一種反硝化細(xì)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】內(nèi)能有效利用無機(jī)氮源、抑制硫酸鹽還原菌（SRB）生長繁殖的一種反硝化細(xì)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)方法，本發(fā)明的高溫反硝化細(xì)菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委托員會(huì)普通微生物保藏中心，拉丁文學(xué)名為Geobacilluspallidas，保藏編號為CGMCCNO7270保藏日期為2013年3月5日。本發(fā)明的高溫反硝化細(xì)菌能有效利用無機(jī)氮源，可以在45℃—90℃高溫條件下有效抑制SRB的生長繁殖，發(fā)酵工藝簡單，可一次發(fā)酵成功，并且培養(yǎng)基成本低，培養(yǎng)周期短，生產(chǎn)的反硝化細(xì)菌活菌含量及芽胞率高，單位活芽胞含量達(dá)2×108cfu/mL，芽孢含量90%以上。
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2013.03.05
【專利說明】一種反硝化細(xì)菌及其發(fā)酵生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種能有效利用無機(jī)氮源、抑制 硫酸鹽還原菌（SRB)生長繁殖的反硝化細(xì)菌及其該反硝化細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 油藏注水開發(fā)導(dǎo)致原油生物降解及其降解的中間產(chǎn)物，刺激了油藏、石油管道及 采油裝置中的硫酸鹽還原菌（SRB)的生長。硫酸鹽還原菌產(chǎn)生大量的硫化氫，造成油藏酸化 及管道的腐蝕，給全球石油工業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失。美國和西德科研機(jī)構(gòu)最近的數(shù)據(jù)表明： SRB腐蝕僅對油田礦廠供水系統(tǒng)造成的損失就達(dá)7億美元/年，對油田保持地層壓力系統(tǒng)和 礦場回收利用污水系統(tǒng)造成的損失就更為嚴(yán)重。我國大部油田如四川油氣田，大慶、遼河、 吉林等油田都不同程度地受到SRB腐蝕的危害，其中以四川油氣田受SRB腐蝕之害最深，曾 先后發(fā)生過多起因應(yīng)力腐蝕引起的惡性事故。防止SRB腐蝕已是腐蝕科學(xué)和微生物學(xué)和工 業(yè)系統(tǒng)共同關(guān)注的重要課題。
[0003] 目前，投入殺菌劑是最常用的防治SRB腐蝕的方法。但SRB種類繁多，化學(xué)殺菌劑 能夠波及到也難于全面捕殺；同時(shí)殺菌劑的大量使用，可使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，也會(huì)給環(huán)境帶 來污染負(fù)荷。近年來，利用微生物來抑制或消除微生物腐蝕的研究已經(jīng)受到普遍的關(guān)注，應(yīng) 用最為廣泛的是用硝酸鹽還原菌NRB (亦稱反硝化細(xì)菌）作用來抑制硫酸鹽還原菌的生長 或產(chǎn)物的積累，減輕或抑制腐蝕的發(fā)生。
[0004] 反硝化細(xì)菌在生活習(xí)性、生長環(huán)境等方面與硫酸鹽還原菌非常相似，只是它們不 產(chǎn)生H2S，而生成其它對油田無害的產(chǎn)物或者將H 2S轉(zhuǎn)化，降低SRB的腐蝕。這些細(xì)菌注入 地層中，可以與SRB發(fā)生競爭，使SRB的生長繁殖受到抑制，即利用微生物之間的競爭關(guān)系 來防止SRB腐蝕。該方法在不破壞環(huán)境的條件下，利用系統(tǒng)本身微生物的競爭生長規(guī)律治 理腐蝕菌，或利用微設(shè)備危害較小，成本相對較底，因而是今后研究工作的重點(diǎn)。但現(xiàn)有技 術(shù)中用于抑制硫酸鹽還原菌的反硝化細(xì)菌均是中低溫范圍下使用的，最佳工作溫度一般是 20- 30°C只能應(yīng)用于油田地面污水處理系統(tǒng)，而油井和油藏等高溫環(huán)境下傳統(tǒng)的反硝化細(xì) 菌并沒有任何效果；并且反硝化菌種需經(jīng)多次放大發(fā)酵才能發(fā)酵成適用工業(yè)應(yīng)用菌液，發(fā) 酵工藝繁瑣，能源消耗高。因此，目前大部分反硝化細(xì)菌進(jìn)行SRB的防治基本停留于室內(nèi)研 究或者小試階段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中反硝化細(xì)菌抑制SRB的最佳溫度低，菌液的工業(yè)發(fā)酵程序 繁瑣、能耗高的問題，提供一種反硝化細(xì)菌，以提高反硝化細(xì)菌抑制SRB的抑制溫度，并且 可以簡化反硝化細(xì)菌工業(yè)發(fā)酵過程。
[0006] 本發(fā)明的反硝化細(xì)菌，為JSHDOl地芽孢桿菌，具有序列表SEQ IDNO :1所示 的序列，保藏于中國微生物菌種保藏管理委托員會(huì)普通微生物保藏中心，拉丁文學(xué)名為 Geobacillus pallidas，保藏編號為CGMCC NO 7270保藏日期為2013年3月5日。
[0007] 本發(fā)明還提供上述高溫反硝化細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括如下步驟： 1) 將所述CGMCC NO 7270反硝化細(xì)菌接種在固體培養(yǎng)基上，50°C-60°C靜止培養(yǎng)3-4 天以形成反硝化細(xì)菌芽胞； 2) 將步驟1)中培養(yǎng)過的固體培養(yǎng)基表面用無菌水洗涮，獲得反硝化細(xì)菌孢子懸浮液， 顯微鏡鏡檢計(jì)數(shù)芽胞含量>1X 101(lcfu/mL ;將懸浮液經(jīng)70-75°C水浴10_15min以獲得發(fā)芽 勢強(qiáng)、發(fā)育一致的孢子懸浮液作為發(fā)酵生產(chǎn)菌種； 3) 將步驟2)中孢子懸浮液生產(chǎn)菌種按IOOmL接種2000L - 2400L無菌培養(yǎng)基的比例 接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行放大培養(yǎng)，發(fā)酵控制條件為：接種溫度63-65°C，培養(yǎng)溫度55-60°C，罐 壓0. 01-0. 05Mpa，發(fā)酵過程中向培養(yǎng)基中通入經(jīng)除塵殺菌后的空氣，每分種通入的空氣量 為液體體積的〇. 2 - 0. 3倍，攪拌速度為150-250rpm ;發(fā)酵培養(yǎng)35-45h，取樣鏡檢90%以上 菌體產(chǎn)生芽孢后，再收集菌液獲得反硝化細(xì)菌產(chǎn)品，所述硝化細(xì)菌產(chǎn)品的單位活芽胞量大 于 2X108cfu/mL。
