多重核酸檢測(cè)方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于單分子克隆擴(kuò)增和后續(xù)檢測(cè)核酸分子的方法和系統(tǒng)，且本發(fā)明尤其涉及判斷單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms；SNPs)、突變和診斷與這些核酸分子變化有關(guān)的疾病。
【專利說明】多重核酸檢測(cè)方法和系統(tǒng)
[0001] 本申請(qǐng)是中國(guó)專利申請(qǐng)201080024654. 8的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及基于單分子克隆擴(kuò)增和核酸分子后續(xù)檢測(cè)的方法和系統(tǒng)，且本發(fā)明尤 其涉及判斷單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms ;SNPs)、突變和診斷與這 些核酸分子變化有關(guān)的疾病。

【背景技術(shù)】
[0003] 數(shù)十年來，聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction ;PCR)已被廣泛地用于核 酸分析的許多領(lǐng)域。單分子PCR(也稱為數(shù)字PCR)是PCR技術(shù)相對(duì)較新的發(fā)展。在單分子 PCR中，樣品被稀釋且分配至許多單個(gè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，平均每一個(gè)反應(yīng)具有少于一個(gè)的拷 貝模板。一些反應(yīng)沒有模板分子，一些反應(yīng)具有大于一個(gè)拷貝的模板分子，且一定百分比的 反應(yīng)剛好具有一個(gè)拷貝的模板。所有反應(yīng)平行進(jìn)行。在這些反應(yīng)中，始于一個(gè)拷貝的模板 分子的克隆擴(kuò)增子可使用本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)到。關(guān)于樣品中是否具有特定的目標(biāo)分 子，分析結(jié)果提供"是"或"否"二進(jìn)制信號(hào)，例如〇或1的數(shù)字格式。數(shù)字PCR中所有反應(yīng) 的結(jié)果，通過統(tǒng)計(jì)分析對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行定量。數(shù)字PCR將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)換為線性關(guān) 系，且數(shù)字PCR將傳統(tǒng)模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字格式。Vogelstein等人于1999年在Proc. Natl Acad. Sci. USA第96期第9236-9241頁和美國(guó)專利第6, 143, 496號(hào)對(duì)于數(shù)字PCR有更詳細(xì) 說明，所述論文和美國(guó)專利列為本文的參考文獻(xiàn)。
[0004] 數(shù)字PCR的應(yīng)用包括：早期癌癥診斷的基因突變檢測(cè)、評(píng)估等位基因不平衡、產(chǎn)前 基因測(cè)試、基因表達(dá)的定量分析和DNA甲基化狀態(tài)分析。Pohl等人Expert Rev. Mol. Diagn， 2004,4(1) :41-47 ;Blow, Nature Methods，2007,4(10) :869-875 ;Diel 等人 Curr Opin Oncol，2007,19 :36-42 ;Dressman 等人 PNAS，2003,100 (15) :8817-8822 ;Weisenberger 等 人Nucleic Acids Res.，2008,36(14) :4689-4698;所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。數(shù) 字PCR所基于的單分子擴(kuò)增原理還用于當(dāng)前的第二代DNA測(cè)序技術(shù)中，諸如，Roche Life Sciences 的 DNA 焦憐酸測(cè)序技術(shù)，Life Technologies 的 SOLiD DNA 測(cè)序技術(shù)和 Illumina 的DNA邊合成邊測(cè)序技術(shù)，用于測(cè)序模板制備。
