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      一種酶活提高的天冬酰胺酶突變體的制作方法

      文檔序號(hào):491623閱讀:515來(lái)源:國(guó)知局
      一種酶活提高的天冬酰胺酶突變體的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酶活提高的天冬酰胺酶突變體,屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變的方式,將天冬酰胺酶分子內(nèi)部親水性的氨基酸天冬酰胺、纈氨酸突變成疏水性強(qiáng)的酪氨酸、色氨酸、異亮氨酸,改變了分子內(nèi)部疏水性,顯著提高菌株表達(dá)天冬酰胺酶的酶活力,并將天冬酰胺酶酶活提高了2.57倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力顯著提高,更適合工業(yè)應(yīng)用,可降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率。
      【專利說(shuō)明】一種酶活提高的天冬酰胺酶突變體

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及一種酶活提高的天冬酰胺酶突變體,屬于酶工程領(lǐng)域。

      【背景技術(shù)】
      [0002] L-天冬酰胺酶(EC3. 5. I. 1)是一種有抗癌活性的蛋白酶,能專一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對(duì)某些腫瘤的抑制作用,尤 其對(duì)急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物, 對(duì)骨髓細(xì)胞沒(méi)有抑制作用。
      [0003] L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的 還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過(guò)程中通過(guò)美拉德反應(yīng)生成,在食物中加入天冬酰胺酶可以 水解天冬酰胺,從源頭上減少丙烯酰胺的生成。
      [0004] -些微生物、哺乳動(dòng)物及植物被證實(shí)含有L-天冬酰胺酶。因?yàn)閯?dòng)物血清中L-天 冬酰胺酶含量低,且提取工藝復(fù)雜,微生物具有易培養(yǎng),成本低等優(yōu)點(diǎn),成為學(xué)者研究的重 點(diǎn),目前研究的產(chǎn)L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、 Erwinia chrysanthemi等,但野生菌株L-天冬酰胺酶產(chǎn)量低,近年來(lái)利用基因工程技術(shù)將 L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中,獲得L-天冬酰胺酶的高效表達(dá),利用工程菌產(chǎn)L-天 冬酰胺酶已成為一個(gè)重要來(lái)源。
      [0005] L-天冬酰胺酶有兩種類型,L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II, Escherichiacoli、Erwinia chrysanthemi、B. subtilis 等均包含這兩種 L-天冬醜胺 酶,研究證實(shí)僅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用,來(lái)自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被開(kāi)發(fā)為治療急性淋巴細(xì)胞白血病的有效藥物,目前 研究的大部分是具有抗腫瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
      [0006] 本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變改變蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性,從而進(jìn)一步提高天冬酰胺酶 酶活。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007] 本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供一種酶活力提高的天冬酰胺酶突變體,所述突變是 對(duì)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的來(lái)源于枯草芽孢桿菌的天冬酰胺酶蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸 進(jìn)行定點(diǎn)突變,從而提高了天冬酰胺酶的活性。
      [0008] 所述突變是將天冬酰胺酶第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼峄蛏彼?,得?突變體N133Y、N133W ;或?qū)?43位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?,得到突變體V143I ;或在將143 位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬耐瑫r(shí),將第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)樯彼峄蚶野彼幔?得到突變體 N133W/V143I、N133Y/V143I。
      [0009] 天冬酰胺酶突變體 N133Y、N133W、V143I、N133W/V143I、N133Y/V143I 的氨基酸序 列分別如SEQ ID NO. 2-6所示。
      [0010] 本發(fā)明解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供構(gòu)建所述突變體的方法,是通過(guò)定點(diǎn)突變技 術(shù)將天冬酰胺酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼帷⑸彼?;或?qū)?43 位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?;或在?43位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬耐瑫r(shí),將第133位的 天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼峄蛏彼帷?br> [0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,將含有編碼天冬酰胺酶的基因與載體PET22M+)連 接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli rosetta。挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)12h,轉(zhuǎn) 接到TB培養(yǎng)基中,接種量為3%。菌體長(zhǎng)到0D_為1. 5時(shí),加入IPTG誘導(dǎo),并將培養(yǎng)溫度 降到30°C,培養(yǎng)24h。收集發(fā)酵上清,純化獲得天冬酰胺酶突變體。
      [0012] 本發(fā)明還提供一株天冬酰胺酶分泌能力增強(qiáng)的大腸桿菌,是將含有編碼天冬酰胺 酶的基因與表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
      [0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,將含有編碼天冬酰胺酶的基因與載體PET22M+)連 接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. colirosetta。
      [0014] 本發(fā)明還提供一種提高天冬酰胺酶活力的方法,是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示的天冬酰胺酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼?、色氨酸;或?qū)?143位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔换蛟趯?43位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬耐瑫r(shí),將第133 位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼峄蛏彼帷?br> [0015] 本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變的方式,將天冬酰胺酶分子內(nèi)部親水性的氨基酸天冬酰胺、 纈氨酸突變成疏水性強(qiáng)的酪氨酸、色氨酸、異亮氨酸,改變了分子內(nèi)部疏水性,顯著提高菌 株表達(dá)天冬酰胺酶的酶活力,并將天冬酰胺酶酶活提高了 2. 57倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力 顯著提高,更適合工業(yè)應(yīng)用,可降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率。

