一種am真菌菌劑的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種真菌菌劑的生產(chǎn)方法，尤其是涉及一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：玉米催芽、接種、苗期管理、菌劑質(zhì)量分析：接種4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方法進(jìn)行AM真菌侵染狀況和侵染率調(diào)查，進(jìn)行菌劑的質(zhì)量評價(jià)；本發(fā)明方法獨(dú)特、菌劑質(zhì)量高、侵染率高。
【專利說明】-種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種真菌菌劑的生產(chǎn)方法，尤其是涉及一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 菌根（Mycorrhiza)是菌根真菌與植物根系形成的共生體。自然界中93%以上的 植物都能形成菌根。AM真菌又稱叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza Fungi,簡稱AMF)。 前人研究認(rèn)為，AM真菌能夠促進(jìn)植物對礦質(zhì)養(yǎng)分尤其是磷和微量元素的吸收，增強(qiáng)植物抵 抗養(yǎng)分脅迫的能力，減少氮、磷肥的使用量和流失，從而避免水體富營養(yǎng)化。同時(shí)，其菌絲可 以形成菌絲橋，在不同植株間傳遞養(yǎng)分，成為生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)的重要通道。AM真菌能夠 提高植物的抗逆性：能改善植物的水分狀況，提高植物的抗旱能力；能提高植物抗鹽脅迫 的能力；能夠提1?植物抗有機(jī)污染能力；能提1?植物的抗病能力；能提1?植物對重金屬污 染的抵御能力。
[0003] AM真菌在林木育苗方面應(yīng)用較廣，且效應(yīng)顯著。林先貴等（2002)對16種不同 種類植物對菌根的依賴性進(jìn)行測定，除菊花外，其余植物都有較高的依賴性，但依賴強(qiáng)度存 在差異。同時(shí)，接種菌根后，株高、地上部分、地下部分鮮重和侵染率都大于對照。黃春梅 等（2005)對孟加拉粉大蕉試管苗接種光壁無梗囊霉（Acaulospota Iaevis)、蘇格蘭球囊 霉（Glomus caledonium)和摩西球囊霉（Glomus mosseae)，認(rèn)為菌根的形成對其苗高生 長有促進(jìn)作用。張林平等（2002)用摩西球囊霉（Glomus mosseae)、根內(nèi)球囊霉（Glomus intraradices)和地表球囊霉（Glomus versiforme)接種溫室營養(yǎng)缽銀杏幼苗后，均能顯 著提高苗高、葉數(shù)、葉面穗和葉片干重。劉建福等（2005)研究表明AM真菌能夠促進(jìn)澳洲 堅(jiān)果幼苗的生長，增強(qiáng)根系活力，促進(jìn)根系對礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收和累積，并促進(jìn)植株的光合作 用。蘋果是典型的AM真菌的宿主植物，對菌根真菌的依賴性較強(qiáng)。AM真菌能促進(jìn)蘋果樹對 礦質(zhì)營養(yǎng)和水分的吸收和利用，顯著影響蘋果樹生長和內(nèi)源激素含量，提高蘋果樹的抗病 性。宋富強(qiáng)等（2004)研究認(rèn)為AM真菌接種大青楊苗木，能顯著促進(jìn)苗木苗高、地徑、總干 生物量的增加，同時(shí)增加苗木對難溶性P肥的吸收和利用。AM真菌的宿主范圍相當(dāng)廣泛，除 了在樹木上外，對蔬菜、糧食作物也有很好的接種效果。利用AM真菌接種青椒、西瓜、草莓、 香蕉、玉米和沼澤稻（Waterland rice)等均取得很好的接種效果。
[0004] 以上AM真菌對植物的有益作用僅限于小規(guī)模的科學(xué)實(shí)驗(yàn)，在生產(chǎn)上的大面積的 應(yīng)用還未見報(bào)道，其主要原因是AM真菌的菌劑生產(chǎn)技術(shù)不夠成熟，生產(chǎn)的菌劑質(zhì)量不高， 侵染率低。
[0005] 目前還沒有克服上述缺陷的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種方法獨(dú)特、菌劑質(zhì)量高、侵染率高 的一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法。
[0007] 本發(fā)明通過如下方式實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：
