菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記、篩選方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記、分子標(biāo)記引物、分子標(biāo)記篩選方法及上述三者在菊花新品種培育上的應(yīng)用。菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記包括主效QTL位點(diǎn)NoaE2G1、NoaE2G7、NoaE1H3、NoaE2H7、NoaE2H8的分子標(biāo)記。其篩選方法包括：(1)試驗(yàn)材料及其表型數(shù)據(jù)的獲得；(2)菊花連鎖圖譜構(gòu)建；(3)菊花抗蚜性狀的QTL定位；(4)菊花抗蚜性狀關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的確定。解決了目前菊花抗蚜性狀基因的精確定位和克隆的研究在國(guó)內(nèi)外幾乎空白這一現(xiàn)狀，篩選出與菊花蚜蟲抗性基因緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，建立菊花抗蚜性分子標(biāo)記輔助選擇體系，提高菊花抗蚜性選擇效率，為菊花新品種的選育奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記、篩選方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記、篩選方法及上述二者 在菊花抗蚜性狀優(yōu)良基因的定位、克隆及菊花新品種的培育上的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.)是經(jīng)長(zhǎng)期人工培育的我國(guó)傳統(tǒng)名花， 具有藥用、食用、觀賞和保健價(jià)值。蚜蟲是危害菊花的主要害蟲之一，其中以菊姬長(zhǎng)管蚜的 危害最為嚴(yán)重。蚜蟲不僅影響菊花的觀賞價(jià)值，而且大大降低菊花的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成極大 經(jīng)濟(jì)損失。目前，蚜蟲的防治多采用化學(xué)方法，但農(nóng)藥防治不僅消耗人力物力、造成蚜蟲的 抗藥性，還會(huì)造成環(huán)境的污染。因此，培育抗蚜性新品種、提高菊花的遺傳抗性是解決這個(gè) 問(wèn)題的最佳方法。
[0003] 傳統(tǒng)的雜交育種方法因耗時(shí)較長(zhǎng)，且無(wú)法定向改良特定性狀，在育種中存在 一定局限性。隨著育種工作的不斷深入，分子標(biāo)記輔助選擇育種（marker-assisted selection，MAS)為菊花育種工作提供了新的研究思路。分子輔助標(biāo)記選擇的第一步是尋 找到與重要性狀緊密相連鎖的分子標(biāo)記。尋找與性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的方法有很多，如 集團(tuán)分離分析法（bulked segeration analysis, BSA)、單因素方差分析法（analysis of variance，AN0VA)和數(shù)量性狀基因定位（quantitative trait loci, QTL)法。目前，連鎖遺 傳圖譜構(gòu)建與QTL定位研究已經(jīng)在月季、杜鵑、百合、康乃馨等許多觀賞植物中陸續(xù)展開。 在菊花上，由于其本身復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)導(dǎo)致了這方面的研究起步較晚，研究進(jìn)展較慢。近年 來(lái)，已有部分研究者在菊花的營(yíng)養(yǎng)性狀、花器性狀、花期、分枝等性狀成功進(jìn)行了 QTL定位， 但關(guān)于菊花抗姆性的QTL定位研究未見報(bào)道。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)植物的抗蚜性遺傳機(jī)制比較復(fù)雜，不僅受到加性、上位性互作效應(yīng)和環(huán) 境因子的影響，而且不同作物的抗蚜性遺傳控制機(jī)制差異較大。因此，進(jìn)一步了解菊花抗蚜 性性狀的遺傳機(jī)制，并獲得控制抗蚜性狀的主效QTL，可為菊花抗蚜性狀的分子標(biāo)記輔助育 種創(chuàng)造條件。本發(fā)明將獲得的與菊花抗蚜性相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，為菊花新品種選育、蚜蟲抗 性相關(guān)基因的精確定位和克隆奠定理論基礎(chǔ)。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 針對(duì)目前菊花抗蚜性狀優(yōu)質(zhì)基因的精確定位和克隆的研究在國(guó)內(nèi)外幾乎空白這 一現(xiàn)狀，本發(fā)明的主要目的是：篩選出一個(gè)或多個(gè)與菊花蚜蟲抗性基因緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo) 記，建立菊花抗蚜性分子標(biāo)記輔助選擇體系，從而提高菊花抗蚜性的選擇效率，為菊花新品 種的選育奠定基礎(chǔ)。
[0017] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)手段獲得：
[0018] 1.本發(fā)明提供一種菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，該方法包括如下步驟：
[0019] (1)、試驗(yàn)材料及其表型數(shù)據(jù)的獲得：第一年選擇抗蚜性狀差異明顯的兩個(gè)菊花品 種進(jìn)行人工雜交，獲得F1雜交種子，次年點(diǎn)播，連同親本扦插苗，常規(guī)管理同大田；選取生長(zhǎng) 健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的6?8葉齡扦插苗作為人工蚜蟲接種的供試材料，進(jìn)行連續(xù)兩年的蚜蟲接 種試驗(yàn)，根據(jù)菊花品種蚜量比值的不同，進(jìn)行抗蚜性性狀分析；對(duì)抗蚜性性狀在兩個(gè)年份的 表型數(shù)據(jù)分別進(jìn)行基本描述性統(tǒng)計(jì)分析；