[0005] 數(shù)字PCR的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為數(shù)字PCR在類似模板分子的較大背景下仍能檢測(cè)和定量罕 見序列變化（諸如，突變）的能力。這是因?yàn)槊恳粋€(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可獨(dú)立于樣品中的其他目標(biāo) 分子，因?yàn)橥ㄟ^限制稀釋模板分子被分配至單個(gè)PCR反應(yīng)中。此種能力可用于對(duì)體液（諸 如，來自結(jié)腸直腸癌患者的血漿樣品和大便樣品）進(jìn)行非侵入性早期癌癥檢測(cè)，如Diehl等 人 PNAS，2005,102 (45) :16368-16373 ;Diehl 等人 Gastroenterol.，2008,135 (2) :489-498 中所描述，所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。本技術(shù)還能夠在母親DNA存在的情況下進(jìn)行非 侵入性產(chǎn)前基因測(cè)試，如Lo等人PNAS，2007,104 (32) : 13116-13121中所描述，所述論文列 為本文的參考文獻(xiàn)。
[0006] 通過統(tǒng)計(jì)樣品中的陽性PCR反應(yīng)，可使用數(shù)字PCR進(jìn)行定量。通過判斷所得擴(kuò)增子 的標(biāo)識(shí)，可對(duì)變種DNA分子與野生型DNA分子之間的區(qū)別。根據(jù)這些結(jié)果統(tǒng)計(jì)計(jì)算變種DNA 分子與野生型DNA分子的比率。數(shù)字PCR還可以用于目標(biāo)分子的絕對(duì)定量。可在Dube等人 PLoS ONE，2008, 3(8)，e2876;Warren 等人的"The Digital Array Response Curve"（未發(fā) 表，見斯坦福大學(xué)網(wǎng)頁 thebigone. Stanford. edu/quake/publications/DigResCurve. pdf) 中發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR定量的更多細(xì)節(jié)，所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)?？赏ㄟ^增加被分析的目 標(biāo)分子的數(shù)量（即對(duì)更多PCR反應(yīng)進(jìn)行平行篩選），以改進(jìn)數(shù)字PCR的精確度和準(zhǔn)確性。
[0007] 當(dāng)前，位于美國(guó)加利福尼亞州南圣弗朗西斯科（South San Francisco)的 Fluidigm公司的384孔芯片或48X770數(shù)字陣列微流生物芯片（Digital Array Nanofluidic Biochip)可用于數(shù)字PCR。這些應(yīng)用中的大部分應(yīng)用利用實(shí)時(shí)PCR來分析每 一個(gè)反應(yīng)中的擴(kuò)增子。文獻(xiàn)中名稱為BEAMing的方法通過乳膠PCR在磁珠上產(chǎn)生克隆擴(kuò)增 子且使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來檢測(cè)和計(jì)數(shù)那些具有擴(kuò)增子的小珠。然而，這些數(shù)字PCR方法 因?yàn)槭芸捎脽晒馊緞┑墓鈱W(xué)分辨率的限制而具有有限的多重檢測(cè)能力。
[0008] 從單分子產(chǎn)生克隆擴(kuò)增子的其他方式包括滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification ;RCA)。RCA為等溫?cái)U(kuò)增方法，在所述方法中核酸探針經(jīng)雜交或連接到目標(biāo)核 酸分子上，接著，使用引物多次復(fù)制所述目標(biāo)核酸分子的序列，所述引物與探針序列部分互 補(bǔ)。可在 Eriksson 等人，J. Microbiol. Methods，2009, 78,195-202 ;Baner 等人，Nucl. Acids Res.，1998,26(22) :5073-5078 ;Baner 等人，Curr. Opinion Biotech.，2001，12,11-15 中發(fā) 現(xiàn)RCA和RCA應(yīng)用的更多詳細(xì)說明；所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。RCA還可用于第二代 DNA測(cè)序技術(shù)的樣品制備中，Drmanac等人，Science, 2010,327 :78-81,所述論文列為本文 的參考文獻(xiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于判斷多個(gè)標(biāo)識(shí)序列（IS)標(biāo)簽的編碼（ID碼）的 方法，所述方法包含：(a)在表面上固定多個(gè)分析物分子，其中每一個(gè)分析物分子包含一標(biāo) 識(shí)序列標(biāo)簽（IS標(biāo)簽），且所述標(biāo)識(shí)序列標(biāo)簽可與探針進(jìn)行雜交；(b)將來自標(biāo)記IS探針 (設(shè)定LISP)探針庫的一對(duì)標(biāo)識(shí)序列標(biāo)記IS探針（LISP)與所述IS標(biāo)簽的堿基審視位置 處進(jìn)行雜交，進(jìn)而并置所述一對(duì)LISP，其中所述的每一個(gè)LISP包含：（i)與探針雜交的所述 