一種實時定量熒光rt-pcr檢測馬尾松ggpps基因相對表達(dá)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達(dá)量的方法，通過馬尾松GGPPS基因特異性上、下游引物：P-GGPPS-F:5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'；P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'，采用實時定量熒光RT-PCR技術(shù)檢測樣本中GGPPS基因相對表達(dá)量。本發(fā)明建立的檢測馬尾松GGPPS相對表達(dá)量的方法，可以特異性的檢測分析馬尾松針葉、莖、根系等類型組織樣本中的GGPPS基因相對表達(dá)量，重復(fù)性好，可為選育高產(chǎn)脂力馬尾松優(yōu)良品種提供分子輔助育種的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
【專利說明】-種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達(dá) 量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA(RT)，再設(shè)計 特異引物結(jié)合實時定量熒光PCR檢測技術(shù)檢測馬尾松GGPPS基因相對表達(dá)量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 針葉樹可分泌大量以萜烯類化合物為主要成分的有特定氣味的樹脂，也稱之為松 月旨，是重要的工業(yè)原料，長期以來為人們所研究和開發(fā)利用。馬尾松是我國最主要的采脂樹 種，我國有90 %以上的松脂是采自馬尾松。
[0003] 萜烯類的生物合成途徑有兩條。一條為甲羥戊酸途徑，另一條途徑為甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑。其中櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS)是萜烯類物質(zhì)合成的一 個重要分支酶，催化GPP與2個IPP縮合成GGPP，GGPP為二萜、類胡蘿卜素、赤霉素及葉綠 素側(cè)鏈等的形成提供C20骨架。在松脂成分中，松香含量占70 % -75 %，而松香的主要成分 樹脂酸正是一類二萜化合物，GGPP是樹脂酸的直接前體。在松脂合成部位的顯微觀察中發(fā) 現(xiàn)，松脂的主要合成部位是質(zhì)體，結(jié)合萜類合成途徑分析，細(xì)胞質(zhì)、線粒體、質(zhì)體中分別側(cè)重 不同的萜類合成，其中質(zhì)體中特有的萜類合成途徑包括GGPP的合成以及GGPP下游的二萜 合成，這與松脂的主要成分為二萜樹脂酸相符。此外，萜類的合成為次級代謝，在植物代謝 旺盛時次級代謝才會相應(yīng)的增強(qiáng)，葉綠素是植物光合作用的主要功能基團(tuán)，并且有研究發(fā) 現(xiàn)松樹針葉中葉綠素的含量與松樹產(chǎn)脂力存在著密切的關(guān)系，與普通馬尾松類型相比較， 馬尾松高產(chǎn)脂無性系的葉綠素含量極顯著提高，而GGPP是葉綠素的骨架，直接影響葉綠素 和合成。綜合以上研究結(jié)果，GGPPS基因的表達(dá)豐度在一定程度上反映了植物二萜合成鏈 的活躍程度，GGPPS基因表達(dá)水平相對較高的馬尾松植株，其體內(nèi)的二萜化合物合成相對 較多，產(chǎn)脂力可能相對較高GGPPS很可能與產(chǎn)脂力具有相關(guān)性。本發(fā)明建立的檢測馬尾松 GGPPS相對表達(dá)量的方法，可為選育高產(chǎn)脂力馬尾松優(yōu)良品種提供分子輔助育種的理論基 礎(chǔ)和技術(shù)支持。
[0004] 熒光定量PCR利用熒光染料對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，通 過熒光信號和反應(yīng)循環(huán)數(shù)計算比較樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR對擴(kuò)增過程中的應(yīng) 該信號進(jìn)行全程實時檢測，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰，是一種便 捷可靠的新定量檢測技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的提供一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達(dá)量 的方法。該方法針對目的基因序列設(shè)計特異引物，并采用實時定量熒光RT-PCR方法檢測， 具有靈敏度高，特異型強(qiáng)、快速準(zhǔn)確易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點。
[0006] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：
[0007] -種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達(dá)量的方法，包括引物的 設(shè)計、總RNA的提取與純化、cDNA第一鏈的合成、實時熒光定量PCR和相對表達(dá)量的計算， 得到馬尾松GGPPS基因相對表達(dá)量，具體操作步驟如下：
[0008] (1)引物的設(shè)計：針對馬尾松GGPPS基因（KF278944. 1)設(shè)計用于檢測的目的基因 特異性引物序列如下：
[0009] P-GGPPS-F:5,-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3，；
[0010] P-GGPPS-R:5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3' 。
[0011] 根據(jù)馬尾松actin基因（KF910086. 1)設(shè)計用于檢測的內(nèi)參基因特異性引物，序列 如下：
[0012] P-actin-F:5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3' ；
[0013] P-actin-R:5'-AACCGCCACTGAGCACAATA-3' 。
[0014] (2)總RNA的提取與純化：采用常規(guī)的RNA提取和純化的方法，從馬尾松的植物組 織樣本中提取得到純化的總RNA。
[0015] (3)cDNA第一鏈的合成：以馬尾松的組織樣品的總RNA為模板，采用常規(guī)方法合成 cDNA第一鏈。
[0016] (4)實時熒光定量PCR:采用ABISybrGreenPCRMasterMix(2X)試劑盒按常 規(guī)方法進(jìn)行，以上述步驟（3)合成的cDNA第一鏈為模板，采用步驟（1)中的P-GGPPS-F、 P-GGPPS-R、P-actin-F、P-actin-R為引物，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個樣品設(shè)3 個平行重復(fù)。
[0017] 實時熒光定量PCR擴(kuò)增體系參數(shù)詳見表1。
[0018] 表1 :實時熒光定量PCR擴(kuò)增體系參數(shù)
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達(dá)量的方法，其特征在于：采用針對馬尾松GGPPS基因和actin基因序列設(shè)計特異引物進(jìn)行實時定量熒光PCR檢測， 包括引物的設(shè)計、總RNA的提取與純化、cDNA第一鏈的合成、實時熒光定量PCR和相對表達(dá) 量的計算，得到馬尾松GGPPS基因相對表達(dá)量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種實時定量熒光RT-PCR檢測馬尾松GGPPS基因相對表達(dá) 量的方法，特征在于：所述的特異引物由符合熒光定量PCR反應(yīng)特點的馬尾松GGPPS基因特 異性上、下游引物和馬尾松actin基因特異性上、下游引物組成，兩對引物序列分別是： P-GGPPS-F: 5'-AATGAGGCACTGGAAAGGG-3'； P-GGPPS-R: 5'-AATGCACAGAACAGGACGAAC-3'； P-actin-F: 5'-CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA-3' ； P-actin-R: 5，-AACCGCCACTGAGCACAATA-3,。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357556SQ201410556826
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】陳博雯, 楊章旗, 賈婕, 劉海龍, 覃子海 申請人:廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院