[0020] 所選擇的雜交親本之間的抗蚜性要存在足夠大的差異，這樣QTL位點(diǎn)才有可能在 分離群體中被檢測(cè)到，這種選擇不僅局限在表型上的差異，更重要的是遺傳上的差異。
[0021] 本發(fā)明利用Microsoft Excel 2003軟件和SPSS 11. 5軟件對(duì)抗蚜性性狀在兩個(gè) 年份的表型數(shù)據(jù)分別進(jìn)行基本描述性統(tǒng)計(jì)分析；
[0022] (2)、菊花連鎖圖譜構(gòu)建：
[0023] a.提取親本及其F1雜交后代基因組DNA ;
[0024] b.利用親本及8個(gè)F1雜交子代對(duì)SRAP、SSR引物組合和SCoT引物進(jìn)行多態(tài)性篩 選，將篩選出的多態(tài)性引物用于作圖群體的多態(tài)性擴(kuò)增并統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增后的多態(tài)性條帶數(shù)據(jù)；
[0025] 多態(tài)性條帶數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法，按照"有"記為" 1"，"無(wú)"記為"0"的原則對(duì)清晰易辨 的多態(tài)性SSR、SRAP和SCoT擴(kuò)增位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0026] c.運(yùn)用JoinMap4. 0軟件，選用'CP作圖模型'，設(shè)置LOD為3. 0,分別對(duì)雙親的分 離位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，獲得雙親的分子標(biāo)記連鎖群，再用Mapchart2. 2軟件繪制連鎖圖；
[0027] 對(duì)只存在于親本之一（Testcross marker,測(cè)交標(biāo)記位點(diǎn)）和同時(shí)存在于雜交雙 親中（Intercross marker,交叉標(biāo)記位點(diǎn)）的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，分別按照1:1和3:1孟德 爾分離比例在0. 05顯著水平進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。
[0028] (3)、菊花抗蚜性狀的QTL定位：結(jié)合表型數(shù)據(jù)和分子遺傳圖譜，運(yùn)用WinQTL5. 0軟 件及復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行菊花抗蚜性的QTL分析，并估算各QTL的遺傳參數(shù)：加性效應(yīng)、對(duì) 表型變異的貢獻(xiàn)率、最大LOD值、QTL在相應(yīng)連鎖群上的位置、與最近分子標(biāo)記的距離；
[0029] (4)、菊花抗蚜性狀關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的確定：根據(jù)步驟（3)所得的主效QTL所在的標(biāo) 記區(qū)間即可確定與菊花抗蚜性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。
[0030] 2.上述1提供的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其中，親本為'南農(nóng)宮粉' 為父本和'韓2'為母本。
[0031] 3.上述1提供的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其中，步驟（1)抗蚜性鑒定 中，蚜量比值=該材料接種21d時(shí)的平均蚜量/全部觀測(cè)材料21d時(shí)的平均蚜量。
[0032] 4.上述1提供的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其中，步驟（2)中采用的分 子標(biāo)記連鎖群是顯性標(biāo)記SRAP、SCoT和共顯性標(biāo)記SSR相結(jié)合連鎖群；分子標(biāo)記的命名方 法為："引物名-數(shù)字編號(hào)"，數(shù)字編號(hào)指該條帶的分子量大小，分子量大小由軟件Quantity one估算；
[0033] 連鎖圖繪制過(guò)程中，連鎖分析采用Joinmap 3.0的CP群體的模式來(lái)完成， LOD > 3. 0,采用Kosambi法將重組率轉(zhuǎn)換成遺傳距離以cM表示，根據(jù)連鎖分析結(jié)果采用 MapChart 2. 2軟件制作遺傳圖譜。
[0034] 5.上述1提供的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其中，步驟（3)中所述的主 效QTL是多年重復(fù)出現(xiàn)并且貢獻(xiàn)率大于10%的QTL ;
[0035] QTL分析定位中軟件運(yùn)行參數(shù)設(shè)置為：Walk speed = 2cM ;Window size = 10. 00 ; Model = 6,取LOD閾值為3. 0,當(dāng)LOD峰值大于3. 0時(shí)即可確定該處存在一個(gè)顯著QTL位 點(diǎn)，置信區(qū)間根據(jù)LOD值的峰值兩側(cè)各下降1個(gè)LOD值來(lái)確定；
[0036] QTL命名：首字母大寫的性狀英文縮寫名稱+以E1，E2表示的不同環(huán)境+連鎖群的 序號(hào)或者首字母大寫的性狀英文縮寫名稱+以El，E2表示的不同環(huán)境+連鎖群的序號(hào)+QTL 的序號(hào)。
[0037] 6.上述1提供的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其中，所述的主效QTL位點(diǎn) 包括位點(diǎn) NoaE2Gl、NoaE2G7、NoaElH3、NoaE2H7、NoaE2H8 ;