IS標(biāo)識(shí)簽序列互補(bǔ)的序列，以及（ii)與所述喊基審視位置處的指定喊基相關(guān)的標(biāo)記；（c) 用DNA連接酶連接所述一對(duì)并置的LISP ;(d)在所述分析物分子的所述IS標(biāo)簽上檢測(cè)所述 一對(duì)連接LISP上的所述標(biāo)記的存在，且根據(jù)所述一對(duì)連接的LISP的所述標(biāo)記組合，以判定 所述IS標(biāo)簽的所述堿基審視位置處的堿基組成；（e)使所述一對(duì)連接的LISP變性而脫離 所述分析物分子；（f)重復(fù)步驟（b)至步驟（e)，直到不重復(fù)地審視所述IS標(biāo)簽中的所有堿 基位置，且判定所述IS標(biāo)簽的所有堿基組成為止；（g)通過所述IS標(biāo)簽堿基組成與預(yù)設(shè)ID 碼的比較，判斷所述分析物分子上的所述IS標(biāo)簽的ID碼。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，在每一個(gè)連接循環(huán)中，可判定所述IS標(biāo)簽上的兩個(gè)指定堿基 位置，其中包括在所述配對(duì)LISP探針的每一側(cè)上的一個(gè)所述指定堿基位置。在一些實(shí)施 方式中，在每一個(gè)LISP庫中存在兩組探針，其中一組為所述3'端標(biāo)記IS探針（3'-LISP)， 所述3'端標(biāo)記IS探針包含5'端磷酸基和3'端標(biāo)記，且另一組為所述5'端標(biāo)記IS探針 (5' -LISP)，所述5'端標(biāo)記IS探針包含5'端標(biāo)記和3'端羥基。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，在兩組LISP上存在四個(gè)不同的標(biāo)記，其中每一個(gè)標(biāo)記代表所 述堿基審視位置處的一個(gè)指定堿基（A、C、G、T)。在每一個(gè)LISP庫中包含所有所述審視位 置處可能堿基組合所需要的所有探針。在一些實(shí)施方式中，在每一個(gè)連接循環(huán)中使用不同 LISP庫；且在每一個(gè)連接循環(huán)中依序?qū)徱曀鯥S標(biāo)簽上的不同堿基位置。
[0012] 在一些實(shí)施方式中，所述LISP上的所述標(biāo)記為熒光染劑、電化學(xué)標(biāo)記或納米顆 粒。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，所述堿基審視位置處在從每一個(gè)LISP的連接點(diǎn)起的5個(gè)堿基 內(nèi)，且優(yōu)選地在3個(gè)堿基內(nèi)，以在所述成對(duì)探針連接步驟中保持所述堿基識(shí)別特異性。
[0014] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供分析樣品中的目標(biāo)核酸序列的方法，所述方法包含： (a)從樣品中產(chǎn)生多個(gè)第一模板分子和多個(gè)第二模板分子，其中所述第一模板分子包含第 一目標(biāo)核酸序列和第一標(biāo)識(shí)序列（IS)標(biāo)簽，且所述第二模板分子包含第二目標(biāo)核酸序列 和第二IS標(biāo)簽，且其中所述第一 IS標(biāo)簽構(gòu)成第一標(biāo)識(shí)（ID)碼且所述第二IS標(biāo)簽構(gòu)成第 二ID碼；(b)利用克隆擴(kuò)增所述第一模板分子以產(chǎn)生第一群組克隆擴(kuò)增子，且利用克隆擴(kuò) 增所述第二模板分子以產(chǎn)生第二群組克隆擴(kuò)增子，其中所述第一群組克隆擴(kuò)增子和所述第 二群組克隆擴(kuò)增子在空間上分開定位；以及（c)識(shí)別所述克隆擴(kuò)增子的所述IS標(biāo)簽的所述 ID碼，以判斷所述克隆擴(kuò)增子代表的所述目標(biāo)核酸序列。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含：通過分析所述第一群組克隆擴(kuò)增子和 所述第二群組克隆擴(kuò)增子的序列狀態(tài)，判斷所述目標(biāo)核酸序列的相應(yīng)序列狀態(tài)。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含：定量來自每一個(gè)模板分子的克隆擴(kuò)增 子的群組數(shù)量，以推斷所述樣品中的每一個(gè)目標(biāo)核酸序列的量。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包含：在表面上固定所述第一群組克隆擴(kuò)增 子和第二群組克隆擴(kuò)增子。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)核酸序列選自由以下組成的群組：基因體DNA、cDNA 和 RNA。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，使用引物通過酶促反應(yīng)，以產(chǎn)生所述第一和第二模板分子，其 中所述引物包含所述IS標(biāo)簽和序列，所述序列與所述目標(biāo)核酸序列中的至少一部分為互 補(bǔ)的序列，且其中維持所述樣品中的所述兩個(gè)目標(biāo)核酸序列的數(shù)量比。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，通過酶促擴(kuò)增或復(fù)制，在所述表面上產(chǎn)生所述第一和第二群 組克隆擴(kuò)增子，其中用于克隆擴(kuò)增或復(fù)制的至少兩個(gè)引物接合于所述表面上且在空間上分 開。
