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      一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量pcr檢測方法

      文檔序號:490927閱讀:211來源:國知局
      一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量pcr檢測方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法,本發(fā)明方法步驟包括魚源無乳鏈球菌DNA的提取、引物設(shè)計、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的制備、熒光定量PCR退火溫度的優(yōu)化、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、敏感性和特異性檢測。本發(fā)明可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測出水產(chǎn)養(yǎng)殖動物感染無乳鏈球菌,靈敏度可達(dá)8.6細(xì)菌基因組拷貝/μL,對魚類無乳鏈球菌病的預(yù)防有重大意義。
      【專利說明】-種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于細(xì)菌檢測【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢 測方法。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae),也稱B族鏈球菌,是兼性的革蘭氏陽 性球菌,是一種重要的人、獸及魚共患病致病菌。魚源無乳鏈球菌可引起魚類敗血癥和腦膜 炎,具有較高的致病率和致死率?,F(xiàn)有的魚源無乳鏈球菌的檢測方法主要有常規(guī)的細(xì)菌分 離培養(yǎng)鑒定法、普通PCR檢測法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測法等。細(xì)菌分離培養(yǎng)方 法存在耗時和受樣品污染等諸多因素的影響;普通PCR既無法對病原定量,又需要凝膠電 泳,容易對環(huán)境造成污染;LAMP法雖然靈敏性高,但不能對病原進(jìn)行定量;而熒光定量PCR 技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入可嵌入雙鏈DNA的熒光燃料,利用相應(yīng)軟件實時監(jiān)測整個 PCR進(jìn)程中的熒光信號積累情況,對未知模板可進(jìn)行定性和定量分析,該方法可實時檢測、 速度快、高通量、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好、自動化程度高,在病原微生物檢測方面已 得到廣泛應(yīng)用,目前,尚無熒光定量PCR方法用于檢測魚源無乳鏈球菌的相關(guān)報道。近年 來,魚類無乳鏈球菌病大面積爆發(fā)流行,該病缺乏有效的治療方法,防止無乳鏈球菌的傳染 和流行是當(dāng)前采取的主要措施,早期快速檢測該病原是減少損失的有效途徑,熒光定量PCR 技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動物無乳鏈球菌的檢測,對于疾病的預(yù)防意義重大。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0003] 為解決【背景技術(shù)】中的檢測臨床樣品中魚源無乳鏈球菌的問題,本發(fā)明提供一種魚 源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法,該方法可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測出水 產(chǎn)養(yǎng)殖動物感染無乳鏈球菌,為防止魚源無乳鏈球菌的傳染和流行提供技術(shù)支持。
      [0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:
      [0005] (1)取患病魚的組織50?lOOmg,稱重后,放入組織勻漿器中研磨,加入1000 μ L TE緩沖液,制成組織勻漿液。取組織勻漿液180 μ L,加入20 μ L濃度為50mg/mL的溶菌酶, 30°C孵育IOmin ;后續(xù)的提取步驟按照細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行,即得到高純度細(xì) 菌基因組DNA,保存于-20°C備用。
      [0006] (2)根據(jù)GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S rRNA基因間區(qū)序列,設(shè)計一對特 異性引物,序列如下:
      [0007] 上游引物151?-8:5'66六六六0^60^1'11^〇61'(:1'-3';
      [0008] 下游引物 ISR-a:5' AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3'。
      [0009] (3)使用上述特異性引物擴(kuò)增出大小為190bp的片段;通過連接、轉(zhuǎn)化將該片段插 入pMD? 18-T載體;最后對pMD? 18-T重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
      [0010] (4)提取經(jīng)過測序鑒定正確的重組質(zhì)粒,應(yīng)用Thermo NanoDrop 2000進(jìn)行質(zhì)粒濃 度檢測,計算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù),將質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋法稀釋成6. 04X IO8?6. 04X IO1 拷貝/ μ L的8個濃度梯度,將其作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板。
      [0011] (5)將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板,構(gòu)建反應(yīng)體系,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,獲得擴(kuò)增曲線 和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
