紅球菌高效利用木糖渣生產(chǎn)生物柴油的方法
【專利摘要】生物柴油含硫量低，且不含芳香族化合物，可生物降解，是一種環(huán)境友好型的可再生能源。紅球菌屬有很強(qiáng)的碳源轉(zhuǎn)化能力，能夠?qū)⑸钌a(chǎn)中難以利用的木質(zhì)纖維素高效率轉(zhuǎn)化為脂肪酸，渾濁紅球菌（ Rhodococcusopacus PD630）利用葡萄糖為碳源時(shí)油脂積累量可高達(dá)細(xì)胞干重的86%，是一種優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)油菌株。本發(fā)明提供了一種通過渾濁紅球菌（ Rhodococcusopacus PD630）高效利用木糖渣生產(chǎn)脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌屬，紅球菌屬對極性條件的耐受力強(qiáng)，碳源轉(zhuǎn)化能力高，發(fā)酵條件較為簡單，是一種非常有潛力的生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)途徑。
【專利說明】紅球菌高效利用木糖渣生產(chǎn)生物柴油的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物柴油的生產(chǎn)方法，尤其是關(guān)于紅球菌利用木糖渣產(chǎn)生的脂肪 酸，然后采用生物柴油生產(chǎn)工藝將產(chǎn)出的脂肪酸轉(zhuǎn)化為生物柴油的一種方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)以來，石油一直成為人類大規(guī)模開采和使用的能源。到了 20世紀(jì)后期， 人類逐漸意識到石油資源的短缺及其使用帶來的環(huán)境問題。從而，為解決能源和環(huán)境的雙 重壓力，相關(guān)研究人員也一直致力于新能源的開發(fā)。其中，生物柴油含硫量低，且不含芳香 族化合物，可生物降解，是一種環(huán)境友好型的可再生能源。生物柴油的生產(chǎn)原料來源廣，隨 著社會的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，生物柴油在人類生活生產(chǎn)中所占比例將越來越大。
[0003] 動(dòng)植物油脂用來作為生產(chǎn)生物柴油的原料有一定的局限。首先，產(chǎn)油的農(nóng)作物 受限于土地的利用度，與糧食競爭土地來生產(chǎn)生物柴油有些得不償失。而目前也不斷在 嘗試用微生物油脂作為綠色可持續(xù)的生物柴油原料，紅球菌屬有很強(qiáng)的碳源轉(zhuǎn)化能力，能 夠?qū)⑸钌a(chǎn)中難以利用的木質(zhì)纖維素高效率轉(zhuǎn)化為脂肪酸。渾濁紅球菌 OAacm TO630)利用葡萄糖為碳源時(shí)油脂積累量可高達(dá)細(xì)胞干重的86%，是一種優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)油 菌株。
[0004] 木糖渣是利用玉米芯生產(chǎn)木糖時(shí)的下腳料，其主要成分為48. 5%的纖維素、23. 5% 的半纖維素和21. 3%的木質(zhì)素，是一種優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)資源，并且我國每年有約25萬t的木 糖漁產(chǎn)生，
【發(fā)明者】長期探索發(fā)明了一種通過渾池紅球菌（Rhodococcus opacus Η)630)高效 利用木糖渣生產(chǎn)脂肪酸的方法。相比常用的酵母菌屬，紅球菌屬對極性條件的耐受力強(qiáng)，碳 源轉(zhuǎn)化能力高，發(fā)酵條件較為簡單，是一種非常有潛力的生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種高效產(chǎn)油紅球菌一/Sot/ococciAs Ρ?630，保藏編號 DMSZ44193。在渾濁紅球菌(TSoi/ococcm OAacm TO630)的發(fā)酵培養(yǎng)基中配入適量的木糖 渣粉，在發(fā)酵過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測其濃度，及時(shí)補(bǔ)料，同時(shí)也要控制好其他條件參數(shù)。通過勻漿 使得紅球菌細(xì)胞破碎釋放胞內(nèi)油脂，然后將渾濁紅球菌發(fā)酵積累的油脂通過極性有機(jī)溶劑 (如氯仿、己烷）萃取出來，接著用酯交換的方法將提純出來的微生物油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油。 或者對紅球菌生物質(zhì)進(jìn)行直接酯交換以制備生物柴油。具體的實(shí)施方式，本文將通過以下 幾個(gè)實(shí)施例來加以詳細(xì)說明。

【具體實(shí)施方式】 [0006] 實(shí)施例1 種子培養(yǎng)基：葡萄糖l〇g/L，酵母提取物5g/L，麥芽提取物10g/L，Na2HPO4 · 12H20 9g/ UKH2PO4 1.5g/L。除葡萄糖外將培養(yǎng)基其他成分于121°C條件下滅菌20min，葡萄糖單獨(dú)于 115°0滅菌2〇1^11。接種量為2%，起始口!17.2±0.02,281：，200卬111，培養(yǎng)2411。
[0007] 24h 后測得 OD6tltl 為 47. 2。
