小麥白粉病抗病基因Pm51的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及植物分子遺傳學(xué)和小麥育種，具體涉及一種小麥白粉病抗病新基因Pm51的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明獲得與抗白粉病基因Pm51連鎖的功能性分子標(biāo)記BQ246670。該標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，與Pm51的遺傳距離為1.5cM，可以快速、準(zhǔn)確鑒定小麥Pm51基因的存在與否以及存在狀態(tài)并預(yù)測(cè)白粉病抗性，從而加快對(duì)抗小麥白粉病基因Pm51的利用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】小麥白粉病抗病基因 Pm51的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物分子遺傳學(xué)和小麥育種，具體涉及一種小麥白粉病抗病新基因 Pm51的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 由白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici)引起的小麥白粉病是小麥的主要 病害，近年該病在我國(guó)的發(fā)病范圍不斷擴(kuò)大、危害程度不斷加重，是當(dāng)前小麥生產(chǎn)的重要威 脅之一。2013年白粉病在全國(guó)發(fā)生面積為1.05億畝，其中，河南沿黃稻茬麥和中北部高產(chǎn) 區(qū)、江蘇沿海和里下河麥區(qū)、陜西秦嶺北麓偏重發(fā)生，黃淮、江淮的其他麥區(qū)，西南、西北和 新疆大部麥區(qū)，華北南部麥區(qū)中等發(fā)生。白粉病已成為僅次于赤霉病或條銹病的第二大病 害。
[0003] 培育抗病小麥新品系是防治小麥白粉病最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法。迄今，國(guó)際上 已正式命名了 61個(gè)抗白粉病主效基因（Pml-Pm50)，分布在46個(gè)位點(diǎn)上。然而，由于小麥白 粉菌具有高度的遺傳變異性，單個(gè)的抗病基因很容易被新的白粉菌毒力突變體克服而喪失 抗性。發(fā)掘新的抗病基因及其連鎖的分子標(biāo)記、培育抗病基因聚合品種（系），對(duì)于小麥抗 白粉病新品種的培育，延長(zhǎng)品種抗性具有重要意義。
[0004] 長(zhǎng)穗偃麥草是小麥遺傳改良的重要基因資源之一，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入研 究，將長(zhǎng)穗偃麥草對(duì)小麥銹病、根腐病的抗性基因成功地導(dǎo)入小麥，育成品種已大面積應(yīng)用 到生產(chǎn)實(shí)踐中。由此可見(jiàn)，將長(zhǎng)穗偃麥草抗白粉病基因?qū)肫胀ㄐ←溨胁?duì)其進(jìn)行遺傳定 位、標(biāo)記開(kāi)發(fā)和標(biāo)記應(yīng)用的研究對(duì)小麥抗病育種工作具有十分重要的理論和實(shí)踐應(yīng)用意 義。
[0005] 為轉(zhuǎn)育偃麥草的抗白粉病基因，山西省農(nóng)科院作物遺傳研究所以八倍體小偃麥為 橋梁，通過(guò)感病品種與八倍體小偃麥"小偃7430"雜交、回交，育成兼抗白粉病和條銹病的小 麥新品系CH7086。白粉病抗病性鑒定及分子標(biāo)記分析表明，CH7086攜帶有一個(gè)顯性抗白粉 病基因，國(guó)際基因組命名委員會(huì)將其命名為Pm51。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種小麥白粉病抗病新基因 Pm51的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明提供的一種小麥白粉病抗病基因 Pm51的分子標(biāo)記，命名為BQ246670,核苷 酸序列為：
[0009] 上游引物：5，-AGAAGGCACACTGCTGGAAC-3' （SEQ ID NO. 1)，
[0010] 下游引物：5，-ACATGAGTGAGTTGTGAGTC-3，（SEQ ID NO. 2)。
[0011] 本發(fā)明提供的一種小麥白粉病抗病新基因 Pm51的鑒定方法，包括如下步驟：
[0012] (1)以CH7086/臺(tái)長(zhǎng)29的F2代群體基因組DNA為模板，以上述分子標(biāo)記為引物， 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為 15 μ L，含 IOXbufferL 5 μ LUOmM dNTPO. 15 μ L、2 μ M 引物 2. O μ L、5U TaqDNA聚合酶0. 15 μ L、50ng基因組DNA2. O μ L，去離子水補(bǔ)足至15 μ L ;擴(kuò)增 程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，57°C退火45s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)，72°C延 伸5min，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0013] (2)PCR產(chǎn)物檢測(cè)，用2%瓊脂糖凝膠電泳，將15μ L PCR產(chǎn)物和10μ L上樣緩沖液 混合點(diǎn)樣，IlOV電泳I. 5h，EB染色拍照；
