòu)建重組菌等。因此，可以嘗試結(jié)合ARTP誘變技術(shù)及96孔板高通量篩選獲得重組酶高產(chǎn)菌株，解決當(dāng)前工業(yè)酶產(chǎn)量偏低的現(xiàn)狀。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于ARTP誘變技術(shù)和高通量篩選高產(chǎn)重組蛋白
B.subtilis宿主的方法，有效提高重組酶酶活(本專利以堿性淀粉酶為篩選模式酶，以過(guò)氧化氫酶為宿主驗(yàn)證酶)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將出發(fā)株B.subtilis WB600經(jīng)等離子體誘變后，將堿性淀粉酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化B.subtilis WB600突變庫(kù)，利用淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板進(jìn)行篩選，基于透明圈大小比對(duì)進(jìn)行初篩，然后采用96孔板進(jìn)行高通量復(fù)篩，將篩選獲得高產(chǎn)重組堿性淀粉酶的菌株采用搖瓶培養(yǎng)再進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證，最終獲得重組堿性淀粉酶高產(chǎn)菌株。
[0007]其具體步驟如下:
[0008]I)出發(fā)株活化:將B.subtilis WB600進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑單菌落于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)8?12h后，再轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，進(jìn)行同步培養(yǎng)；
[0009]2) ARTP誘變處理:用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體，加生理鹽水重懸菌體，稀釋菌體濃度至16?8個(gè)/mL，吸5?15 μ L均勻涂于載片上，置于處理源下，進(jìn)行誘變處理；
[0010]3)后培養(yǎng):將誘變處理過(guò)的菌液(連同載片一起)，立即放入新鮮的LB培養(yǎng)基中，經(jīng)2?3h后培養(yǎng)，稀釋菌體濃度至15?7個(gè)/mL，涂布于新鮮LB平板上培養(yǎng)；
[0011]4)重組酶高產(chǎn)菌株篩選:將含有重組酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟3)中誘變獲得的突變體文庫(kù)，得到含有重組酶質(zhì)粒的B.subtilis WB600突變體文庫(kù)；將文庫(kù)中的突變體轉(zhuǎn)接于淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板上，培養(yǎng)后觀察透明圈的大小，篩選菌落小透明圈大的突變株；進(jìn)一步進(jìn)行96孔板高通量篩選，最終通過(guò)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。
[0012]以上所述的菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2?6次，然后再重懸于生理鹽水中，制得菌懸液(OD6tltl約為1.5?4.5);適當(dāng)稀釋OD6tltl在1.0?3.0之間，以免重疊效應(yīng)影響誘變的均勻性。步驟2)中ARTP誘變處理的參數(shù)設(shè)置為:氣流量6?14slm、射頻功率60?140W、時(shí)間20?40s、距處理源距離2mm。等離子體誘變后進(jìn)行2?3h后培養(yǎng)，使DNA損傷在SOS修復(fù)中得到突變，并使突變更加穩(wěn)定。
[0013]在上述篩選方法中，通過(guò)后培養(yǎng)涂布平板得到突變體文庫(kù)。將含有堿性淀粉酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化突變體文庫(kù)，獲得含有堿性淀粉酶重組質(zhì)粒的B.subtilis WB600突變體文庫(kù)。將突變體轉(zhuǎn)移至淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板進(jìn)行篩選，通過(guò)透明圈的大小篩選高產(chǎn)重組酶突變株，然后進(jìn)行96孔板高通量復(fù)篩，獲得少量(〈20個(gè))高產(chǎn)突變體，最后采用搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證高產(chǎn)菌株。所用的淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分為:可溶性淀粉0.5?1.5%、臺(tái)盼藍(lán) 0.02 ?0.08%、NaCl 0.5 ?1.5 %、Yeast Extract 0.2 ?0.8%、Tryptone 0.5 ?