[0021] 在一些實(shí)施方式中，在多個(gè)水性液滴中進(jìn)行所述克隆擴(kuò)增，每一個(gè)水性液滴包含： DNA擴(kuò)增試劑，所述DNA擴(kuò)增試劑包括多個(gè)引物；以及微粒，其中至少一個(gè)引物接合于所述 微粒的表面上。在一些實(shí)施方式中，所述水性液滴由油包水型乳膠形成，且所述水性液滴含 于反應(yīng)容器中，其中所述反應(yīng)容器含有油相，且所述油相包含與水不混溶的液體。
[0022] 在一些實(shí)施方式中，所述DNA擴(kuò)增為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，在親水反應(yīng)點(diǎn)上進(jìn)行模板分子的所述克隆擴(kuò)增，而所述親水 反應(yīng)點(diǎn)在疏水表面上形成圖案化，其中每一個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)包含所述水性液滴。在一些實(shí)施 方式中，所述親水反應(yīng)點(diǎn)由所述與水不混溶的液體覆蓋，以在所述克隆擴(kuò)增期間防止水相 蒸發(fā)且隔離各單個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，所述克隆擴(kuò)增通過所述單鏈模板分子的環(huán)化，且由DNA聚合 酶在延伸寡核苷酸上進(jìn)行后續(xù)的等溫滾環(huán)擴(kuò)增（RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5'末端接 合于所述表面上且其3'末端處與所述環(huán)化模板分子互補(bǔ)，且所述延伸寡核苷酸包含用于 酶促延伸的3'端羥基（3'-OH基）。在一些實(shí)施方式中，通過酶促延伸產(chǎn)生至少兩個(gè)拷貝的 所述環(huán)化模板分子序列。在一些實(shí)施方式中，通過在所述延伸寡核苷酸上連接所述模板分 子的兩個(gè)末端，進(jìn)行所述模板分子的所述環(huán)化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述 核酸序列為所述模板分子制備時(shí)所用引物序列中的一部分。在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)化 模板分子的長(zhǎng)度介于40個(gè)堿基與400個(gè)堿基之間，且長(zhǎng)度優(yōu)選地介于60個(gè)堿基與200個(gè) 堿基之間。
[0025] 在一些實(shí)施方式中，對(duì)所述不同模板分子中的至少兩個(gè)模板分子來說，所述兩個(gè) 末端處的所述特定的核酸序列為相同的或不同的。
[0026] 在一些實(shí)施方式中，所述克隆擴(kuò)增子直接連合至磁性微粒的所述表面，且其中通 過物理力或通過化學(xué)鍵結(jié)，在所述表面上固定所述磁性微粒。
[0027] 在一些實(shí)施方式中，通過標(biāo)記探針的依序連接循環(huán)或通過DNA測(cè)序技術(shù)，同時(shí)判 斷所述克隆擴(kuò)增子的所述ID碼，且所述ID碼顯示出每一群組克隆擴(kuò)增子所代表的所述目 標(biāo)核酸序列。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種用于涵蓋多重核酸分析的試劑盒。所述試劑盒的一 實(shí)施方式包含：酶促反應(yīng)引物，其中所述引物含有各種IS標(biāo)簽，以在模板分子制備中進(jìn)行 基因特異性預(yù)擴(kuò)增；以及標(biāo)記探針庫，其中所述標(biāo)記探針庫包含多個(gè)LISP探針。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖Ia為將IS標(biāo)簽嵌入模板分子和克隆擴(kuò)增的方法示意圖。圖Ib為將IS標(biāo)簽嵌 入模板分子和克隆擴(kuò)增的另一個(gè)方法示意圖。圖Ic為通過單分子滾環(huán)擴(kuò)增將IS標(biāo)簽嵌入 模板分子和克隆擴(kuò)增的方法示意圖。
[0030] 圖2為流動(dòng)室和流動(dòng)室內(nèi)部磁性微粒分布的示意圖。
[0031] 圖3圖示一系列單個(gè)PCR反應(yīng)液滴，該等反應(yīng)液滴在圖案化表面上含有磁性微粒， 所述圖案化表面由油層覆蓋，在過度去除油后由外部磁力將這些磁性微粒維持于表面上。