[0009] a、玉米催芽：挑選籽粒飽滿、無破損、無蟲咬的栽培用玉米種子，先用75%酒精溶 液滅菌30s，再用無菌水沖洗5次，置于培養(yǎng)箱中，溫度為28°C，暗催芽；
[0010] b、接種：每個(gè)花盆中先填充1/3的培養(yǎng)基質(zhì)，然后撒0. 5?I. Ocm接菌劑，再鋪1/3 的培養(yǎng)基質(zhì)，每盆撒20?25粒紅三葉草種子和3粒已催芽的玉米，盆中用滅菌河沙基質(zhì)填 充，澆水；
[0011] C、苗期管理：配置Hoagland營養(yǎng)液，使用方法：幼苗期，每周一次澆1/2強(qiáng)度的營 養(yǎng)液，所有營養(yǎng)元素減半，IOOmL/盆；成苗后，每周一次全營養(yǎng)液，也可磷減半；收獲期，不 再澆營養(yǎng)液至少4個(gè)月以后，以上針對全沙培養(yǎng)基質(zhì)；
[0012] d、菌劑質(zhì)量分析：接種4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染 色方法進(jìn)行AM真菌侵染狀況和侵染率調(diào)查，進(jìn)行菌劑的質(zhì)量評價(jià)；
[0013] 所述菌種為摩西球囊霉、縮球囊霉、根內(nèi)球囊霉和地表球囊霉；所述宿主植物為玉 米、紅三葉草；所述培養(yǎng)基質(zhì)為純河沙；所述培養(yǎng)容器為18cmX 24cm的塑料花盆；所述容器 的消毒：75%的乙醇溶液擦拭花盆；
[0014] 所述PhiIlips和Hayman的染色方法：挖取容器中正常生長的宿主植物毛細(xì)根，清 洗后剪成Icm長根段置于FAA固定液中固定24h后，把固定液徹底沖洗凈，加入10% KOH溶 液浸透根樣，90°C中加熱lh，用清水洗去Κ0Η，加堿性雙氧水軟化根段，室溫下放置20min后 洗去堿性H 2O2，加入5%乳酸溶液或1% HCl酸化3 - 4min后倒去乳酸溶液，加入曲利苯藍(lán) 染色液于90°C中加熱30min，使染料很快滲透到根組織和真菌的細(xì)胞中，染色后，將根樣放 到乳酸甘油中浸泡除去多余的染料，使菌根的菌絲、泡囊和叢枝保持染色狀態(tài)，然后制片， 在顯微鏡下觀察叢枝、泡囊、菌絲的結(jié)構(gòu)特征。統(tǒng)計(jì)根段中菌根真菌侵染的根段數(shù)，根據(jù)以 下公式，計(jì)算侵染率及侵染等級：
[0015] 菌根侵染率=有菌根感染的根段長度/檢查根段總長度X 100%
[0016] 侵染等級：1級一受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的0?5%
[0017] 2級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的6?25%
[0018] 3級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的26?50%
[0019] 4級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的51?75%
[0020] 5級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的76?100% ;
[0021] 所述FAA固定液為甲醛6ml、冰醋酸1ml、酒精20ml、蒸餾水40ml比例配置，所述堿 性雙氧水為3mlNH 40H加到30ml 10 % H2O2中，加水60ml混勻即可；
[0022] 所述純河沙是河沙過2mm篩，沙粒的粒徑< 2mm，水沖洗3遍，先用0. 5 %的高猛酸 鉀溶液噴灑，再用薄膜覆蓋，太陽下暴曬3天，掀膜后晾曬3天所得。
[0023] 本發(fā)明有如下效果：
[0024] 1)方法獨(dú)特：本發(fā)明提供的AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其包括玉米催芽、接種、苗期 管理、菌劑質(zhì)量分析；本發(fā)明通過對摩西球囊霉（Glomus mosseae(Nicolson&Gerdemann) Gerdemann&Trappe)、縮球囊霉（GlomusconstrictumTrappe)、根內(nèi)球囊霉（Glomus intraradices Schenck&Smith)和地表球囊霉（Glomus versiforme (Kaisten) Berch)四種 AM真菌的擴(kuò)繁，生產(chǎn)出高質(zhì)量的AM真菌菌劑，并利用自繁的菌劑進(jìn)行了接種實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了 枸杞的菌根化育苗，馬鈴薯和芹菜的大田接種，取得了很好的接種效果。