[0038] 其中，主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl位于親本'南農(nóng)宮粉'遺傳圖的Gl連鎖群上，圖譜距 離為36. 44cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為14. 30 %;主效QTL位點(diǎn)NoaE2G7位于親本'南農(nóng)宮 粉'遺傳圖G7連鎖群上，圖譜距離為80. 12cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為25. 4% ;主效QTL 位點(diǎn)NoaElH3位于親本'韓2'遺傳圖H3連鎖群上，圖譜距離為54. 78cM，對(duì)抗蚜性表型的 貢獻(xiàn)率為19. 4% ;主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7位于親本'韓2'遺傳圖H7連鎖群上，圖譜距離為 28. 92cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為24. 7% ;主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8位于親本'韓2'遺傳圖 H8連鎖群上，圖譜距離為87. 68cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為28. Ο%。
[0039] 7.由上述1-6任一項(xiàng)菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法獲得的分子標(biāo)記，所述 的主效 QTL 位點(diǎn)包括位點(diǎn) NoaE2Gl、NoaE2G7、NoaElH3、NoaE2H7、NoaE2H8 ;
[0040] 主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl的分子標(biāo)記為SR149-268和E8M9-215, NoaE2Gl的距離區(qū) 間為IcM;
[0041] 其中位點(diǎn)NoaE2Gl接近分子標(biāo)記SR149-268, SR149-268連鎖群圖譜距離為 35. 4cM，與位點(diǎn)NoaE2Gl相距I. 04cM，分子量為268,由引物對(duì)SR149擴(kuò)增獲得，正向引物： 序列SEQ ID NO. 1所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 2所示；E8M9-215的連鎖群圖譜距離 為50. lcM，與位點(diǎn)NoaE2Gl相距13. 66cM，分子量為215,由引物對(duì)E8M9擴(kuò)增獲得，正向引 物：序列如SEQ ID NO. 3所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0042] 主效QTL位點(diǎn)NoaE2G7的分子標(biāo)記為E12M18-99和E12M18-80,位點(diǎn)NoaE2G7的距 尚區(qū)間為2cM ;
[0043] 其中位點(diǎn)NoaE2G7接近分子標(biāo)記E12M18-99, E12M18-99的連鎖圖譜距離為 74. lcM，與位點(diǎn)NoaE2G7相距6. 02cM，分子量為99,由引物對(duì)E12M18擴(kuò)增獲得，正向引物： 序列如SEQ ID NO. 5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 6所示；E12M18-80的連鎖圖譜距 離為86. 7cM，與位點(diǎn)NoaE2G7相距6. 58cM，分子量為80,由引物對(duì)E12M18擴(kuò)增獲得，正向引 物：序列如SEQ ID NO. 5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0044] 主效QTL位點(diǎn)NoaElH3的分子標(biāo)記為E16M6-383和SR197-113,位點(diǎn)NoaElH3的距 尚區(qū)間為6cM ;
[0045] 其中位點(diǎn)NoaElH3接近分子標(biāo)記SR197-113, SR197-113的連鎖圖譜距離為 62. 8cM，與位點(diǎn)NoaElH3相距8. 02cM，分子量大小為113,由引物對(duì)SR197擴(kuò)增獲得，正向引 物：序列如SEQ ID NO. 9所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 10所示；E16M6-383的連鎖圖 譜距離為41. 5cM，與位點(diǎn)NoaElH3相距13. 28cM，分子量大小為383,由引物對(duì)E16M6擴(kuò)增獲 得，正向引物：序列如SEQ ID NO. 7所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 8所示；
[0046] 主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7的分子標(biāo)記為S14-676和S16-370,位點(diǎn)NoaE2H7的距離區(qū) 間為4. OcM ;
[0047] 其中位點(diǎn)NoaE2H7接近分子標(biāo)記S16-370, S16-370的連鎖圖譜距離為87. 2cM， 與位點(diǎn)NoaE2H7相距8. 28cM，分子量大小為370,由引物S16擴(kuò)增獲得，引物序列如SEQ ID NO. 13所示；S14-676的連鎖圖譜距離為70. 7cM，與位點(diǎn)NoaE2H7相距8. 22cM，分子量大小 為676,由引物S14擴(kuò)增獲得，引物序列如SEQ ID NO. 12所示；
[0048] 主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8的分子標(biāo)記為S11-700和E16M18-109,位點(diǎn)NoaE2H8的距 離區(qū)間為8cM ;
[0049] 其中位點(diǎn)NoaE2H8接近分子標(biāo)記E16M18-109, E16M18-109的連鎖圖譜距離為 102. lcM，與位點(diǎn)NoaE2H8相距14. 42cM，分子量大小為109,由引物對(duì)E16M18擴(kuò)增獲得，正 向引物：序列如SEQ ID NO. 5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 8所示；S11-700的連鎖圖 譜距離為70. 7cM，與位點(diǎn)NoaE2H8相距16. 98cM，分子量大小為700,，由引物Sll擴(kuò)增獲得， 引物序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0050] 8.本發(fā)明提供上述1-6任一項(xiàng)菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法在抗蚜性菊 花育種上的應(yīng)用，該方法如下：