[0032] 圖4示出用于IS標(biāo)簽測(cè)定的依序成對(duì)探針連接化學(xué)作用的原理。
[0033] 圖5a :表1顯示來自IS標(biāo)簽的可能ID碼的色碼和相應(yīng)的堿基組成的實(shí)例。圖5b : 表2顯示特定的堿基碼。表3顯示同義的堿基碼。
[0034] 圖6示出轉(zhuǎn)移ID窗口以供依序成對(duì)探針連接的原理。
[0035] 圖7圖示系統(tǒng)的實(shí)例。
[0036] 圖8圖示使用多重核酸分析進(jìn)行非侵入性癌癥早期檢測(cè)的實(shí)例。
[0037] 圖9示出本發(fā)明的示范性實(shí)施方式。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 本發(fā)明提供用于同時(shí)分析多個(gè)目標(biāo)核酸序列的方法和系統(tǒng)，諸如用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證 以及臨床診斷的多個(gè)生物標(biāo)記檢測(cè)。
[0039] A.由標(biāo)識(shí)序列標(biāo)簽進(jìn)行多重核酸分析
[0040] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供分析樣品中的目標(biāo)核酸序列的方法。
[0041] 如本文中所概述，在一些實(shí)施方式中，目標(biāo)序列包含需要序列信息的位置，在本文 中通常稱為"檢測(cè)位置"或"檢測(cè)位點(diǎn)"。在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)位置為單核苷酸，但是在 一些實(shí)施方式中，檢測(cè)位置可包含多個(gè)核苷酸，既可彼此接近也可由一或更多個(gè)核苷酸分 離開來。如本文所用的"多個(gè)"表示至少兩個(gè)。
[0042] 如本文所用，與雜合體中的檢測(cè)位置堿基進(jìn)行堿基配對(duì)的堿基稱為"讀出位置"或 "審視位置"；因此本發(fā)明的許多探針包含審視位置。在一些實(shí)施方式中，如本文中所概述， 目標(biāo)序列可能不是樣品目標(biāo)序列而是擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，在本文中有時(shí)稱為"衍生"目標(biāo)序列、 "模板分子"或擴(kuò)增子。本文中，用"擴(kuò)增子"表示核酸分子，所述核酸分子通過擴(kuò)增方法生 成。通常，由PCR方法（包括多重PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增子可能為雙鏈DNA分子或單鏈DNA 分子。如下所述，可使用能增加其中一鏈的擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的擴(kuò)增子包括目標(biāo)核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò) 增子含有核酸目標(biāo)鏈和第二核酸目標(biāo)鏈，所述核酸目標(biāo)鏈由本文所述的方法擴(kuò)增，所述核 酸目標(biāo)鏈含有如下文所述的兩個(gè)或兩個(gè)以上目標(biāo)域，所述第二核酸目標(biāo)鏈與第一核酸鏈互 補(bǔ)。用"單鏈目標(biāo)核酸"、"單鏈目標(biāo)"、"單鏈目標(biāo)序列"或所述術(shù)語語法上的等效物表示用 于本發(fā)明的擴(kuò)增方法的起始材料。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的目標(biāo)序列含有與探針序 列大體上互補(bǔ)的區(qū)域，如本文中所定義。
[0044] 包含目標(biāo)序列的樣品可實(shí)際上來自任意有機(jī)體和任意源，所述有機(jī)體和源包括但 不限于體液（包括但不限于，實(shí)際上任意有機(jī)體樣品的血液、骨髓、尿、排泄物、淚液、血清、 淋巴液、唾液、肛門和陰道分泌物、汗液、精液和其他體液，任意有機(jī)體諸如包括人類的哺乳 動(dòng)物）；細(xì)菌和病菌（包括病毒）的細(xì)胞裂解物；硬組織（例如器官，諸如肝臟、脾臟、腎、心 臟、肺等）；環(huán)境樣品（包括但不限于，空氣樣品、農(nóng)業(yè)樣品、水樣品和土壤樣品）；生物戰(zhàn)劑 樣品；研究樣品（即，樣品可為擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括諸如PCR擴(kuò)增反應(yīng)的目標(biāo) 擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增，如通常在W099/037819中所描述，所述專利列為本文的參考文獻(xiàn)）；純化 樣品，諸如純化基因體DNA、RNA、蛋白質(zhì)等；原樣（細(xì)菌、病毒、基因體DNA等）；如將為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所認(rèn)知，可對(duì)樣品進(jìn)行任意實(shí)驗(yàn)操作。如果需要的話，那么使用已知的技術(shù)來制 備目標(biāo)序列。例如，可使用已知的裂解液、電穿孔等，處理樣品以溶解細(xì)胞，其中根據(jù)需要進(jìn) 行純化和/或擴(kuò)增，如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)。