      [0012] (6)將已經(jīng)計算出拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,選取6. 04Χ IO4? 6. 04X KT1拷貝/ μ L的6個濃度梯度,進(jìn)行熒光定量PCR檢測,以此確定熒光定量PCR所 能檢測的最低模板拷貝數(shù),驗證本發(fā)明方法的靈敏性。
      [0013] (7)分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿菌、 螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健康 斑點叉尾鮰的DNA,以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,驗證本發(fā)明方法的特 異性。
      [0014] 其中本發(fā)明所述步驟5-7中,所述的熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:總反應(yīng)體積 20 μ L,其中 SYBR Green I PCR Master Mix 預(yù)混液(2X) 10 μ L、10y M 上、下游引物各 〇. 5 μ L、模板DNA I. 0 μ L、無菌水8. 0 μ L ;反應(yīng)程序為:預(yù)變性94°C,lmin,1個循環(huán);隨后 進(jìn)行40個循環(huán),程序為94°C,30sec,退火60. 4°C,20sec,延伸72°C,20sec,同時設(shè)溶解曲線 反應(yīng)參數(shù)為 94,15sec,60°C,30sec,94,15sec。
      [0015] 其中本發(fā)明中Ct值與質(zhì)??截悢?shù)的對數(shù)之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2 =0· 990,截距為36. 28,斜率為-3. 195,擴(kuò)增效率E = 106. 0%,從而可以算出拷貝數(shù)X與Ct 值之間的線性關(guān)系方程式:Ct =-3. 1951ogX+36. 28,而待測樣品的Ct值可以從實驗結(jié)果中 直接讀取;把待測樣品的Ct值代入方程式就可以算出無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)(X)。由 于無乳鏈球菌的基因組內(nèi)含有7個拷貝的ISR序列,則樣品中的無乳鏈球菌基因組拷貝數(shù) =X/7。
      [0016] 其中在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析,擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度為90. 8-91. 2°C,無非 特異性產(chǎn)物和引物二聚體的峰值出血標(biāo)準(zhǔn)品均一穩(wěn)定。
      [0017] 其中分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿 菌、螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健 康斑點叉尾鮰的DNA,以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。無乳鏈球菌感染 的羅非魚DNA模板出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線,而其他樣品均未出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增曲線,同時將擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果與上述一致,表明該方法具有較好的特異性。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0018] 圖1不同退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果,圖上部分顯示不同退火溫度所對應(yīng)Ct值,圖下 部分為不同退火溫度下產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
      [0019] 圖2不同稀釋濃度的陽性質(zhì)粒為模板的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。從左到右各條 曲線代表 6· 04X 1086· 04X 107、6· 04X 106、6· 04X 105、6· 04X 104、6· 04X 103、6· 04X 102、 6. 04X IO1質(zhì)??截悢?shù)/ μ L擴(kuò)增曲線。
      [0020] 圖3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果,回歸方程Ct = -3. 1951ogX+36.28,相關(guān)系數(shù)R2 =0· 990,擴(kuò)增效率 E = 106. 0%。
      [0021] 圖4擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線分析,溶解溫度在90. 8-91. 2°C之間。
      [0022] 圖5熒光定量PCR特異性檢測。以不同樣品的DNA模板,按照構(gòu)建的熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。泳道M,DL2000marker ;泳道1,無乳鏈 球菌感染的羅非魚DNA ;泳道2,海豚鏈球菌DNA ;泳道3,金黃色葡萄球菌DNA ;泳道4,海分 枝桿菌DNA ;泳道5,螄魚諾卡氏菌DNA ;泳道6,遲緩愛德華氏菌DNA ;泳道7,哈維弧菌DNA ; 泳道8,美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種DNA ;泳道9,斑點叉尾鮰DNA ;泳道10,羅非魚DNA ;泳道 11,人DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
      [0023] 圖6熒光定量PCR方法檢測感染無乳鏈球菌的羅非魚樣品。橫坐標(biāo)代表用于感染 羅非魚的不同無乳鏈球菌菌株;縱坐標(biāo)代表攻毒14天后,羅非魚腦組織內(nèi)的無乳鏈球菌基 因組DNA載量。

      【具體實施方式】
      [0024] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
      [0025] 實施例一熒光定量PCR檢測無乳鏈球菌方法的建立
      [0026] 1.樣品基因組DNA提取