[0051] 菊花抗蚜基因定位：提取待測(cè)菊花的基因組，（1)分別以引物對(duì)SR149、E8M9進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如果分子量大小為268和215的分 子標(biāo)記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl ;
[0052] (2)以引物對(duì)E12M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析， 如果分子量大小為99和80的分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗姆性主 效 QTL 位點(diǎn) NoaE2G7 ;
[0053] (3)以引物對(duì)E16M6、SR197進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳 后分析，如果分子量大小為113和113的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在 菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE 1H3 ;
[0054] (4)以引物對(duì)S14、S16進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分 析，如果分子量大小為676和370的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花 抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7 ;
[0055] (5)以引物對(duì)Sll、E16M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后 分析，如果分子量大小為700和109的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊 花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8。
[0056] 抗蚜性菊花篩選：如果待測(cè)菊花經(jīng)過(guò)步驟（1)和/或步驟（2)和/或步驟（3)和 /或步驟（4)和/或步驟（5)檢測(cè)后出現(xiàn)上述步驟中所述的菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)，則可 預(yù)測(cè)該待測(cè)菊花具有抗蚜性或抗蚜性潛力。
[0057] 9.上述7提供的分子標(biāo)記在菊花育種中的應(yīng)用，該方法如下：
[0058] 菊花抗蚜基因定位：提取待測(cè)菊花的基因組，（1)分別以引物對(duì)SR149、E8M9進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如果分子量大小為268和215的分 子標(biāo)記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl ;
[0059] (2)以引物對(duì)E12M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析， 如果分子量大小為99和80的分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗姆性主 效 QTL 位點(diǎn) NoaE2G7 ;
[0060] (3)以引物對(duì)E16M6、SR197進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳 后分析，如果分子量大小為113和113的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在 菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE 1H3 ;
[0061] (4)以引物對(duì)S14、S16進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分 析，如果分子量大小為676和370的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花 抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7 ;
[0062] (5)以引物對(duì)Sll、E16M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后 分析，如果分子量大小為700和109的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊 花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8 ;
[0063] 抗蚜性菊花篩選：如果待測(cè)菊花經(jīng)過(guò)步驟（1)和/或步驟（2)和/或步驟（3)和 /或步驟（4)和/或步驟（5)檢測(cè)后出現(xiàn)上述步驟中所述的菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)，則可 預(yù)測(cè)該待測(cè)菊花具有抗蚜性或抗蚜性潛力。
[0064] 有益效果：本發(fā)明以蚜蟲高抗的切花小菊品種'韓2'為母本，蚜蟲敏感品種'南 農(nóng)宮粉'為父本雜交獲得的133株F 1分離群體為試材，利用SRAP、SSR和SCoT分子標(biāo)記構(gòu) 建了雙親的分子遺傳連鎖圖譜，獲得菊花抗蚜性性狀的主效QTL及與其緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo) 記。與目前技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是：