[0045] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供基因特異性預(yù)擴(kuò)增的方法，將設(shè)定的IS標(biāo)簽和IS碼嵌入 基于目標(biāo)核酸序列所產(chǎn)生的擴(kuò)增子。
[0046] 基因特異性預(yù)擴(kuò)增已廣泛用于核酸分析，諸如，基因分型、基因表達(dá)分析和臨床診 斷中的樣品制備。Li 等人，Nucleic Acids Res·，1996,24 :538-539 ;Mengual 等人，BMC Research Notes，2008 年 6 月，I :21 ;Xia 等人，Genet. Mol. Biol. ;2009 :20-24 ;Arneson 等人，Cold Spring Harb. Protoc, "Whole-Genome Amplification by Improved Primer Extension Preamplification PCR(I-PEP-PCR) "，2008 ;所有論文列為本文的參考文獻(xiàn)。
[0047] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包含：從樣品中產(chǎn)生多個(gè)第一模板分子和多個(gè) 第二模板分子，第一模板分子包含第一目標(biāo)核酸序列和第一標(biāo)識(shí)序列（IS)標(biāo)簽，且第二模 板分子包含第二目標(biāo)核酸序列和第二IS標(biāo)簽，并且第一 IS標(biāo)簽構(gòu)成第一 ID碼且第二IS 標(biāo)簽構(gòu)成第二ID碼。
[0048] 在一些實(shí)施方式中，使用引物，通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生第一和第二模板分子，所述引物 包含IS標(biāo)簽和序列，所述序列與目標(biāo)核酸序列中的至少一部分互補(bǔ)，其中保留樣品中的兩 個(gè)目標(biāo)核酸序列的數(shù)量比。
[0049] 本文中，用"標(biāo)識(shí)序列（IS)標(biāo)簽"表示較短人造 DNA序列，所述較短人造 DNA序列 用于樣品分析物間識(shí)別特定目標(biāo)分子的編碼。在一些實(shí)施方式中，IS的長(zhǎng)度小于6個(gè)堿基 或小于10個(gè)堿基。IS標(biāo)簽還可包含額外的核酸序列，所述額外的核酸序列在解碼處理期間 為探針雜交所需要。通常，將IS標(biāo)簽設(shè)計(jì)為不同于核酸分析中目標(biāo)基因體序列。在一些實(shí) 施方式中，引入這些IS標(biāo)簽作為樣品制備中的一部分。
[0050] 本文中，用"標(biāo)識(shí)（ID)碼"表示分配給IS標(biāo)簽的代碼。每一個(gè)IS標(biāo)簽的堿基組 成對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定的ID碼。
[0051] 在一些實(shí)施方式中，第一和第二目標(biāo)核酸序列的豐度類似。在一些實(shí)施方式中，第 一目標(biāo)核酸序列比第二目標(biāo)核酸序列豐富至少100倍、1000倍或10, 〇〇〇倍。
[0052] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包含：通過第一模板分子的克隆擴(kuò)增產(chǎn)生第一 群組克隆擴(kuò)增子，且通過第二模板分子的克隆擴(kuò)增產(chǎn)生第二群組克隆擴(kuò)增子，其中第一群 組克隆擴(kuò)增子和第二群組克隆擴(kuò)增子在空間上分離定位。
[0053] 本文中，用"克隆擴(kuò)增子"或"擴(kuò)增子克隆"表示擴(kuò)增子群組，擴(kuò)增子群組可直接或 間接地追溯到分離的多核苷酸。本文中，用"克隆擴(kuò)增"表示分離且擴(kuò)增多核苷酸以產(chǎn)生"擴(kuò) 增子克隆"或"克隆擴(kuò)增子"的方法。
[0054] 本文中，用"在空間上分離定位"表示兩個(gè)或兩個(gè)以上群組擴(kuò)增子在空間上定位不 同。例如，不同群組擴(kuò)增子可定位于相同表面上的不同點(diǎn)上、或定位于不同表面上，諸如本 文所述的不同微粒表面上。
[0055] 在一些實(shí)施方式中，通過酶促擴(kuò)增或復(fù)制，在表面上產(chǎn)生第一和第二群組克隆擴(kuò) 增子，其中在克隆擴(kuò)增期間，用于擴(kuò)增或復(fù)制的至少兩個(gè)引物連接至表面且在空間上分離 開來。
[0056] 在一些實(shí)施方式中，多簇克隆擴(kuò)增子接合至表面上。克隆擴(kuò)增子直接或間接地連 接至表面。在一些實(shí)施方式中，克隆擴(kuò)增子接合至磁性微粒的表面，且通過本文所述或本領(lǐng) 域已知的物理力（例如，磁場(chǎng)）或通過化學(xué)鍵結(jié)，在表面上固定磁性微粒。