      【專利附圖】

      【附圖說(shuō)明】
      [0016] 圖1突變體酶活

      【具體實(shí)施方式】
      [0017] LB 培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L,pH7. 0 ;
      [0018] TB 培養(yǎng)基:蛋白胨 12g/L,酵母膏 24g/L,甘油 8g/L,17mmol/LKH2P04, 72mmol/ LK2HPO4。
      [0019] 采用分光光度法測(cè)定天冬酰胺酶酶活,1個(gè)單位天冬酰胺酶酶活定義為:酶活 定義:在37°C反應(yīng)條件下,每分鐘內(nèi)能催化L-天冬酰胺釋放1 μ mol NH3所需要的酶量 為一個(gè)酶活單位(U/ml)。酶活測(cè)定條件:37°C條件下,ImllOmM K2HP04-KH2P04(PH7. 5), 0. lmll89mM天冬酰胺,0. 3ml發(fā)酵上清液,保溫30分鐘,0. lmll.5MTCA終止反應(yīng)。利用 ShimadzuUV-1240在436nm處測(cè)定吸光值,通過(guò)硫酸銨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶 活。
      [0020] 實(shí)施例1高效分泌天冬酰胺酶菌株構(gòu)建
      [0021] 以NdeI、BamHI為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),對(duì)質(zhì)粒pMA0911-wapA-SP_ansZ(片段) 及pET22b(+)質(zhì)粒(載體)進(jìn)行雙酶切,利用膠回收試劑盒對(duì)酶切后質(zhì)粒進(jìn)行純化回收, 電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度?;厥蘸蟮哪康幕颍╳apA-SP-ansZ)與載體pET22b(+)進(jìn)行 連接,連接體系:目的基因(wapA-SP-ansZ) 4 μ L,載體(pET22b (+)) 1 μ L,solutionI5 μ L, 16°C過(guò)夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET22b-wapA-SP/ansZ轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E. coil JM109, 轉(zhuǎn)化氨芐青霉素 LB平板,挑取陽(yáng)性菌落。如圖1。37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,命名為 pET22b-wapA-SP/ansZ,酶切驗(yàn)證正確后,轉(zhuǎn)化子由上海生工進(jìn)行測(cè)序。
      [0022] WapA-SP-ansZ基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示。
      [0023] 實(shí)施例2高分泌能力天冬酰胺酶生產(chǎn)菌株的驗(yàn)證
      [0024] 將實(shí)施例1中測(cè)序正確的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli rosetta。挑選轉(zhuǎn)化子接種 到LB液體培養(yǎng)基中,37°C,培養(yǎng)12h,轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中,接種量為3%。菌體長(zhǎng)到0D_為 1. 5時(shí),加入IPTG誘導(dǎo),并將培養(yǎng)溫度降到30°C,培養(yǎng)24h。收集發(fā)酵上清,檢測(cè)發(fā)酵上清酶 活,結(jié)果顯示,天冬酰胺酶被分泌到胞外。酶活力為2. 68U/ml。
      [0025] 實(shí)施例3高活性及熱穩(wěn)定突變株的獲得
      [0026] 利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖校═aKaRa),設(shè)計(jì)3對(duì)引物(如表1示),以已構(gòu)建的 pET22b-wapA-SP/ansZ為模版,進(jìn)行PCR,將天冬酰胺酶分子內(nèi)部133位的天冬酰胺分別突 變?yōu)槔野彼?、色氨酸?43位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?,分別命名為N133Y、N133W、V143I。 PCR 反應(yīng)條件為:95°C 5min,34 個(gè)循環(huán)(95°C 5min、60°C 30s、72°C 5min40s),72°C lOmin。 PCR 擴(kuò)增體系:模板 I μ L,上下游引物各 I μ L,dNTP Mix4y L,5XprimeSTAR BufferlOy L, 滅菌的雙蒸水32. SyUprimeSTAR DNA聚合酶0.5 μ L。采用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物 進(jìn)行純化和回收,電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。轉(zhuǎn)化子由上海生工進(jìn)行測(cè)序,轉(zhuǎn)化子命名為 pET-22b (+) -asp-N133Y、pET-22b (+) -asp-N133W、pET-22b (+) -asp-V143I。
      [0027] 以測(cè)序正確的菌株pET-22b(+)-asp-V143I的質(zhì)粒為模版,對(duì)天冬酰胺酶分子 內(nèi)部133位的天冬酰胺進(jìn)行復(fù)合突變,分別突變?yōu)槔野彼帷⑸彼?,命名為V143I/N133Y、 V143I/N133W、轉(zhuǎn)化子由上海生工進(jìn)行測(cè)序,轉(zhuǎn)化子命名為pET-22b (+) -asp-V143I/N133Y、 pET-22b(+)-asp-V143I/N133W。
      [0028] 實(shí)施例4高產(chǎn)天冬酰胺酶生產(chǎn)菌株的驗(yàn)證
      [0029] 將測(cè)序正確的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta(DE3),挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng) 基中,37°C,培養(yǎng)12h,轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中,接種量為3%。菌體長(zhǎng)到0D_為1.5時(shí),加入 IPTG誘導(dǎo),并將培養(yǎng)溫度降到30°C,培養(yǎng)24h。收集發(fā)酵上清,檢測(cè)發(fā)酵上清酶活,結(jié)果如 圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與出發(fā)菌株比較,酶活力均有顯著提高,WT、N133Y、N133W、V143I、 N133Y/V143I、N133W/V143I 酶活力分別為 2· 68、4· 36、4· 51、3· 91、5· 33、6· 89U/ml 且復(fù)合突 變菌株pET-22b(+)-asp-V143I/N133Y胞外酶活提高到6.89U/ml,較出發(fā)菌株提高2.57倍。
      [0030] 表1弓丨物序列
      [0031]