      [0027] (1)魚(包括魚體內(nèi)細(xì)菌)基因組DNA提取:取魚的組織50?lOOmg,稱重后,放入 組織織勻漿器中研磨,加入1000 μ LTE緩沖液,制成組織勻漿液。取組織勻漿液180 μ L,加 入20 μ L濃度為50mg/mL的溶菌酶,30°C孵育IOmin ;后續(xù)的提取步驟按照OMEGABacterial DNAKit細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行,即得到高純度的魚(魚包括體內(nèi)細(xì)菌)基因組 DNA,保存于-20°C備用。其中OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒(OMEGA公司)購于廣州飛 揚(yáng)生物工程有限公司。
      [0028] (2)細(xì)菌基因組DNA提取:分別培養(yǎng)無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、 海分枝桿菌、螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種,按照 OMEGA Bacterial DNA Kit細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行,得到高純度的細(xì)菌基因組 DNA,保存于-20°C備用。
      [0029] 2.引物設(shè)計與合成
      [0030] 根據(jù)GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S rRNA基因間區(qū)序列(ISR),通過 Primer Premier 6.0軟件設(shè)計的,并按照本領(lǐng)域常規(guī)方法合成。引物序列如下:
      [0031] 上游引物151?-8:5'-66六六六0^60^1'11^〇61'(:1'-3';
      [0032] 下游引物 ISR-a:5' -AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3'。
      [0033] 其中ISR-s/a預(yù)期片段為190bp。
      [0034] 3.標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備:
      [0035] 以上述提取的無乳鏈球菌基因組DNA為模板,使用上述設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增出 大小為190bp的片段;通過連接、轉(zhuǎn)化將該片段插入pMD? 18-T載體;最后對pMD? 18-T重 組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定,命名為pMD? 18-T-ISR。
      [0036] 陽性質(zhì)粒(pMD? 18-T-ISR),交上海生工生物工程公司測序鑒定。用細(xì)菌質(zhì)粒 DNA小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA,用Thermo NanoDrop 2000檢測質(zhì)粒濃度,此質(zhì)粒溶液即為本 發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品模板。
      [0037] 根據(jù)阿伏加德羅常數(shù)、堿基的平均分子量、重組質(zhì)粒的長度及濃度計算單位體積 質(zhì)粒溶液內(nèi)的拷貝數(shù)。其計算公式如下:每μ L質(zhì)粒溶液的拷貝數(shù)=[質(zhì)粒濃度(g/μ L) X 阿伏伽德羅常數(shù)]/[重組質(zhì)粒分子量Χ660]。
      [0038] 經(jīng)計算得pMD? 18-T-ISR濃度為6. 04X 101°拷貝/ μ L,將質(zhì)粒稀釋成: 6. 04X 108、6. 04X 107、6. 04X 106、6. 04X 105、6. 04X 104、6. 04X 103、6. 04X 102、6. 04X IO1 拷貝/ μ L的濃度,于-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0039] 4.熒光定量PCR反應(yīng)條件及其優(yōu)化
      [0040] 反應(yīng)體系(20 μ L)為:SYBR Green I PCR Master Mix 預(yù)混液(2 X) 10 μ UlOyM 上、下游引物各0.5 μ L、模板DNA 1.0 μ L、無菌水8.0 μ L。本申請實施例中實際使用SYBR Green I PCR Master Mix預(yù)混液(2X) (Τ0Υ0Β0公司)購自廣州美津生物技術(shù)有限公司; 所使用引物為上述設(shè)計的特異性引物。
      [0041] 退火條件優(yōu)化:預(yù)變性94°C,lmin,1個循環(huán);隨后進(jìn)行40個循環(huán),程序為94°C, 30sec,退火55. 0?64. 9°C,20sec,延伸72°C,20sec,同時設(shè)溶解曲線反應(yīng)參數(shù)為94, 15sec,60 °C,30sec,94,15sec。本申請實施例中實際使用 Eppendorf 公司的 Eppendorf Mastercycler ep realplex型突光定量PCR儀記錄結(jié)果。
      [0042] 最佳退火溫度的確定:以實施例1中提取的無乳鏈球菌DNA為模板,按照上述反 應(yīng)體系和反應(yīng)條件,比較不同退火溫度下的擴(kuò)增產(chǎn)物所對應(yīng)Ct值,結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 果,確定熒光定量PCR的最佳退火溫度。反應(yīng)的最佳退火溫度為60. 4°C (如附圖1)。
      [0043] 5.方法學(xué)評價
      [0044] (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作·
      [0045] 將上述已定量的標(biāo)準(zhǔn)品(重組質(zhì)粒)以10倍的倍比關(guān)系作一系列稀釋,以 不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,分別取LOyL按照上面的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn) 行熒光定量PCR,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如附圖2)。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Ct =-3. 1951ogX+36.28,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.990,擴(kuò)增效率E = 106.0%,用陽性質(zhì)粒所作 的標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值與初始濃度有較好的線性關(guān)系(如附圖3),標(biāo)準(zhǔn)品的溶解溫度都在 90. 8-91. 2°C之間(如附圖4)。
