一種高效篩選能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效篩選能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法，屬于微生物領(lǐng)域。本發(fā)明方法為從基因型著手篩選多拷貝基因的細(xì)菌，考察其代謝瓜氨酸的能力，從而篩選到能高效利用瓜氨酸的乳酸菌，通過共培養(yǎng)降低瓜氨酸的含量。
【專利說明】一種高效篩選能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效篩選能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法，屬于微生物領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate, EC)是一種致癌物質(zhì)，被人體過量持續(xù)攝入可能 會引發(fā)肺癌、肝癌等嚴(yán)重性腫瘤疾病，并且對人體的免疫系統(tǒng)造成傷害。氨基甲酸乙酯廣泛 存在于各種酒類飲料和發(fā)酵食品中，醬油屬于發(fā)酵食品，在其中檢測出了氨基甲酸乙酯。
[0003] 釀造醬油中氨基甲酸乙酯的主要形成途徑是瓜氨酸與乙醇反應(yīng)生成，而醬醪中的 乳酸菌是通過精氨酸脫亞氨基途徑（ADI途徑）消耗精氨酸，產(chǎn)生瓜氨酸。ADI途徑（圖1) 由ADI (arcA編碼），OTC (arcB編碼），CK (arcC編碼）三個酶催化的反應(yīng)組成。其中ADI酶 催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，OTC酶催化瓜氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，CK酶降解鳥氨酸產(chǎn)生ATP、CO 2 和NH3。篩選能夠充分利用瓜氨酸的微生物，以用于降低醬油中瓜氨酸的含量，是減少和控 制醬油中氨基甲酸乙酯的有效措施之一。
[0004] 醬油中的常見的微生物如乳酸菌（魏斯氏菌、乳酸足球菌以及嗜鹽四聯(lián)球菌等） 和葡萄球菌，芽孢菌等都存在ADI途徑，可以利用精氨酸，在特定條件下積累瓜氨酸。目前， 尚未有關(guān)于有效篩選降解瓜氨酸的微生物的應(yīng)用實(shí)例。
[0005] 本發(fā)明旨在提供一種能夠高效篩選能利用瓜氨酸的微生物的方法，以ADI途徑七 個基因?yàn)楹Y子，并通過精氨酸、瓜氨酸代謝能力分析驗(yàn)證了所篩選得到的微生物降解瓜氨 酸的能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種高效篩選能利用瓜氨酸的微生物的方法。所述方法主要包括以 下步驟：（1)分離樣品中的細(xì)菌并提取各細(xì)菌基因組；⑵以基因組為模版，設(shè)計(jì)引物PCR 驗(yàn)證所篩選細(xì)菌基因組中是否含有arcA、arcB、arcC、arcBp arcQ、arcB2、arcC2這7個基 因，挑選基因組中有這7個基因的細(xì)菌，進(jìn)入下一步篩選；（3)以含有精氨酸或瓜氨酸的氨 基酸檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)所得微生物，檢測精氨酸和瓜氨酸的分解、積累情況，篩選能利用精氨 酸和瓜氨酸且不積累瓜氨酸的微生物。
[0007] 所述 arcA、arcB、arcC、arcBp arcQ、arcB2、arcC2 基因的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 1-7 所示。
[0008] 所述步驟⑵采用的引物如表1所示。
[0009] 所述氨基酸檢測培養(yǎng)基含有（g/L):酵母膏5. 0,牛肉膏5. 0,胰蛋白胨5. 0, NaCl 180. 0,葡萄糖 0· 5, Tween-80 L 0, MgSO4 · 7H20 0· 2, MnSO4 · H2O 0· 05, FeSO4 0· 4,檸檬酸三 胺 2. 0, CaCO3 0· 1，吡哆醛-5-磷酸 0· 05, K2HPO4 2. 0, ρΗ6· 0,氨基酸 5. 0。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述細(xì)菌為乳酸菌。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，篩選得到符合條件的嗜鹽四聯(lián)球菌 (Tetragenococcus halophilus)BBE R23,于2013年10月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心（CCTCC)，中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO:M 2013480。所得嗜鹽四聯(lián)球 菌在添加了精氨酸的正常培養(yǎng)條件下，不積累瓜氨酸；在高鹽脅迫的培養(yǎng)條件下該菌仍具 有快速降解精氨酸的能力，同時不積累瓜氨酸；在高鹽脅迫的培養(yǎng)條件下該菌能徹底消耗 培養(yǎng)基中含有的3g/L瓜氨酸；當(dāng)其與積累瓜氨酸的乳酸足球菌共培養(yǎng)時，可以顯著降低培 養(yǎng)液中由乳酸足球菌產(chǎn)生的瓜氨酸。
[0012] 本發(fā)明提供了一種高效篩選能充分利用瓜氨酸的乳酸菌的方法。該方法為從基因 型著手篩選多拷貝基因的細(xì)菌，考察其代謝瓜氨酸的能力，從而篩選到能高效利用瓜氨酸 的乳酸菌，通過與產(chǎn)瓜氨酸的微生物進(jìn)行共培養(yǎng)，可以降低瓜氨酸的含量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖 IADI 途徑