[0065] (I) SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，多態(tài)性好，重復(fù)性高，覆蓋整個(gè)基因組，具有多等位基 因的特性，是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜較理想的分子標(biāo)記。SRAP標(biāo)記系統(tǒng)具有簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高、易從 序列中得到分離條帶等優(yōu)點(diǎn)，該標(biāo)記的正反引物分別針對(duì)基因組的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域設(shè) 計(jì)，對(duì)開放閱讀框（open reading frames, ORFs)進(jìn)行擴(kuò)增，與SSR標(biāo)記的擴(kuò)增區(qū)域互補(bǔ)，可 以作為SSR標(biāo)記的補(bǔ)充標(biāo)記，有效地增加圖譜的密度和基因組覆蓋率，其多態(tài)性和效價(jià)比 (產(chǎn)生多態(tài)性的效率/成本）都很高。SCoT標(biāo)記為顯性標(biāo)記，具有操作簡(jiǎn)單、引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、 能有效產(chǎn)生與性狀連鎖的標(biāo)記、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。利用三種分子標(biāo)記構(gòu)建菊花遺傳圖譜更 有利于挖掘抗蚜性相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)。
[0066] (2)菊花的傳統(tǒng)雜交育種周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且無(wú)法定向改良特定性狀，在育種中 存在一定局限性。分子標(biāo)記輔助選擇育種克服了菊花抗蚜性性狀優(yōu)良基因型鑒定的困難。 選擇范圍更廣，強(qiáng)度更大，還可以在菊花生長(zhǎng)早期進(jìn)行抗蚜性鑒定。通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建了菊花 的遺傳連鎖圖譜，為菊花抗逆性狀的QTL定位奠定了基礎(chǔ)；菊花抗蚜性狀關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的 獲得可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種提早選擇，減少工作量，大大提高菊花新基因型的選擇效率，從而加 快育種進(jìn)程。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0067] 圖1菊花'南農(nóng)宮粉'的連鎖遺傳圖譜與菊花主要抗蚜性狀顯著相關(guān)聯(lián)的QTL其 中，G1-G24 : '南農(nóng)宮粉'遺傳圖譜的24個(gè)連鎖群標(biāo)號(hào)；左邊數(shù)據(jù)：圖譜距離（cM);右邊編 號(hào)：圖譜距離對(duì)應(yīng)的標(biāo)記位點(diǎn)名稱；黑色實(shí)心方框：2012年（E2)在連鎖群上檢測(cè)到的關(guān)于 抗蚜性狀的QTL。
[0068] 圖2菊花'韓2'的連鎖遺傳圖譜與菊花主要抗蚜性狀顯著相關(guān)聯(lián)的QTL其中， H1-H30 : '韓2'遺傳圖譜的30個(gè)連鎖群標(biāo)號(hào)；左邊數(shù)據(jù)：圖譜距離（cM);右邊編號(hào)：圖譜距 離對(duì)應(yīng)的標(biāo)記位點(diǎn)名稱；灰色實(shí)心方框：2011年（El)在連鎖群上檢測(cè)到的關(guān)于抗蚜性狀的 QTL，黑色實(shí)心方框：2012年（E2)在連鎖群上檢測(cè)到的關(guān)于抗蚜性狀的QTL。

【具體實(shí)施方式】
[0069] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
[0070] (一）試驗(yàn)材料及其表型數(shù)據(jù)的獲得
[0071] 試驗(yàn)材料為保存于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)"中國(guó)菊花種質(zhì)資源保存中心"的切花小菊品種 '南農(nóng)宮粉'和'韓2'。如果其他同行需要，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)"中國(guó)菊花種質(zhì)資源保存中心"可 向國(guó)內(nèi)單位提供這些種質(zhì)。兩個(gè)品種的抗蚜性狀差異明顯，這樣QTL位點(diǎn)才有可能在分離 群體中被檢測(cè)到，這種選擇不僅局限在表型上的差異，更重要的是遺傳上的差異。本發(fā)明選 擇的親本為'南農(nóng)宮粉'為蚜蟲敏感材料，'韓2'為高抗材料。2010年秋，以'韓2'為母本， '南農(nóng)宮粉'為父本進(jìn)行人工雜交。選取母本'韓2'發(fā)育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時(shí)去 雄，用硫酸紙袋套袋，同時(shí)將父本'南農(nóng)宮粉'的花序套袋。待母本柱頭伸出并開叉呈銳角 和分泌粘液時(shí)，收集已套袋父本的新鮮花粉，用毛筆對(duì)母本進(jìn)行授粉、套袋，次日重復(fù)授粉。 當(dāng)花梗變黃變枯萎時(shí)采集授粉花序，脫粒，獲得133粒F1雜交種子，次年3月初經(jīng)穴盤點(diǎn)播， 連同親本扦插苗于4月中下旬單株標(biāo)號(hào)后定植"中國(guó)菊花種質(zhì)資源保存中心"的大棚里，常 規(guī)管理同大田。
[0072] 選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的插穗進(jìn)行扦插繁殖，待其生根后移栽到塑料杯中，選取 6?8葉齡的幼苗作為人工蚜蟲接種的供試材料，分別于2011年和2012年進(jìn)行蚜蟲接種試 驗(yàn)，具體方法為：
[0073] 1)從易感姆蟲品種植株上采集菊姬長(zhǎng)管姆（Macrosiphoniella sanbourni)，在 23°C?28°C、RH80%條件下飼養(yǎng)，選取兩齡若蟲作為待接種蚜蟲；