      [0046] (2)靈敏度測試
      [0047] 將已定量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10 倍稀釋為 6. 04X 104、6. 04X 103、6. 04X 102、6. 04X 101、 6. 04X 10°、6. 04X KT1拷貝/ μ L,用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測,以此確定檢測的靈 敏度。結(jié)果顯示,當(dāng)重組質(zhì)粒濃度為60. 4拷貝/ μ L,即8. 6無乳鏈球菌基因組拷貝/ μ L 時,仍能夠獲得擴(kuò)增曲線和特異的溶解曲線。
      [0048] (3)特異性驗證
      [0049] 為了 了解該方法的特異性,選用無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡 萄球菌、海分枝桿菌、螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞 種、健康羅非魚和健康斑點叉尾鮰的DNA,以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò) 增。在所檢測的樣品中,僅無乳鏈球菌感染的羅非魚DNA樣品結(jié)果為陽性,而其他樣品的檢 測結(jié)果均為陰性。同時將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果與上述一致(如附圖5)。 表明建立的熒光定量PCR方法不會受這些水產(chǎn)動物病原菌的及宿主的干擾,也不會受操作 過程中人的DNA的干擾。
      [0050] (4)熒光定量PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性測試
      [0051] 在評價熒光定量PCR檢測無乳鏈球菌方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,用陽性樣品和陰性 樣品,按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,反復(fù)進(jìn)行熒光定量PCR檢測,每次試驗的每個樣品做 8個平行反應(yīng)管,重復(fù)6次,結(jié)果表明所建立的熒光定量PCR檢測方法具有很好的穩(wěn)定性和 重復(fù)性。
      [0052] (5)樣品中的無乳鏈球菌定量
      [0053] 待測樣品的Ct值可以在熒光定量PCR儀中直接讀取,把待測樣品的Ct值代入到 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式可以算出無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)(X)。由于無乳鏈球菌的基因組 內(nèi)含有7個拷貝的ISR序列,則最終樣品中的無乳鏈球菌拷貝數(shù)=X/7。
      [0054] 實施例二用本發(fā)明建立的熒光定量PCR方法檢測樣品
      [0055] 選取10株不同毒力的無乳鏈球菌感染羅非魚,攻毒后第14天采集樣品。
      [0056] 1.分離培養(yǎng)法
      [0057] 將樣品接種于血瓊脂平板上,置28°C培養(yǎng)24_48h,觀察菌落,如見形成灰白色、表 面光滑、有乳光、圓形、β溶血的菌落,則進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,發(fā)現(xiàn)單個、成雙、鏈狀排列、 長短不一,呈紫色的球菌。
      [0058] 2.熒光定量PCR法
      [0059] (1)樣品DNA提取
      [0060] 將樣品稱重后,放入組織織勻漿器中研磨,加入1000 μ LTE緩沖液,制成組織勻漿 液。取組織勻漿液180 μ L,加入20 μ L濃度為50mg/mL的溶菌酶,30°C孵育IOmin ;后續(xù)的 提取步驟按照OMEGA Bacterial DNA Kit細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行,即得到高純 度的魚(魚包括體內(nèi)細(xì)菌)基因組DNA。
      [0061] (2)熒光定量PCR反應(yīng)
      [0062] 將一系列不同稀釋濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和提取的樣品DNA作為模板,進(jìn)行熒光 定量PCR檢測,同時設(shè)陰性對照。反應(yīng)體系(20 μ L)為:SYBR Green I PCR Master Mix預(yù) 混液(2X) IOyLUO μ M上、下游引物各0.5 μ L、模板DNA 1.0 μ L、無菌水8.0 μ L。放入 Eppendorf Mastercycler ep realplex 型突光定量 PCR 儀。反應(yīng)條件:預(yù)變性 94°C,lmin, 1個循環(huán);隨后進(jìn)行40個循環(huán),程序為94°C,30sec,退火60. 4°C,20sec,延伸72°C,20sec, 同時設(shè)溶解曲線反應(yīng)參數(shù)為94,15sec,60°C,30sec,94,15sec。反應(yīng)結(jié)束后利用熒光定量 PCR軟件分析。
      [0063] (3)結(jié)果計算
      [0064] 各擴(kuò)增曲線與閾值線的交叉點對應(yīng)的橫坐標(biāo)即為Ct值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上濃度與 Ct值的對應(yīng)關(guān)系,可求出各待測樣品中無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)(X),則最終樣品中的無 乳鏈球菌拷貝數(shù)=X/7。
      [0065] (4)數(shù)據(jù)分析
      [0066] 采樣EXCLE軟件包,培養(yǎng)法和所建立的熒光定量PCR方法對樣品檢測結(jié)果陽性率 的比較采樣X2檢驗。