[0014] 圖2A:37 °C下共培養(yǎng)對乳酸足球菌ADI途徑的影響；對照組：不添加 T. halophilus，實(shí)驗(yàn)組為添加 T. Halophilus ;其中精氨酸的變化量為精氨酸的消耗量，瓜 氨酸和鳥氨酸的變化量為兩種氨基酸的生成量；
[0015] B: 16°C下共培養(yǎng)對乳酸足球菌ADI途徑的影響；對照組：不添加 T. halophilus,實(shí) 驗(yàn)組為添加 T. Halophilus ;其中精氨酸的變化量為精氨酸的消耗量，瓜氨酸和鳥氨酸的變 化量為兩種氨基酸的生成量；
[0016] C:共培養(yǎng)對乳酸足球菌瓜氨酸積累效率的影響；對照組：不添加 T. halophilus， 實(shí)驗(yàn)組為添加 T. Halophilus ;瓜氨酸的積累效率為每摩爾精氨酸轉(zhuǎn)化生成的瓜氨酸的摩 爾數(shù)。
[0017] 圖3嗜鹽四聯(lián)球菌R23和C3 ADI途徑基因簇解析及驗(yàn)證。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 嗜鹽四聯(lián)球菌分離平板：100g/LNaCl，溴甲酚紫0· 06g/L，50y /ml制霉菌素， 100g/L生醬油，瓊脂20g/L)。培養(yǎng)條件：30°C，5-7天。
[0019] 可培養(yǎng)乳酸菌分離平板：MRS培養(yǎng)基，2g/L瓊脂，購于0XI0D公司
[0020] 可培養(yǎng)細(xì)菌分離平板：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：l〇g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏，10g/LNaCl MRS培養(yǎng)基為培養(yǎng)乳酸桿菌專用。
[0021] 嗜鹽四聯(lián)球菌分離培養(yǎng)基：改良MRS :100g/L NaCl，溴甲酚紫0.06g/L，50y/ml制 霉菌素，l〇〇g/L生醬油），30°C，5-7天。
[0022] 氨基酸檢測培養(yǎng)基（g/L):酵母膏5.0,牛肉膏5.0,胰蛋白胨5.0, NaCl 180. 0,葡 萄糖 0· 5, Tween-80 1. 0, MgSO4 · 7H20 0· 2, MnSO4 · H2O 0· 05, FeSO4 0· 4,檸檬酸三胺 2. 0， CaCO3 0· 1，吡哆醛-5-磷酸 0· 05, K2HPO4 2. 0, ρΗ6· 0,氨基酸 5. 0。
[0023] 嗜鹽四聯(lián)球菌的培養(yǎng)條件為：將保藏的嗜鹽四聯(lián)球菌在含100g/LNaCl的MRS固 體培養(yǎng)基上劃線，于30°C靜置培養(yǎng)4天，挑取單菌落接入含10% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基， 30°C靜置培養(yǎng)四天，離心10min(6000rpm，4°C )后收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（PBS，ρΗ7·0) 懸浮菌體。
[0024] 實(shí)施例1醬油中可培養(yǎng)微生物分離
[0025] 從釀造醬油的成曲中取樣稀釋分別涂布到MRS和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平板上，37°C富 集培養(yǎng)5天。挑選不同菌落形態(tài)的單菌落接種到含有MRS和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平板上，劃線 分離作純培養(yǎng)。四天后，將純培養(yǎng)物接種到MRS和營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)四天富集菌 體，提取基因組。以細(xì)菌16S rDNA的PCR通用引物PCR獲得16S rDNA，通過16S rDNA測序 結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對，確定分離的培養(yǎng)物有魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌、嗜鹽四聯(lián)球菌。
[0026] Pediococcus acidilacticiBBE 1120 保藏編號為 CCTCC Ν0:Μ 2013732。
[0027] Tetragenococcus halophilusBBE R23 于 2013 年 10 月 20 日保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（CCTCC)，中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2013480。
[0028] Tetragenococcus halophilusBBE C3 于 2013 年 10 月 20 日保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（CCTCC)，中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2013479。
[0029] 實(shí)施例2ADI途徑基因分析
