一株芽孢桿菌及其菌劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種芽孢桿菌及其菌劑的制備方法，所述菌株為芽孢桿菌FZUL-33(BacillusSp.)，已于2014年8月15日于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏號(hào)：CGMCCNo.9523，將該菌株活化、發(fā)酵得到發(fā)酵培養(yǎng)液，與添加劑混合后通過噴霧干燥工藝制備菌劑，應(yīng)用于土壤殘留農(nóng)藥的降解。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于利用芽孢桿菌耐高溫、耐干燥的特點(diǎn)，使其在經(jīng)過噴霧干燥菌劑制備過程后，菌株仍有較高的存活率，通過平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)所得菌劑存活率達(dá)到70%以上，活菌數(shù)大于1010CFU/g。
CGMCC No9523
20140815
【專利說明】一株芽孢桿菌及其菌劑的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一株芽孢桿菌及其菌劑的制備方法，包括 微生物培養(yǎng)和菌劑制備及其降解有機(jī)磷農(nóng)藥的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)代農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，不可避免的導(dǎo)致農(nóng)藥殘留問題的出現(xiàn)。其中，有機(jī)磷農(nóng)藥應(yīng) 用最為廣泛。而往往有機(jī)磷農(nóng)藥發(fā)揮殺蟲作用的只有一小部分，很大一部分則殘留下來。殘 留下的有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)改變土壤的理化性質(zhì)，影響土壤質(zhì)量，并且隨著雨水沖刷，造成地下水 污染。有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)人畜可產(chǎn)生慢性中毒，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷。對(duì)于農(nóng)藥的致癌、致畸、致 突變問題更是令廣大群眾擔(dān)憂。
[0003] 目前，利用微生物降解殘留農(nóng)藥的方法因其操作可行性和成本低等特點(diǎn)，已獲得 廣泛的肯定。對(duì)具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物的篩選通常是由長(zhǎng)期遭受農(nóng)藥污染的土壤和 水體中分離得到。例如，天京科技大學(xué)的王碩、郭睿莉等人（2009)從山東農(nóng)藥廠采集的活 性污泥中分離得到一株能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的產(chǎn)堿桿菌。本發(fā)明特點(diǎn)在于所分離到的芽孢 桿菌能快速有效降解殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種一株芽孢桿菌及其菌劑的制備方法，解決農(nóng)藥殘留問 題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 本發(fā)明利用的微生物鑒定為芽孢桿菌分.）FZUL_33。該菌株已保存于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：中國北京，保藏日期為2014年 8月15日，保藏號(hào)為：CGMCC No. 9523。該菌株通過噴霧干燥制得的菌劑具有降解有機(jī)磷農(nóng) 藥的特性。
[0006] 本發(fā)明所用菌株是從福建某長(zhǎng)期有機(jī)磷農(nóng)藥用地的土壤中分離得到，該菌株為革 蘭氏陽性細(xì)菌，菌落表面粗糙，乳白色，邊緣波狀有褶皺，菌體無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。該 芽孢桿菌可在PH為7. 2的LB培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)。將該菌株活化、發(fā)酵得到發(fā)酵培養(yǎng)液，與 添加劑混合后通過噴霧干燥工藝制備菌劑，應(yīng)用于土壤殘留農(nóng)藥的降解。
[0007] 具體步驟如下： 1、菌種復(fù)蘇：芽孢桿菌FZUL-33 分.FZUL-33)種子菌接種到LB固體培養(yǎng)基 上，32°C，培養(yǎng)48h，備用。
[0008] 2、菌種活化：將LB固體培養(yǎng)基菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中，32-35 °C培養(yǎng) 18-24h，得到液體發(fā)酵種子培養(yǎng)液。
[0009] 3、菌種發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子培養(yǎng)液按3%的接種量接種入發(fā)酵罐，32-35 °C培養(yǎng) 36-48h，得到芽孢桿菌發(fā)酵液。
[0010] 4、在發(fā)酵液中按5%-10%的質(zhì)量比通過無菌操作添加碳酸鈣、碳酸氫鈉作為噴霧 干燥保護(hù)劑，振蕩使懸浮均勻，制得菌體懸浮液，備用。
[0011] 5、將所得菌體懸浮液進(jìn)行噴霧干燥得到干燥菌劑，進(jìn)料濃度為20-30%，進(jìn)料量 10-20ml/min，進(jìn)風(fēng)溫度 110-150°C，出風(fēng)溫度 60-90°C。
[0012] 所述菌株LB固體培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，其余為 水，pH為7. 2,溫度32-35°C。LB液體培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉 1%，其余為水，pH為7. 2。