[0074] 2)將待接蚜蟲饑餓處理4h，而后用毛筆小心將兩齡若蟲接種到植株頂部的嫩葉 上，每個(gè)植株用透氣的隔離罩隔離，規(guī)格為25cm(長(zhǎng)）X 12cm(直徑），以防止蚜蟲在不同植 株間轉(zhuǎn)移。每株接種5頭兩齡若蟲，每處理10株，重復(fù)3次；
[0075] 3)接種21d時(shí)統(tǒng)計(jì)蚜口數(shù)量。采用蚜量比值法對(duì)各材料進(jìn)行抗蚜性鑒定，蚜量比 值=該材料接種21d時(shí)的蚜量（一個(gè)處理的平均值）/全部觀測(cè)材料21d時(shí)的平均蚜量，計(jì) 算3個(gè)重復(fù)的蚜量平均值。根據(jù)菊花品種蚜量比值的不同，進(jìn)行抗蚜性分析。
[0076] 4)利用Microsoft Excel 2003軟件和SPSS 11. 5軟件對(duì)分枝性狀在兩個(gè)年份的 表型數(shù)據(jù)分別進(jìn)行基本描述性統(tǒng)計(jì)分析（見表1)。
[0077] 表1菊花'韓2' X '南農(nóng)宮粉'雜交組合群體抗蚜性表型特征值
[0078] Table I Phenotypic statistic values for aphid-resistance traits of chrysanthemum cultivars 'Han 2' (M)and 'Nannong Gongfen' (F)and their Flapping population in2011and 2012season
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 一種菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：該方法包括如下步驟： (1) 、試驗(yàn)材料及其表型數(shù)據(jù)的獲得：第一年選擇抗蚜性狀差異明顯的兩個(gè)菊花品種進(jìn) 行人工雜交，獲得F1雜交種子，次年點(diǎn)播，連同親本扦插苗，常規(guī)管理同大田；選取生長(zhǎng)健 壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的6?8葉齡扦插苗作為人工蚜蟲接種的供試材料，進(jìn)行連續(xù)兩年的蚜蟲接種 試驗(yàn)，根據(jù)菊花品種蚜量比值的不同，進(jìn)行抗蚜性性狀分析；對(duì)抗蚜性性狀在兩個(gè)年份的表 型數(shù)據(jù)分別進(jìn)行基本描述性統(tǒng)計(jì)分析； (2) 、菊花連鎖圖譜構(gòu)建： a. 提取親本及其F1雜交后代基因組DNA ; b. 利用親本及8-10個(gè)F1雜交子代對(duì)SRAP、SSR引物組合和SCoT引物進(jìn)行多態(tài)性篩 選，將篩選出的多態(tài)性引物用于作圖群體的多態(tài)性擴(kuò)增并統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增后的多態(tài)性條帶數(shù)據(jù)； c. 運(yùn)用JoinMap4. 0軟件，選用'CP作圖模型'，設(shè)置LOD為3. 0,分別對(duì)雙親的分離位 點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，獲得雙親的分子標(biāo)記連鎖群，再用Mapchart2. 2軟件繪制連鎖圖； (3) 、菊花抗蚜性狀的QTL定位：結(jié)合表型數(shù)據(jù)和分子遺傳圖譜，運(yùn)用Win QTL5. 0軟件 及復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行菊花抗蚜性的QTL分析，并估算各QTL的遺傳參數(shù)：加性效應(yīng)、對(duì)表 型變異的貢獻(xiàn)率、最大LOD值、QTL在相應(yīng)連鎖群上的位置、與最近分子標(biāo)記的距離； (4) 、菊花抗蚜性狀關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的確定：根據(jù)步驟（3)所得的主效QTL所在的標(biāo)記區(qū) 間即可確定與菊花抗蚜性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。
2. 權(quán)利要求1所述的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：親本為'南農(nóng) 宮粉'為父本和'韓2'為母本。
3. 權(quán)利要求1所述的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：步驟（1)抗 蚜性鑒定中，蚜量比值=該材料接種21d時(shí)的平均蚜量/全部觀測(cè)材料21d時(shí)的平均蚜量。
4. 權(quán)利要求1所述的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：步驟（2)中 采用的分子標(biāo)記連鎖群是顯性標(biāo)記SRAP、SCoT和共顯性標(biāo)記SSR相結(jié)合連鎖群；分子標(biāo)記 的命名方法為："引物名-數(shù)字編號(hào)"，數(shù)字編號(hào)指該條帶的分子量大小，分子量大小由軟件 Quantity one 估算； 連鎖圖繪制過(guò)程中，連鎖分析采用Joinmap 3. 0的CP群體的模式來(lái)完成，LOD彡3. 0， 采用Kosambi法將重組率轉(zhuǎn)換成遺傳距離以cM表示，根據(jù)連鎖分析結(jié)果采用MapChart 2. 2 軟件制作遺傳圖譜。
5. 權(quán)利要求1所述的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：步驟（3)中 所述的主效QTL是多年重復(fù)出現(xiàn)并且貢獻(xiàn)率大于10%的QTL ; QTL分析定位中軟件運(yùn)行參數(shù)設(shè)置為：Walk speed = 2cM;Window size = 10. 00; Model = 6,取LOD閾值為3. 0,當(dāng)LOD峰值大于3. 0時(shí)即可確定該處存在一個(gè)顯著QTL位 點(diǎn)，置信區(qū)間根據(jù)LOD值的峰值兩側(cè)各下降1個(gè)LOD值來(lái)確定； QTL命名：首字母大寫的性狀英文縮寫名稱+以E1，E2表示的不同環(huán)境+連鎖群的序號(hào) 或者首字母大寫的性狀英文縮寫名稱+以El，E2表示的不同環(huán)境+連鎖群的序號(hào)+QTL的 序號(hào)。