      [0067] 應(yīng)用所建立的熒光定量PCR方法和培養(yǎng)法對人工感染無乳鏈球菌的羅非魚30個 樣品進(jìn)行檢測,經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),這兩種方法有顯著性差異(P < 0. 05)。熒光定量PCR陽性 檢出率(100% )明顯高于培養(yǎng)法(76. 7% )。此外,熒光定量PCR還可對樣品中無乳鏈球菌 進(jìn)行定量分析(圖5),判定無乳鏈球菌在魚體內(nèi)的定植情況。
      [0068] 綜上所述,本發(fā)明的有益效果是:基于重組質(zhì)粒pMD? 18-T-ISR所建立的魚源無 乳鏈球菌實時定量PCR檢測方法具有檢測速度快(2個小時左右)、操作簡便、結(jié)果可靠等特 點,該方法具有較好的敏感性和特異性,不僅可提高檢出率,還能定量出患病魚的無乳鏈球 菌的DNA載量,與傳統(tǒng)方法相比,明顯優(yōu)于培養(yǎng)法。
      【權(quán)利要求】
      1. 一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法,其特征在于其檢測方法的具體步驟 如下: (1) 提取魚組織內(nèi)的無乳鏈球菌DNA,制備檢測液。 (2) 引物設(shè)計:根據(jù)GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S rRNA基因間區(qū)序列,通過 Primer Premier6. O軟件設(shè)計相應(yīng)的特異性引物,序列如下: 上游引物 I SR-s : 5,-GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3,; 下游引物 I SR-a : 5 ' -AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3 '。 (3) 標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備:使用上述特異性引物擴(kuò)增出大小為190bp的片段;通過連接、 轉(zhuǎn)化將該片段插入pMD?18-T載體;最后對pMD?18-T重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。提取經(jīng)過 測序鑒定重組質(zhì)粒,進(jìn)行質(zhì)粒濃度檢測,計算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù),將質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋 法稀釋成 6· 04X 108、6· 04X 107、6· 04X 106、6· 04X 105、6· 04X 104、6· 04X 103、6· 04X 102、 6. 04Χ IO1拷貝/ μ L的8個濃度梯度,將其作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板,其中單位體積質(zhì)粒溶液內(nèi) 的拷貝數(shù)計算公式如下:每μ L質(zhì)粒溶液的拷貝數(shù)=[質(zhì)粒濃度(g/μ L)X阿伏伽德羅常 數(shù)]/[重組質(zhì)粒分子量Χ660]。 (4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板,構(gòu)建反應(yīng)體系,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,獲得 擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (5) 將已經(jīng)計算出拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,選取6. 04Χ 104、6. 04Χ 103、 6. 04X 102、6. (MXlO1J. 04Χ10°、6. 04ΧΚΓ1拷貝/ μ L的6個濃度梯度,進(jìn)行熒光定量PCR 檢測,以此確定熒光定量PCR所能檢測的最低重組質(zhì)??截悢?shù),驗證本發(fā)明方法的敏感性。 (6) 分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿菌、螄魚 諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健康斑點 叉尾鮰的DNA,以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,驗證本發(fā)明方法的特異 性。 (7) 樣品中的無乳鏈球菌定量計算方法:在熒光定量PCR儀中直接讀取待測樣品的Ct 值,將Ct值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式,計算出無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)(X)。由于無乳 鏈球菌的基因組內(nèi)含有7個拷貝的ISR序列,則最終樣品中的無乳鏈球菌拷貝數(shù)=Χ/7。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法,其特征在于 魚組織內(nèi)無乳鏈球菌DNA的提取方法為:取病魚的組織50?lOOmg,稱重后,放入組織織勻 漿器中研磨,加入1000 μ L TE緩沖液,制成組織勻漿液。取組織勻漿液180 μ L,加入20 μ L 濃度為50mg/mL的溶菌酶,30°C孵育IOmin后續(xù)的提取步驟按照常規(guī)試劑盒的提取方法進(jìn) 行,即得到高純度的含細(xì)菌和魚基因組DNA,保存于-20°C備用。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測方法,其特征在 于步驟4-6中所述的熒光定量PCR反應(yīng)體系如下:總反應(yīng)體積20 μ L,其中SYBR Green I PCR Master Mix預(yù)混液(2X) 10 μ LUOyM上、下游引物各0.5 μ L、模板DNALO μ L、無菌 水8. 0 μ L ;熒光定量PCR反應(yīng)程序為:預(yù)變性94°C,lmin,1個循環(huán);隨后進(jìn)行40個循環(huán), 程序為94°C,30sec,退火60. 4°C,20sec,延伸72°C,20sec,同時設(shè)溶解曲線反應(yīng)參數(shù)為94, 15sec,60°C,30sec,94,15sec〇
      【文檔編號】C12Q1/06GK104263842SQ201410553158
      【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月5日
      【發(fā)明者】李安興, 蘇友祿 申請人:中山大學(xué)
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