[0014] (3)分析鑒定，能擴(kuò)增出500bp的特異條帶，則說(shuō)明待測(cè)小麥種質(zhì)中存在抗白粉病 基因 Pm51，否則，待測(cè)小麥種質(zhì)中不存在抗白粉病基因 Pm51。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0016] 本發(fā)明獲得與抗白粉病基因 Pm51連鎖的功能性分子標(biāo)記BQ246670。該標(biāo)記是共 顯性標(biāo)記，與Pm51的遺傳距離為I. 5cM，可以快速、準(zhǔn)確鑒定小麥Pm51基因的存在與否以及 存在狀態(tài)并預(yù)測(cè)白粉病抗性，從而加快對(duì)抗小麥白粉病基因 Pm51的利用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為Pm51的比較基因組圖譜
[0018] (A)2BL物理圖譜⑶Pm51的遺傳圖（C)Pm51對(duì)應(yīng)的水稻基因組區(qū)域（D)Pm51對(duì)應(yīng) 的短柄草基因組區(qū)域
[0019] 圖2為功能性標(biāo)記BQ246670在CH7086/臺(tái)長(zhǎng)29的F2代部分單株的擴(kuò)增結(jié)果，
[0020] 圖中？1；:〇17086(含？11151)、？8:臺(tái)長(zhǎng)29、81；:抗病基因池（含？11151)、88 :感病基因 池、R:抗病單株（含Pm51)、S:感病單株

【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 十倍體長(zhǎng)穗偃麥草是小麥抗病育種的優(yōu)良抗源，為了利用長(zhǎng)穗偃麥草中的抗白粉 病基因，我們對(duì)源自長(zhǎng)穗偃麥草的小偃麥滲入系CH7086中抗白粉病基因 Pm51進(jìn)行定位、功 能性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
[0023] -、苗期白粉病鑒定分析
[0024] 用4個(gè)白粉菌生理小種在2-4葉期分別對(duì)各供試材料進(jìn)行苗期離體白粉病抗性 鑒定。溫室播種實(shí)驗(yàn)材料待第一葉片完全展開(kāi)，剪取葉段約2_4cm，水平放置在培養(yǎng)基表 面，葉面朝上，用解剖針挑取白粉菌的孢子接種于葉段上。將接種完的葉段置于光照培養(yǎng)箱 (20-23°C )，白天加光，晚上黑暗。IOd后參照盛寶欽提出的小麥白粉病苗期反應(yīng)型0-4級(jí) 的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，觀察反應(yīng)型。
[0025] 二、成株期白粉病抗性鑒定及抗病基因的遺傳分析
[0026] 在溫室用當(dāng)前白粉病流行生理小種E09對(duì)各后代群體進(jìn)行白粉病抗性鑒定，將待 鑒定材料按單株播于溫室，抗感親本和Fl各種1行、每行15粒，F(xiàn)2種16行、共點(diǎn)播240粒。 F2:3家系中每一株系至少保證15株以上，每隔5行種值感病對(duì)照和誘發(fā)材料。誘發(fā)材料 為京雙16,感病對(duì)照為輝縣紅。用掃拂法人工接種E09分生孢子，待誘發(fā)材料充分發(fā)病后， 于抽穗期和開(kāi)花期各進(jìn)行一次抗病性鑒定，以發(fā)病最重的一次作為抗性評(píng)價(jià)依據(jù)。成株期 侵染型，參照修改過(guò)的CIMMYT的葉部病害0-9級(jí)方法，并根據(jù)0-4級(jí)侵染型葉片病斑表現(xiàn) 確定最后定級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)，0-2級(jí)屬于抗病單株，3和4級(jí)屬于感病單株。成株期白粉病0-4級(jí) 侵染型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如圖2示。用X2檢驗(yàn)對(duì)各群體抗病性鑒定所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行分離比適合度測(cè) 驗(yàn)，從而確定CH7086所含抗白粉基因的數(shù)目。
[0027] 三、F2:3群體的分子標(biāo)記分析
[0028] 1、總 DNA 提取采用 SDS 法（Yang 等· Hereditas, 2005, 142:80-85)。
[0029] 2、分子標(biāo)記分析：PCR反應(yīng)體系總體積為15 μ L，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min， 94°C變性lmin，55?60°C退火45s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 8%聚丙烯酰胺非變性膠分離。
[0030] 四、功能性標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用