[0008] 上述步驟1)中固體培養(yǎng)基的配方及各組分的質(zhì)量百分比為：硝酸鈉0. 15-0. 2%， 乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬 氨酸0. 04-0. 05%，三氯化鐵0. 005-0. 01%，酵母膏0. 01-0. 012%，瓊脂1. 5-2. 0%，余量為水， pH 值 7. 0-7. 2。
[0009] 上述步驟3)中無菌培養(yǎng)基的配方及各組分的質(zhì)量百分比為：硝酸鈉0. 15-0. 2%， 乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬 氨酸 0. 04-0. 05%，三氯化鐵 0. 005-0. 01%，酵母膏 0. 01-0. 012%，泡敵 0. 05-0. 1%，余量為水， pH 值 7. 0-7. 2。
[0010] 本發(fā)明的高溫反硝化細(xì)菌為地芽孢桿菌，能有效利用無機(jī)氮源，可以在45°C - 90°C高溫條件下有效抑制SRB的生長繁殖，發(fā)酵工藝簡單，可一次發(fā)酵成功，并且培養(yǎng)基成 本低，培養(yǎng)周期短，生產(chǎn)的反硝化細(xì)菌活菌含量及芽胞率高，單位活芽胞含量達(dá)2 X IO8Cfu/ mL，芽孢含量90%以上。
[0011] 生物保藏 本發(fā)明所涉及的微生物已提交生物保藏：

【權(quán)利要求】
1. 一種反硝化細(xì)菌，其特征在于，為JSHDOl地芽孢桿菌，具有序列表SEQ IDNO :1所 示的序列，保藏于中國微生物菌種保藏管理委托員會(huì)普通微生物保藏中心，拉丁文學(xué)名為 Geobacillus pallidas，保藏編號為CGMCC NO 7270保藏日期為2013年3月5日。
2. -種權(quán)利要求1所述的反硝化細(xì)菌的發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 將所述CGMCC NO 7270反硝化細(xì)菌接種在固體培養(yǎng)基上，50- 60°C靜止培養(yǎng)3-4天 以形成反硝化細(xì)菌芽胞； 2) 將步驟1)中培養(yǎng)過的固體培養(yǎng)基表面用無菌水洗涮，獲得反硝化細(xì)菌孢子懸浮液， 顯微鏡鏡檢計(jì)數(shù)芽胞含量>1 X 101(lCfu/mL ;將懸浮液經(jīng)70-75°C水浴10_15min以獲得發(fā)芽 勢強(qiáng)、發(fā)育一致的孢子懸浮液作為發(fā)酵生產(chǎn)菌種； 3) 將步驟2)中孢子懸浮液生產(chǎn)菌種按IOOmL接種2000L - 2400L無菌培養(yǎng)基的比例 接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行放大培養(yǎng)，發(fā)酵控制條件為：接種溫度63-65°C，培養(yǎng)溫度55-60°C，罐 壓0. 01-0. 05Mpa，發(fā)酵過程中向培養(yǎng)基中通入經(jīng)除塵殺菌后的空氣，每分種通入的空氣量 為液體體積的〇. 2 - 0. 3倍，攪拌速度為150-250rpm ;發(fā)酵培養(yǎng)35-45h，取樣鏡檢90%以上 菌體產(chǎn)生芽孢后，再收集菌液獲得反硝化細(xì)菌產(chǎn)品，所述硝化細(xì)菌產(chǎn)品的單位活芽胞量大 于 2X108cfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的反硝化細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟1)中固 體培養(yǎng)基的配方及各組分的質(zhì)量百分比為：硝酸鈉0. 15-0. 2%，乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二 氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬氨酸0. 04-0. 05%，三氯化鐵 0? 005-0. 01%，酵母膏0? 01-0. 012%，瓊脂L 5-2. 0%，余量為水，pH值7. 0-7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的反硝化細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟3)中無 菌培養(yǎng)基的配方及各組分的質(zhì)量百分比為：硝酸鈉〇. 15-0. 2%，乙酸鈉0. 075-0. 1%，磷酸二 氫鉀0. 05-0. 1%，葡萄糖0. 075-0. 1%，硫酸鎂0. 01-0. 02%，天冬氨酸0. 04-0. 05%，三氯化鐵 0? 005-0. 01%，酵母膏0? 01-0. 012%，泡敵0? 05-0. 1%，余量為水，pH值7. 0-7. 2。
【文檔編號】C12N1/20GK104312957SQ201410569620
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】吳偉林, 楊海濱, 姚峰, 林晶晶, 孟章進(jìn), 楊帆 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司