2.0%、瓊脂 1.0 ?2.5%。
[0014]種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)8?12h后，按0.5?3.0%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。高通量篩選采用96孔板，每孔裝液量500?1000 μ L，所用發(fā)酵培養(yǎng)基其成分及配制步驟為:先配磷酸緩沖液，稱取1.5?3.0g KH2PO4和10.0?15.0g K2HPO4，定容至 10OmT, ；Yeast Extract 18.0 ?30.0g、Tryptone 8.0 ?16.0g,甘油 2.0 ?6.0mT,,溶于900mL水中；滅菌，待磷酸緩沖液冷卻至60°C左右時(shí)，加入900mL培養(yǎng)基中，搖勻，待用。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:可溶性淀粉0.2?0.8%、大豆蛋白胨0.5?2.5%,NaCl 0.5?1.5%、豆餅粉1.0?2.0%，裝液量為15?80mL/250mL，發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48?72h。用DNS法測(cè)定堿性淀粉酶酶活。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板初篩透明圈
[0016]圖2 96孔板高通量篩選結(jié)果
[0017]圖3 12號(hào)和20號(hào)突變菌株搖瓶驗(yàn)證結(jié)果

【具體實(shí)施方式】
[0018]為了對(duì)本發(fā)明有更深入的了解，現(xiàn)結(jié)合具體的應(yīng)用實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0019]實(shí)施例1:利用常壓室溫等離子誘變方式對(duì)B.subtilis WB600進(jìn)行誘變
[0020]將出發(fā)株B.subtilis WB600在LB平板進(jìn)行活化培養(yǎng)，挑取單菌落于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37°C，裝液量為250mL三角瓶裝20mL培養(yǎng)基，卡那霉素的工作濃度為50 μ g/mL,轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間1h ;按50%的接種量轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，2?3h后待菌體處于同步對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，吸取ImL菌液，離心后用無(wú)菌生理鹽水洗滌3?5次，適當(dāng)稀釋至細(xì)胞濃度OD6tltl = 1.5?2.0 ;吸取10 μ L菌液均勻涂在滅菌冷卻后的載片上；以He為工作氣體，射頻功率為100W，氣體流量lOslm，處理時(shí)間30s。
[0021]對(duì)等離子體誘變后的菌體進(jìn)行后培養(yǎng)操作，將處理過(guò)的菌(連同載片)，立即放入5mL裝有新鮮LB液體培養(yǎng)基的離心管中，裝液量為lmL，封口膜封口，充分震蕩后于37°C，200rpm,后培養(yǎng)2?3h，使DNA在SOS修復(fù)中產(chǎn)生種類豐富的突變位點(diǎn)，并使突變穩(wěn)定遺傳。
[0022]實(shí)施例2:誘變后堿性淀粉酶高產(chǎn)菌株的篩選
[0023](I)淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板初篩
[0024]將后培養(yǎng)的菌液梯度稀釋至10_4，每個(gè)梯度分別涂?jī)蓚€(gè)LB平板，37°C培養(yǎng)12h得到的突變體文庫(kù)，將含有堿性淀粉酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化突變體文庫(kù)，得到含有堿性淀粉酶重組質(zhì)粒的B.subtilis WB600文庫(kù)，用無(wú)菌牙簽逐個(gè)點(diǎn)種淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板，37°C培養(yǎng)8?10h，挑選出透明圈大于出發(fā)菌的菌落(圖1)。
[0025](2) 96孔板高通量篩選
[0026]將上一步驟挑選出來(lái)的菌落分別接于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行96孔板高通量篩選，每株做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，在37°C下，發(fā)酵48h，測(cè)定酶活，酶活測(cè)定結(jié)果如圖2。其中，12號(hào)和20號(hào)酶活產(chǎn)量提高最為顯著，分別提高至出發(fā)菌株的130.0%和121.0%。
[0027](3)搖瓶發(fā)酵篩選驗(yàn)證
[0028]將高通量篩選得到的12號(hào)和20號(hào)菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，200rpm，培養(yǎng)12h，按2%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量30mL，發(fā)酵溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵60h后，取樣離心后，用DNS法測(cè)酶活。結(jié)果顯示，搖瓶結(jié)果與96孔板復(fù)篩結(jié)果相似，12號(hào)突變株(12#)酶活提高至出發(fā)株(ck)的130.3%，酶活達(dá)到186.4U/mL(圖3)。
[0029]實(shí)施例3:過(guò)氧化氫酶在誘變宿主B.subtilis WB600_mutl2中的過(guò)量表達(dá)