[0025] 2)侵染率高：本發(fā)明采用了紅三葉草和玉米兩種植物作為宿主植物，對縮球囊 霉、摩西球囊霉、根內(nèi)球囊霉和地表球囊霉四種AM真菌進(jìn)行菌種擴(kuò)繁。如表1所示：四種AM 真菌對三葉草和玉米的侵染率均在90%以上，
[0026] 表1擴(kuò)繁的AM真菌菌劑的侵染率
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于：該方法包括如下步驟： a、 玉米催芽：挑選籽粒飽滿、無破損、無蟲咬的栽培用玉米種子，先用75%酒精溶液滅 菌30s，再用無菌水沖洗5次，置于培養(yǎng)箱中，溫度為28°C，暗催芽； b、 接種：每個(gè)花盆中先填充1/3的培養(yǎng)基質(zhì)，然后撒0. 5?1. 0cm接菌劑，再鋪1/3的 培養(yǎng)基質(zhì)，每盆撒20?25粒紅三葉草種子和3粒已催芽的玉米，盆中用滅菌河沙基質(zhì)填 充，澆水； c、 苗期管理：配置Hoagland營養(yǎng)液，使用方法：幼苗期，每周一次燒1/2強(qiáng)度的營養(yǎng) 液，所有營養(yǎng)元素減半，l〇〇mL/盆；成苗后，每周一次全營養(yǎng)液，也可磷減半；收獲期，不再 澆營養(yǎng)液至少4個(gè)月以后，以上針對全沙培養(yǎng)基質(zhì)； d、 菌劑質(zhì)量分析：接種4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方 法進(jìn)行AM真菌侵染狀況和侵染率調(diào)查，進(jìn)行菌劑的質(zhì)量評價(jià)。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于：所述菌種為摩西球 囊霉、縮球囊霉、根內(nèi)球囊霉和地表球囊霉；所述宿主植物為玉米、紅三葉草；所述培養(yǎng)基 質(zhì)為純河沙；所述培養(yǎng)容器為18cmX24cm的塑料花盆；所述容器的消毒：75%的乙醇溶液 擦拭花盆。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于：所述Phillips和 Hayman的染色方法：挖取容器中正常生長的宿主植物毛細(xì)根，清洗后剪成lcm長根段置于 FAA固定液中固定24h后，把固定液徹底沖洗凈，加入10% K0H溶液浸透根樣，90°C中加熱 lh，用清水洗去K0H，加堿性雙氧水軟化根段，室溫下放置20min后洗去堿性H202，加入5% 乳酸溶液或1% HC1酸化3 - 4min后倒去乳酸溶液，加入曲利苯藍(lán)染色液于90°C中加熱 30min，使染料很快滲透到根組織和真菌的細(xì)胞中，染色后，將根樣放到乳酸甘油中浸泡除 去多余的染料，使菌根的菌絲、泡囊和叢枝保持染色狀態(tài)，然后制片，在顯微鏡下觀察叢枝、 泡囊、菌絲的結(jié)構(gòu)特征。統(tǒng)計(jì)根段中菌根真菌侵染的根段數(shù)，根據(jù)以下公式，計(jì)算侵染率及 侵染等級： 菌根侵染率=有菌根感染的根段長度/檢查根段總長度X 100% 侵染等級：1級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的〇?5% 2級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的6?25% 3級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的26?50% 4級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的51?75% 5級--受感染的營養(yǎng)根占觀察總根數(shù)的76?100%。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于：所述FAA固定液為 甲醛6ml、冰醋酸lml、酒精20ml、蒸餾水40ml比例配置，所述堿性雙氧水為3mlNH40H加到 30ml 10% H202中，加水60ml混勻即可。
5. 如權(quán)利要求2所述的一種AM真菌菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于：所述純河沙是河沙 過2mm篩，沙粒的粒徑< 2mm，水沖洗3遍，先用0. 5%的高錳酸鉀溶液噴灑，再用薄膜覆蓋， 太陽下暴曬3天，掀膜后晾曬3天所得。
【文檔編號】C12N1/14GK104371932SQ201410561531
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】王亞軍, 安巍, 羅青, 唐明, 曹有龍, 石志剛, 趙建華, 張海涵, 劉洪光, 張曦燕, 尹躍 申請人:寧夏農(nóng)林科學(xué)院