[0013] 步驟（5)中噴霧干燥條件為：進(jìn)風(fēng)溫度為IKTC _150°C，出風(fēng)溫度為60°C -90°C， 進(jìn)樣速度為5-10ml/min。
[0014] 步驟（4)中碳酸鈣含量為5wt. %-12wt. %，碳酸氫鈉含量為5wt. %-lOwt. %。
[0015] 所述的方法制備得到的菌劑。該菌劑在24-48h內(nèi)降解農(nóng)藥用地中75%以上的乙 酰甲胺磷。該菌劑降解有機(jī)磷農(nóng)藥的適宜PH為7-9。
[0016] 所述的菌劑在有機(jī)磷農(nóng)藥降解中的應(yīng)用。
[0017] 我們通過含有機(jī)磷農(nóng)藥農(nóng)的培養(yǎng)基篩選出了能夠耐受有機(jī)磷農(nóng)藥的芽孢桿菌，發(fā) 現(xiàn)該芽孢桿菌具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥的特性。并且本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于利用芽孢桿菌耐高溫、 耐干燥的特點(diǎn)，使其在經(jīng)過噴霧干燥菌劑制備過程后，菌株仍有較高的存活率，通過平板計(jì) 數(shù)法檢測(cè)所得菌劑存活率達(dá)到70%以上，活菌數(shù)大于10 1(lCFU/g。本發(fā)明有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量 采用氣象色譜法測(cè)定。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)例1 :芽孢桿菌菌劑制備 1. 1菌種的活化 取甘油冷凍保藏的芽孢桿菌種子菌，在LB平板上劃線，挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基 中，在好氧、常壓、32°C條件下置于120轉(zhuǎn)/分鐘搖床中振蕩培養(yǎng)24h，再按3%接種量擴(kuò)大培 養(yǎng) 24h。
[0019] 1. 2芽孢桿菌菌劑制備及有機(jī)磷農(nóng)藥降解的作用。
[0020] 將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按5%的接種量接入發(fā)酵罐中，32°C培養(yǎng)48小時(shí)得到發(fā)酵液，往 發(fā)酵液中加入質(zhì)量比為10%碳酸鈣和質(zhì)量比為10%的碳酸氫鈉，振蕩搖勻5min得到芽孢桿 菌菌體懸浮液。通過噴霧干燥得到固體顆粒菌劑。噴霧干燥條件為如表1所示。
[0021] 表1噴霧干燥條件

【權(quán)利要求】
1. 一株芽孢桿菌，其特征在于：所述菌株為芽孢桿菌5^.)FZUL-33,已于 2014年8月15日于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏號(hào)： CGMCC No.9523。
2. -種如權(quán)利要求1所述的一株芽孢桿菌的菌劑制備方法，其特征在于：所述方法包 括以下步驟： (1) 菌種復(fù)蘇：將所述芽孢桿菌FZUL-33 分.）種子菌接種到LB固體培養(yǎng) 基上，32°C，培養(yǎng)48h，備用； (2) 菌種活化：將LB固體培養(yǎng)基菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中，32-35°C培養(yǎng)18-24h，得 到液體發(fā)酵種子培養(yǎng)液； (3) 菌種發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子培養(yǎng)液按3%的接種量接種入發(fā)酵罐，32-35°C培養(yǎng) 36-48h，得到芽孢桿菌發(fā)酵液； (4) 在發(fā)酵液中按5%-10%的質(zhì)量比通過無菌操作添加碳酸鈣、碳酸氫鈉作為噴霧干燥 保護(hù)劑，振蕩使懸浮均勻，制得菌體懸浮液，備用； (5) 將所得菌體懸浮液進(jìn)行噴霧干燥工藝得到干燥菌劑，進(jìn)料濃度為20-30wt. %，進(jìn)料 量 10_20ml/min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株芽孢桿菌的菌劑制備方法，其特征在于：所述菌株LB 固體培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，瓊脂1. 5%，其余為水，pH為 7. 2; LB液體培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，其余為水，pH為7. 2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株芽孢桿菌的菌劑制備方法，其特征在于：步驟（5)中 噴霧干燥條件為：進(jìn)風(fēng)溫度為ll〇°C -150°C，出風(fēng)溫度為60°C -90°C，進(jìn)樣速度為5-10ml/ min〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株芽孢桿菌的菌劑制備方法，其特征在于：步驟（4)中碳 酸鈣含量為5wt. %-12wt. %，碳酸氫鈉含量為5wt. %-10wt. %。
6. -種如權(quán)利要求2所述的方法制備得到的菌劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的的方法制備得到的菌劑，其特征在于：該菌劑在24-48h內(nèi)降 解農(nóng)藥用地中75%以上的乙酰甲胺磷。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的的方法制備得到的菌劑，其特征在于：該菌劑降解有機(jī)磷農(nóng) 藥的適宜pH為7-9。
9. 一種如權(quán)利要求6所述的菌劑在有機(jī)磷農(nóng)藥降解中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104371954SQ201410560193
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】程揚(yáng)健, 林文挺, 韓冉, 許心雅, 黃振 申請(qǐng)人:福州大學(xué)