      【權(quán)利要求】
      1. 一種酶活力提高的天冬酰胺酶突變體,是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的天冬 酰胺酶第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼峄蛏彼幔换驅(qū)?43位的纈氨酸突變?yōu)楫惲?氨酸;或在將143位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬耐瑫r(shí),將第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)樯?氨酸或酪氨酸。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的天冬酰胺酶突變體,其特征在于,天冬酰胺酶突變體的氨基 酸序列分別如SEQ ID NO. 2-6所示。
      3. -種獲得權(quán)利要求1所述突變體的方法,是通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將天冬酰胺酶蛋白質(zhì) 分子內(nèi)部第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼?、色氨酸;或?qū)?43位的纈氨酸突變?yōu)楫惲?氨酸;或在將143位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬耐瑫r(shí),將第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔?氨酸或色氨酸。
      4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,將含有編碼天冬酰胺酶的基因與載體 pET22b(+)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli rosetta ;挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中,37°C 培養(yǎng)12h,轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中,接種量為3% ;菌體長(zhǎng)到0D6QQ為1.5時(shí),加入IPTG誘導(dǎo),并 將培養(yǎng)溫度降到30°C,培養(yǎng)24h,收集發(fā)酵上清,純化獲得天冬酰胺酶突變體。
      5. -種表達(dá)權(quán)利要求1所述天冬酰胺酶突變體的大腸桿菌,是將含有編碼天冬酰胺酶 的基因與表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的大腸桿菌,其特征在于,將含有編碼天冬酰胺酶的基因與載 體pET22b(+)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli rosetta。
      7. 權(quán)利要求1所述天冬酰胺酶突變體的應(yīng)用。
      8. 權(quán)利要求5所述大腸桿菌的應(yīng)用。
      9. 一種提高天冬酰胺酶活力的方法,其特征在于,是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 示的天冬酰胺酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第133位的天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼帷⑸彼?;或?qū)?43 位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔换蛟趯?43位的纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬耐瑫r(shí),將第133位的 天冬酰胺分別突變?yōu)槔野彼峄蛏彼帷?br> 【文檔編號(hào)】C12N9/82GK104371993SQ201410568323
      【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
      【發(fā)明者】劉松, 馮岳, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 陳雙全, 王廣圣, 陳璇 申請(qǐng)人:江南大學(xué)
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