[0057] 在一些實(shí)施方式中，識(shí)別所述克隆擴(kuò)增子的IS標(biāo)簽的ID碼，以判定由本文所述的 克隆擴(kuò)增子代表的目標(biāo)核酸序列。
[0058] 在一些實(shí)施方式中，通過分析克隆擴(kuò)增子的所述群組序列狀態(tài)，判斷目標(biāo)核酸序 列的相應(yīng)序列狀態(tài)。
[0059] 本文中，用"序列狀態(tài)"表示序列特征，諸如單核苷酸多態(tài)、突變或甲基化。序列狀 態(tài)可由本領(lǐng)域已知或本文中所公開的方法進(jìn)行判斷，方法包括但不限于標(biāo)記探針連接、單 堿基延伸、DNA測(cè)序和熔解曲線分析。
[0060] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含：通過累加含有同一 IS標(biāo)簽的克隆 擴(kuò)增子群組數(shù)，定量來自每一個(gè)模板分子的克隆擴(kuò)增子的簇組數(shù)量，根據(jù)已知的用于樣品 制備中的稀釋倍率，以推斷樣品中的每一個(gè)目標(biāo)核酸序列的量。
[0061] 通常，單分子克隆擴(kuò)增中的模板分子的隨機(jī)分布遵循泊桑（Poisson)分布。C反應(yīng) 腔室中的M模板分子的隨機(jī)分布遵循泊桑分布。在給定反應(yīng)腔室中具有至少一個(gè)模板分子 的概率表示為P，
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種分析樣品中的目標(biāo)核酸序列的方法，所述方法包含： (a) 從樣品中產(chǎn)生多個(gè)第一模板分子和多個(gè)第二模板分子，其中所述第一模板分子包 含第一目標(biāo)核酸序列和第一標(biāo)識(shí)序列（IS)標(biāo)簽，且所述第二模板分子包含第二目標(biāo)核酸 序列和第二IS標(biāo)簽，并且其中所述第一 IS標(biāo)簽構(gòu)成第一標(biāo)識(shí)（ID)碼且所述第二IS標(biāo)簽 構(gòu)成第二ID碼； (b) 利用克隆擴(kuò)增所述第一模板分子以產(chǎn)生第一群組克隆擴(kuò)增子，且利用克隆擴(kuò)增所 述第二模板分子以產(chǎn)生第二群組克隆擴(kuò)增子，其中所述第一群組克隆擴(kuò)增子和所述第二群 組克隆擴(kuò)增子在空間上分開定位；和 (c) 識(shí)別所述克隆擴(kuò)增子的所述IS標(biāo)簽的所述ID碼，以判斷所述克隆擴(kuò)增子代表的所 述目標(biāo)核酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含：通過分析所述第一群組克隆擴(kuò)增 子和所述第二群組克隆擴(kuò)增子的序列狀態(tài)，判斷所述目標(biāo)核酸序列的相應(yīng)序列狀態(tài)。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含：定量來自每一個(gè)模板分子的克隆 擴(kuò)增子的群組數(shù)量，以推斷所述樣品中的每一個(gè)目標(biāo)核酸序列的量。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包含定量所述樣品中的所述參考序 列。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含：在表面上固定所述第一群組克隆 擴(kuò)增子和第二群組克隆擴(kuò)增子。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一目標(biāo)核酸序列和第二目標(biāo)核酸序列可為相 同的或可為不同的，且可以存在更多所述第一和第二目標(biāo)核酸序列。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)核酸序列選自由以下組成的群組：基因體 DNA、cDNA 和 RNA。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用引物通過酶促反應(yīng)，以產(chǎn)生所述第一模板分子 和第二模板分子，所述引物包含所述IS標(biāo)簽和序列，所述序列與所述目標(biāo)核酸序列中的至 少一部分為互補(bǔ)，且其中維持所述樣品中的所述兩個(gè)目標(biāo)核酸序列的數(shù)量比。
9. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中通過酶促擴(kuò)增或復(fù)制，在所述表面上產(chǎn)生所述第一 和第二群組克隆擴(kuò)增子，其中在所述克隆擴(kuò)增期間，用于所述擴(kuò)增或復(fù)制的至少兩個(gè)所述 引物是接合于所述表面且在空間上分開的。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述克隆擴(kuò)增在多個(gè)水性液滴中進(jìn)行，且每一個(gè)水 性液滴包含： DNA擴(kuò)增試劑，所述DNA擴(kuò)增試劑包括多個(gè)引物；和 微粒，其中至少一個(gè)所述引物是接合于所述微粒的表面上；和 所述模板分子。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述水性液滴由油包水型乳膠形成，且所述油包 水型乳膠置于反應(yīng)容器中，其中所述反應(yīng)容器含有與水不混溶的液體。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中在親水反應(yīng)點(diǎn)上進(jìn)行模板分子的所述克隆擴(kuò)增， 而所述親水反應(yīng)點(diǎn)在疏水表面上形成圖案化，且其中每一個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)包含所述水性液 滴。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述親水反應(yīng)點(diǎn)由與水不混溶的液體覆蓋，以在 所述克隆擴(kuò)增期間防止水相蒸發(fā)且隔離各單個(gè)親水反應(yīng)點(diǎn)。
14. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述DNA擴(kuò)增是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述克隆擴(kuò)增通過所述單鏈模板分子的環(huán)化由DNA 聚合酶在延伸寡核苷酸上進(jìn)行后續(xù)的等溫滾環(huán)擴(kuò)增（RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5' 末端接合于表面上，且其3'末端處與所述環(huán)化模板分子互補(bǔ)，且所述延伸寡核苷酸包含用 于酶促延伸的自由3'端羥基。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中通過在所述延伸寡核苷酸上連接所述單鏈模板分 子的所述兩個(gè)末端，進(jìn)行所述模板分子的環(huán)化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述 特定核酸序列為產(chǎn)生所述模板分子所用的引物序列中的一部分。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中對(duì)至少兩個(gè)所述不同的模板分子來說，所述兩個(gè) 末端處的所述特定的核酸序列為相同的或不同的。
18. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述環(huán)化模板分子的長(zhǎng)度介于40個(gè)堿基與400個(gè) 堿基之間。
19. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述微粒為磁性微粒。
20. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述克隆擴(kuò)增子直接接合于磁性微粒的所述表面， 且通過物理力或通過化學(xué)鍵結(jié)，在所述表面上固定所述磁性微粒。
21. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過標(biāo)記探針的依序連接循環(huán)或通過DNA測(cè)序技 術(shù)，同時(shí)判斷所述克隆擴(kuò)增子的所述ID碼，且所述每一群組克隆擴(kuò)增子的ID碼顯示出每一 群組克隆擴(kuò)增子所代表的所述目標(biāo)核酸序列。
22. -種用于多重核酸分析的試劑盒，所述試劑盒包含： 酶促反應(yīng)引物，其中一些所述引物包含標(biāo)識(shí)序列（IS)標(biāo)簽；以及 標(biāo)記探針庫，其中所述標(biāo)記探針庫包含多個(gè)標(biāo)記IS探針（LISP)。
23. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中每一個(gè)標(biāo)記探針庫包含兩組LISP，一組為 3' -LISP，而另一組為5' -LISP，且每一組LISP包含的所有探針含有一個(gè)指定堿基審視位 置處。
24. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中在每一組LISP上存在四個(gè)不同的標(biāo)記，每一個(gè) 標(biāo)記代表所述審視位置處的一指定堿基（A、C、G、T)，且在每一個(gè)LISP庫中包括所述審視位 置處所有可能堿基組合所需要的所有探針。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104404134SQ201410568510
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2009年4月3日
【發(fā)明者】蒂莫西·Z·劉 申請(qǐng)人:蒂莫西·Z·劉