[0008] 實(shí)施例2 改變培養(yǎng)基中氮源的量，將上述實(shí)施例1中的種子培養(yǎng)罐中的菌體分別轉(zhuǎn)入下面的培 養(yǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0009] 營養(yǎng)平衡培養(yǎng)基：木糖渣 80g/L，尿素 10g/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，CaCl2 · 2H20 0· 02g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 5g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 4g/L，MnSO4 · 5H20 0· 02g/L，H3BO3 0· 015g/L， NiCl2 · 2H20 0· 01g/L，EDTA 0· 25g/L，CoCl2 · 6H20 0· 05g/L，CuCl2 · 2H20 0· 005g/L，Stock A溶液lml/L，I. OM磷酸緩沖溶液35. 2ml/L。
[0010] 氮源限制培養(yǎng)基：木糖渣80g/L，尿素0. 636g/L，其他成分與營養(yǎng)平衡型培養(yǎng)基 一致。
[0011] Stock A 溶液配方：NaMoO4 · 2H20 2g/L，F(xiàn)eNa · EDTA 5g/L。
[0012] I. OM 磷酸緩沖溶液配方：KH2PO4 47g/L，K2HPO4 113g/L。
[0013] 將實(shí)施例1發(fā)酵得到的種子液分別轉(zhuǎn)入營養(yǎng)平衡培養(yǎng)基和氮源限制培養(yǎng)基，分別 置于于7L全自動(dòng)發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定為：轉(zhuǎn)速500rpm，pH7. 2±0,02,溫度28°C，通 氣量0. 5vvm，培養(yǎng)周期為110h。發(fā)酵過程中隨著木糖渣濃度低于8g/L時(shí)，要及時(shí)向培養(yǎng)液 中補(bǔ)料使得木糖渣的濃度維持在80g/L左右。
[0014] 實(shí)施例3 :測定紅球菌細(xì)胞油脂產(chǎn)率 A.測定紅球菌細(xì)胞干重 上述實(shí)施例2發(fā)酵結(jié)束后，分別在兩個(gè)發(fā)酵罐取Iml發(fā)酵液，在lOOOOrpm下離心 10min，用水洗滌生物質(zhì)沉淀兩次，并在40°C下恒溫干燥24h，通過重量分析確定生物質(zhì)。
[0015] B.從渾濁紅球菌細(xì)胞中提取油脂（Folch油的提取方法） 將上述實(shí)施例發(fā)酵產(chǎn)生的紅球菌生物質(zhì)與20體積的氯仿：甲醇（2:1)混合液一起勻 漿。分散后，室溫下在軌道振蕩器上過夜攪拌整個(gè)混合液，離心并回收液相。用0.2體積的 水洗滌溶劑。漩渦混合幾秒后，2000rpm下離心分開兩相。虹吸去除上相，氮?dú)饬鞣諊略?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)含有脂質(zhì)的下相，回收油脂，稱重。
[0016] C.渾濁紅球菌細(xì)胞的油脂產(chǎn)率 通過用紅球菌細(xì)胞產(chǎn)油脂的量與渾濁紅球菌細(xì)胞干重的比值來表示細(xì)胞的油脂產(chǎn)率。
[0017] D.營養(yǎng)平衡培養(yǎng)基和氮源限制培養(yǎng)基的紅球菌細(xì)胞的產(chǎn)油率 表1

【權(quán)利要求】
1. 一種高效生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于：生產(chǎn)生物柴油的原料油脂是微生物油 脂。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，微生物油脂的的生產(chǎn)菌種為紅球菌屬。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述產(chǎn)油菌種包括opactts 1^630、 jbWii RHAl等紅球菌屬的多個(gè)種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述，產(chǎn)油紅球菌產(chǎn)油利用的碳源為工業(yè)廢棄木糖渣。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述，木糖渣添加方式為直接配入培養(yǎng)基和補(bǔ)料添加，添加量為 8%-10%。
6. 紅球菌細(xì)胞產(chǎn)油的提取方式為氯仿-甲醇（2:1)萃取。
7. 利用紅球菌細(xì)胞產(chǎn)油生產(chǎn)生物柴油的方式為對提取的油脂進(jìn)行酯交換或直接對凍 干的紅球菌細(xì)胞進(jìn)行酯交換反應(yīng)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述，對細(xì)胞進(jìn)行直接酯交換后提取生物柴油的方法為有機(jī)溶劑萃 取，萃取劑包括：氯仿，己烷，乙醚等。
【文檔編號】C12R1/01GK104313067SQ201410558740
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】朱道辰, 謝長校, 陳焱 申請人:鎮(zhèn)江拜因諾生物科技有限公司