[0030]將含有堿性淀粉酶重組質(zhì)粒的B.subtilis WB600_mutl2宿主，采用培養(yǎng)基中添加SDS至其最終濃度為0.002?0.005%的方法消除質(zhì)粒，獲得不含有重組質(zhì)粒的B.subtilisWB600-mutl2宿主。將已構(gòu)建好的過(guò)氧化氫酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化已消除質(zhì)粒的B.subtilisWB600-mutl2宿主，獲得可表達(dá)重組過(guò)氧化氫酶的重組菌。發(fā)酵后測(cè)定酶活，結(jié)果顯示，誘變后的B.subtilis WB600-mutl2較出發(fā)宿主產(chǎn)過(guò)氧化氫酶能力提高至135.0%。
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合常壓室溫等離子(ARTP)誘變方式高通量篩選高產(chǎn)重組酶(如堿性淀粉酶)B.subtilis突變株的方法，其特征為: 1)出發(fā)菌活化:將B.subtilis WB600進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑單菌落于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)8?20h后，轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，進(jìn)行同步培養(yǎng)； 2)ARTP誘變處理:用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體后再重懸菌體，適當(dāng)稀釋菌體濃度至106?8個(gè)/mL，吸5?15 μ L均勻涂于載片上，置于處理源下，進(jìn)行誘變處理； 3)后培養(yǎng):誘變處理過(guò)的菌液，立即放入新鮮的LB培養(yǎng)基中，后培養(yǎng)2?3h后，適當(dāng)稀釋菌體濃度為105?7個(gè)/mL，涂布于新鮮的LB平板上培養(yǎng)； 4)重組酶高產(chǎn)菌株篩選:將含有重組酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟3)中誘變獲得突變體文庫(kù)，得到含有重組酶重組質(zhì)粒的B.subtilis WB600突變體文庫(kù)；將文庫(kù)中的突變體逐個(gè)點(diǎn)種于篩選平板(對(duì)于該專利中突變宿主篩選采用的重組堿性淀粉酶，其篩選平板為淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板)上，培養(yǎng)8?12h后觀察透明圈大小，菌落小透明圈大的可能為高產(chǎn)堿性淀粉酶突變株；縮小篩選范圍后，進(jìn)行96孔板高通量篩選，最終進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證高產(chǎn)菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產(chǎn)B.subtilis突變株的方法，其特征在于所述的2)中用無(wú)菌生理鹽水洗滌2?6次，重懸制備菌懸液(0D_約為15?45);適當(dāng)稀釋0D_在1.0?3.0之間，不致重疊效應(yīng)影響誘變處理的均勻性；處理參數(shù)設(shè)置為:氣流量6?14slm、射頻功率60?140W、時(shí)間20?40s、距處理源距離2?3mm ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產(chǎn)B.subtilis突變株的方法，其特征在于:所述3)中，進(jìn)行2?3h后培養(yǎng)，使突變中伴隨產(chǎn)生的DNA損傷獲得修復(fù)，并使突變更加穩(wěn)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產(chǎn)B.subtilis突變株的方法，該專利中突變宿主篩選采用重組堿性淀粉酶作為模式酶，其特征在于:轉(zhuǎn)化得到含有堿性淀粉酶重組質(zhì)粒的B.subtilis WB600突變體文庫(kù)，根據(jù)淀粉-臺(tái)盼藍(lán)營(yíng)養(yǎng)平板周圍透明圈大小得到高產(chǎn)突變株，所用的培養(yǎng)基成分為:可溶性淀粉0.5?1.5%、臺(tái)盼藍(lán)0.02 ?0.08%、NaCl 0.5 ?1.5%、Yeast Extract 0.2 ?0.8%、Tryptone0.5 ?2.0%、瓊脂1.ο?2.5%，酶活測(cè)定方法選用DNS法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合ARTP誘變和高通量篩選重組酶高產(chǎn)B.subtilis突變株的方法，其特征在于:利用96孔板進(jìn)行文庫(kù)中高產(chǎn)突變體的高通量篩選，所用發(fā)酵培養(yǎng)基成分及配制步驟為:先配磷酸緩沖液，分別稱取1.5?3.0g KH2P0jP 10.0?15.0g Κ2ΗΡ04，定容至 100mL ;Yeast Extract 18.0 ?30.0g、Tryptone 8.0 ?16.0g,甘油 2.0 ?6.0mL,溶于900mL水中；滅菌，待磷酸緩沖液冷卻至60°C左右時(shí)，加入900mL培養(yǎng)基中，搖勻，待用。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK104371994SQ201410550898
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】楊海泉, 馬櫻芳, 宋江寧, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 沈微, 陳獻(xiàn)忠, 樊游, 劉龍 申請(qǐng)人:江南大學(xué)