[0031] 利用小麥2BL染色體與水稻第4染色體的共線性關(guān)系，將小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www. wheat, pw. usda. gov)公布的小麥 2BL FL0. 50-1. 00 區(qū)段內(nèi)的所有 EST 序列 與水稻的第4染色體基因組進(jìn)行Blastn分析，選擇與水稻同源的EST，利用Primer3. 0軟 件設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記。同時(shí)將開(kāi)發(fā)標(biāo)記在CH7086/臺(tái)長(zhǎng)29的F2分離群體進(jìn)行標(biāo)記應(yīng)用分 析，其具體步驟如下：
[0032] (1)以CH7086/臺(tái)長(zhǎng)29的F2代群體基因組DNA為模板，開(kāi)發(fā)的功能性分子標(biāo)記為 引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為 15 μ L，含 IOXbufferL 5 μ LUOmM dNTPO. 15 μ L、2 μ M 弓丨物2· 0μ L、5U TaqDNA聚合酶0· 15μ L、50ng基因組DM2. 0μ L，去離子水補(bǔ)足至15μ L ; 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，57°C退火45s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)， 72°〇延伸511^11，41：保存?zhèn)溆?；
[0033] (2)PCR產(chǎn)物檢測(cè)，用2%瓊脂糖凝膠電泳，將15μ L PCR產(chǎn)物和10μ L上樣緩沖液 混合點(diǎn)樣，Iiov電泳I. 5h，EB染色拍照；
[0034] 五、Pm51基因區(qū)段的小麥-水稻基因組共線性關(guān)系構(gòu)建
[0035] 選用與抗白粉病基因 Pm51連鎖的EST序列，搜索比對(duì)水稻和短柄草基因組序列數(shù) 據(jù)庫(kù)尋找與Pm51對(duì)應(yīng)的水稻和短柄草基因。
[0036] 六、數(shù)據(jù)分析
[0037] 抗性分離群體F2、F2:3中觀測(cè)值和理論期望值的適合度分析采用卡方檢驗(yàn)（X 2)。 遺傳連鎖圖用Joinmap4. 0軟件分析計(jì)算，繪制連鎖圖用Mapdraw V2. 1軟件。
[0038] 七、結(jié)果與分析
[0039] 1、苗期白粉病鑒定分析
[0040] 用4種白粉菌生理小種E09、E20、E21和E26在2-4葉期分別對(duì)各供試材料進(jìn)行白 粉病抗性鑒定，CH7086攜帶的抗白粉病基因很可能來(lái)源于其野生供體親本十倍體長(zhǎng)穗偃麥 草。
[0041] 用白粉病流行生理小種E09對(duì)4個(gè)雜交組合的抗病親本、感病親本和F1群體進(jìn)行 苗期抗性鑒定說(shuō)明CH7086的白粉病苗期抗性受顯性基因控制。
[0042] 表1小偃麥漸滲系、八倍體小偃麥及其親本苗期離體白粉病鑒定結(jié)果
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種小麥白粉病抗病基因Pm51的分子標(biāo)記，其特征在于，核苷酸序列為： 上游引物：5' -AGAAGGCACACTGCTGGAAC-3'， 下游引物：5'-ACATGAGTGAGITGTGAGTC-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在小麥抗白粉病基因Pm51鑒定中的應(yīng)用。
3. -種小麥抗白粉病基因Pm51的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 以CH7086/臺(tái)長(zhǎng)29的F2代群體基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記 為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為 15 iiL，含 IOXbufferL 5 ii LUOmM dNTP 0.15 iiL、 2ilM引物2.0ilL、5UTaqDNA聚合酶0.15ilL、50ng基因組DNA2.0ilL，去離子水補(bǔ)足至 15uL;擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，57°C退火45s，72°C延伸lmin，34個(gè) 循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存?zhèn)溆茫? (2) PCR產(chǎn)物檢測(cè)，用2 %瓊脂糖凝膠電泳，將15 ii L PCR產(chǎn)物和10 ii L上樣緩沖液混合 點(diǎn)樣，IlOV電泳I. 5h，EB染色拍照； (3) 分析鑒定，能擴(kuò)增出500bp的特異條帶，說(shuō)明待測(cè)小麥種質(zhì)中存在抗白粉病基因 Pm51，否則，待測(cè)小麥種質(zhì)中不存在抗白粉病基因Pm51。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104313021SQ201410562997
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】詹海仙, 李欣, 暢志堅(jiān), 楊足君, 郭慧娟, 賈舉慶, 田志剛, 張曉軍, 喬麟軼 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所