6. 權(quán)利要求1所述的菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：所述的主效 QTL 位點(diǎn)包括位點(diǎn) NoaE2Gl、NoaE2G7、NoaElH3、NoaE2H7、NoaE2H8 ; 其中，主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl位于親本'南農(nóng)宮粉'遺傳圖的Gl連鎖群上，圖譜距離為 36. 44cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為14. 30% ;主效QTL位點(diǎn)NoaE2G7位于親本'南農(nóng)宮粉' 遺傳圖G7連鎖群上，圖譜距離為80. 12cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為25. 4% ;主效QTL位 點(diǎn)NoaElH3位于親本'韓2'遺傳圖H3連鎖群上，圖譜距離為54. 78cM，對(duì)抗蚜性表型的貢 獻(xiàn)率為19. 4% ;主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7位于親本'韓2'遺傳圖H7連鎖群上，圖譜距離為 78. 92cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為24. 7% ;主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8位于親本'韓2'遺傳圖 H8連鎖群上，圖譜距離為87. 68cM，對(duì)抗蚜性表型的貢獻(xiàn)率為28. 0%。
7.由權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法獲得的分子標(biāo)記，其特 征在于：所述的主效 QTL 位點(diǎn)包括位點(diǎn) NoaE2Gl、NoaE2G7、NoaElH3、NoaE2H7、NoaE2H8 ; 主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl的分子標(biāo)記為SR149-268和E8M9-215, NoaE2Gl的距離區(qū)間為 IcM ； 其中位點(diǎn)NoaE2Gl接近分子標(biāo)記SR149-268, SR149-268連鎖群圖譜距離為35. 4cM，與 位點(diǎn)NoaE2Gl相距I. 04cM，分子量為268,由引物對(duì)SR149擴(kuò)增獲得，正向引物：序列SEQ ID NO. 1所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 2所示；E8M9-215的連鎖群圖譜距離為50. lcM，與 位點(diǎn)NoaE2Gl相距13. 66cM，分子量為215,由引物對(duì)E8M9擴(kuò)增獲得，正向引物：序列如SEQ ID NO. 3所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 4所示； 主效QTL位點(diǎn)NoaE2G7的分子標(biāo)記為E12M18-99和E12M18-80,位點(diǎn)NoaE2G7的距離區(qū) 間為2cM; 其中位點(diǎn)NoaE2G7接近分子標(biāo)記E12M18-99，E12M18-99的連鎖圖譜距離為74. lcM，與 位點(diǎn)NoaE2G7相距6. 02cM，分子量為99,由引物對(duì)E12M18擴(kuò)增獲得，正向引物：序列如SEQ ID NO. 5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 6所示；E12M18-80的連鎖圖譜距離為86. 7cM， 與位點(diǎn)NoaE2G7相距6. 58cM，分子量為80,由引物對(duì)E12M18擴(kuò)增獲得，正向引物：序列如 SEQ ID NO. 5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 6所示； 主效QTL位點(diǎn)NoaElH3的分子標(biāo)記為E16M6-383和SR197-113,位點(diǎn)NoaElH3的距離區(qū) 間為6cM ; 其中位點(diǎn)NoaElH3接近分子標(biāo)記SR197-113，SR197-113的連鎖圖譜距離為62. 8cM，與 位點(diǎn)NoaElH3相距8. 02cM，分子量大小為113,由引物對(duì)SR197擴(kuò)增獲得，正向引物：序列 如SEQ ID NO. 9所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 10所示；E16M6-383的連鎖圖譜距離為 41. 5cM，與位點(diǎn)NoaElH3相距13. 28cM，分子量大小為383,由引物對(duì)E16M6擴(kuò)增獲得，正向 弓丨物：序列如SEQ ID NO. 7所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 8所示； 主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7的分子標(biāo)記為S14-676和S16-370,位點(diǎn)NoaE2H7的距離區(qū)間為 4. OcM ； 其中位點(diǎn)NoaE2H7接近分子標(biāo)記S16-370, S16-370的連鎖圖譜距離為87. 2cM，與位點(diǎn) NoaE2H7相距8. 28cM，分子量大小為370,由引物S16擴(kuò)增獲得，引物序列如SEQ ID NO. 13 所示；S14-676的連鎖圖譜距離為70. 7cM，與位點(diǎn)NoaE2H7相距8. 22cM，分子量大小為676， 由引物S14擴(kuò)增獲得，引物序列如SEQ ID NO. 12所示； 主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8的分子標(biāo)記為S11-700和E16M18-109,位點(diǎn)NoaE2H8的距離區(qū) 間為8cM ; 其中位點(diǎn)NoaE2H8接近分子標(biāo)記E16M18-109，E16M18-109的連鎖圖譜距離為102. lcM， 與位點(diǎn)NoaE2H8相距14. 42cM，分子量大小為109,由引物對(duì)E16M18擴(kuò)增獲得，正向引物：序 列如SEQ ID NO. 5所示，反向引物：序列如SEQ ID NO. 8所示；S11-700的連鎖圖譜距離為 70. 7cM，與位點(diǎn)NoaE2H8相距16. 98cM，分子量大小為700,，由引物Sll擴(kuò)增獲得，引物序列 如 SEQ ID NO. 11 所示。
8. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)菊花抗蚜性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的篩選方法在抗蚜性菊花育種上的 應(yīng)用，其特征在于： 菊花抗蚜基因定位：提取待測(cè)菊花的基因組，（1)分別以引物對(duì)SR149、E8M9進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如果分子量大小為268和215的分子標(biāo) 記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl ; (2) 以引物對(duì)E12M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如 果分子量大小為99和80的分子標(biāo)記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蚜性主效 QTL 位點(diǎn) NoaE2G7 ; (3) 以引物對(duì)E16M6、SR197進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分 析，如果分子量大小為113和113的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花 抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE 1H3 ; (4) 以引物對(duì)S14、S16進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如 果分子量大小為676和370的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蟲牙 性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7 ; (5) 以引物對(duì)SI I、E16M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析， 如果分子量大小為700和109的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗 蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8。 抗蚜性菊花篩選：如果待測(cè)菊花經(jīng)過(guò)步驟（1)和/或步驟（2)和/或步驟（3)和/或 步驟⑷和/或步驟（5)檢測(cè)后出現(xiàn)上述步驟中所述的菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)，則可預(yù) 測(cè)該待測(cè)菊花具有抗蚜性或抗蚜性潛力。
9. 權(quán)利要求7所述的分子標(biāo)記在菊花育種中的應(yīng)用，其特征在于： 菊花抗蚜基因定位：提取待測(cè)菊花的基因組，（1)分別以引物對(duì)SR149、E8M9進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如果分子量大小為268和215的分子標(biāo) 記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2Gl ; (2) 以引物對(duì)E12M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如 果分子量大小為99和80的分子標(biāo)記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蚜性主效 QTL 位點(diǎn) NoaE2G7 ; (3) 以引物對(duì)E16M6、SR197進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分 析，如果分子量大小為113和113的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，則說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花 抗蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE 1H3 ; (4) 以引物對(duì)S14、S16進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析，如 果分子量大小為676和370的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗蟲牙 性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H7 ; (5) 以引物對(duì)SI I、E16M18進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后分析， 如果分子量大小為700和109的2個(gè)分子標(biāo)記出現(xiàn)，貝U說(shuō)明在2個(gè)分子標(biāo)記間存在菊花抗 蚜性主效QTL位點(diǎn)NoaE2H8 ;
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313150SQ201410568698
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】陳發(fā)棣, 王楚楚, 蘇江碩, 張飛, 管志勇, 陳素梅, 王海濱, 房偉民 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)