[0030] 根據(jù)NCBI GenBank中公布的關(guān)于魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌的數(shù)據(jù)：魏 斯氏菌（Weissella confusa LBAE C39-2)GenBank Assembly ID:GCA_000239955. 2,魏 斯氏菌（Weissella cibaria KACC 11862)GenBank Assembly ID:GCA_000193635. 2， 葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp.aureusNCTC 8325)GenBank Assembly ID:GCA_000013425. 1，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici DSM 20284)GenBank Assembly ID:GCA_000146325. I,嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophiIus NBRC 12172) GenBank: AP012046. I，分析可知魏斯氏菌、葡萄球菌、乳酸足球菌的ADI途徑關(guān)鍵基 因都只存在單拷貝，即，僅具備arcA、arcB、arcC這三個基因。嗜鹽四聯(lián)球菌T. halophilus NBRC12172途徑組成包括arc operon上的arcA，arcB，arcC基因以及arc operon以外的額 外兩個拷貝的 arcB, arcC 基因，即具備 arcA、arcB、arcC、arcBl、arcCl、arcB2、arcC2 這 7 個基因。這種ADI途徑基因的拷貝數(shù)可能與菌株利用瓜氨酸的能力有關(guān)。
[0031] 實(shí)施例3嗜鹽四聯(lián)球菌ADI途徑基因簇解析及驗(yàn)證
[0032] 挑取_80°C甘油管保藏的從成曲中篩選得到的Tetragenococcus halophilus BBE R23(CCTCC Ν0:Μ 2013480)、 Tetragenococcus halophilusBBE C3(CCTCC Ν0:Μ 2013479)， 在10% NaCl的MRS固體培養(yǎng)基上劃線。30°C培養(yǎng)四天后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，引物 見表 1，驗(yàn)證是否有 arcA、arcB、arcC、arcBl、arcCl、arcB2、arcC2 基因 。PCR 結(jié)果顯不嗜 鹽四聯(lián)球菌R23基因組存在一個完整的arc operon (arcA、arcB、arcC)和額外兩個拷貝的 arcB基因和arcC基因；嗜鹽四聯(lián)球菌C3基因組不存在一個完整的arc operon(缺失arcA、 arcB、arcC)，但存在arc operon以外兩個拷貝的arcBl、arcCl基因。
[0033] 表1實(shí)施例中用到的引物
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種高效篩選能利用瓜氨酸的微生物的方法，所述方法主要包括以下步驟：（1)分 離樣品中的細(xì)菌，并提取分離得到的細(xì)菌的基因組；(2)以基因組為模版，設(shè)計(jì)引物PCR驗(yàn) 證所篩選細(xì)菌基因組中是否含有arcA、arcB、arcC、arcBp arcQ、arcB2、arcC2這7個基因， 挑選基因組中有這7個基因的細(xì)菌，進(jìn)入下一步篩選；（3)以含有精氨酸或瓜氨酸的氨基酸 檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)所得微生物，檢測精氨酸和瓜氨酸的分解、積累情況，篩選能利用精氨酸和 瓜氨酸且不積累瓜氨酸的微生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述arcA、arcB、arcC、arcBp arcQ、 arcB2、arcC2基因的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 1-7所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸檢測培養(yǎng)基按g/L計(jì)含有：酵 母膏 5. 0,牛肉膏 5. 0,胰蛋白胨 5. 0, NaCl 180. 0,葡萄糖 0? 5, Tween-80 L 0, MgSO4 ? 7H20 0.2, MnSO4 .H2O 0.05, FeSO4 0.4,檸檬酸三胺 2.0, CaCO3 0.1，吡哆醛-5-磷酸 0.05, K2HPO4 2. 0,精氨酸或瓜氨酸5. 0, pH6. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌為乳酸菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌為嗜鹽四聯(lián)球菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)精氨酸和瓜氨酸的檢測，是將培 養(yǎng)液離心，去除菌體，將上清液用高效液相色譜檢測精氨酸和瓜氨酸的含量。
【文檔編號】C12N1/20GK104312953SQ201410554966
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】方芳, 陳堅(jiān), 廖淡宜, 楊怡敏, 堵國成 申請人:江南大學(xué)