一種檢測jumpy基因11號外顯子突變的方法及探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測人類JUMPY基因11號外顯子R336Q失活突變的方法，該方法將熒光定量PCR技術(shù)與TaqMan-MGB熒光探針技術(shù)相結(jié)合。本發(fā)明中還提供了用于檢測的引物對、特異性探針以及阻斷核酸。本發(fā)明中，采用熒光定量PCR方法，對失活突變區(qū)域序列進行特異性擴增檢測，同時利用阻斷核酸抑制樣品中野生型DNA模板與引物探針的結(jié)合，實現(xiàn)突變的特異性擴增。本發(fā)明建立的檢測方法簡單有效，檢測靈敏度高，操作簡單快速，結(jié)果判讀簡單客觀，是一種有效檢測人類JUMPY基因11號外顯子R336Q失活突變的方法。
【專利說明】-種檢測JUMPY基因11號外顯子突變的方法及探針

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種用于檢測人類JUMPY基因11號外顯子R336Q失活突變的方法， 并提供了相關(guān)的擴增引物及探針，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] hJUMPY(也稱為 MTMR14, FLJ22405, Gene ID: 64419, C3orf29)基因是近幾年通過 生物信息學(xué)方法，采用人類肌微管素蛋白序列作為誘餌篩選到的一個新基因。該基因位于3 號染色體上（3p25. 3)，由19個外顯子組成，根據(jù)EST數(shù)據(jù)顯示第17個外顯子和第18個外 顯子是可變的。預(yù)測該基因編碼650aa的蛋白（accession no. AK074792)，并且與已知的肌 微管素的催化環(huán)高度同源。該預(yù)測的蛋白與果蠅中II號染色體上CG6542基因編碼的卵衍 生的酪氨酸磷酸酶（egg-derived tyrosine phosphatase, EDTP)高度同源。更有趣的是， 在果蠅中，由于P-元件的插入導(dǎo)致了該基因的失活從而致使果蠅產(chǎn)生了 JUMPY表型：肌肉 功能缺陷、伴隨顫抖以及運動緩慢的肌肉控制功能的逐漸消失。該基因名稱也由此而來。
[0003] 人類肌微管素蛋白（myotubularins)是一個大的家族。該家族在人類基因組中至 少有14個成員，分別命名為MTMl以及MTMR(myotubularin-related)l_13。其中9個成員 (MTMl、MTMRl、MTMR2、MTMR3、MTMR4、MTMR6、MTMR7、MTMR8 以及 MTMR14)擁有催化活性，可 以導(dǎo)致PI (3)P以及PI (3, 5)P2等底物的去磷酸化，其它的家族成員由于蛋白酪氨酸磷酸 酶位點上缺乏保守的半胱氨酸殘基而不具備催化活性，因而并認為是"死的磷酸酶"。唯一 例外的是MTMR7,它最特異的底物是Ins(l，3)P2。在細胞內(nèi)，MTM/MTMR主要調(diào)控細胞內(nèi)的 PI⑶P以及PI (3, 5) P2,從而調(diào)控細胞內(nèi)含物與膜轉(zhuǎn)運，這是MTM/MTMR最重要，也是研究 最清楚的功能。然而，這些脂質(zhì)磷酸酶也能調(diào)節(jié)許多其它的生物學(xué)過程，包括細胞增殖、分 化、壞死、細胞骨架以及細胞間隙及遷移等。許多磷酸酶都與人類遺傳疾病相關(guān)，所以MTM 或者MTMR基因一旦突變會導(dǎo)致兩種嚴重的功能紊亂和疾病：一種是X-偶聯(lián)的肌管肌無力 XLMTM (X-1 inked myotubular myopathy)，另外一種是 CMT 疾?。–harcot-Marie-Tooth)， 主要表現(xiàn)為骨骼肌或者外周神經(jīng)病變。所有有活性的蛋白酪氨酸磷酸酶/雙特異性磷酸酶 (PTP/DSPs)(如PTP1B)以及磷脂酰肌醇磷酸酶（如PTEN)都含有保守的CX 5R序列。hJUMPY 也含有預(yù)測的PTP/DSPs結(jié)構(gòu)域和進化上高度保守的CX5R序列，因而提示hJUMPY主要的 功能也是磷酸酶。的確，hJUMPY能水解一系列磷酸肌醇，其中最特異的底物是PI (3)P和 PI (3, 5)P2。hJUMPY在不同的組織中表達，而在骨骼肌組織中高表達，提示其可能參與骨骼 肌功能的調(diào)節(jié)。hJUMPY由于其結(jié)構(gòu)與功能均與上述這些肌微管素蛋白及其相近，因而后來 也被命名為MTMR14。
[0004] 2006年Jocelyn Laporte課題組報道，在人類中央核肌肉疾病患者中發(fā)現(xiàn)了該基 因的一個無義突變（11號外顯子上的CGG突變?yōu)榱?CAG，導(dǎo)致了 R336Q突變），因而進一步 提示hJUMPY與人類遺傳病密切相關(guān)。后來，科研人員建立了該基因特異性敲除小鼠，也進 一步證實在小鼠中該基因的缺失也會導(dǎo)致骨骼肌肌肉疲勞和肌無力。近年研究也進一步揭 示了該基因與細胞自噬、心肌肥厚及機體代謝密切相關(guān)，提示該基因非常重要。因而，設(shè)計 出一套該基因突變的檢測方法對于臨床上遺傳病的篩查也非常必要。
[0005]目前基因突變檢測的方法很多，如直接測序法，焦磷酸測序法，高分辨率溶解曲線 檢測法（High Resolution Melting Analysis, HRM)，突光定量PCR法等。其中最常見方法 為測序法，該方法費用較低，但操作耗時長且靈敏度低；高分辨率溶解曲線法對設(shè)備要求比 較特殊，在臨床推廣存在一定的困難；傳統(tǒng)熒光定量PCR法在臨床上應(yīng)用較為廣泛，但該方 法檢測缺失突變效果較差。JUMPY基因11號外顯子的無義突變發(fā)生在基因序列1007bp處， 其中CGG突變?yōu)镃AG，導(dǎo)致其催化活性的急劇降低以及功能的紊亂（見表1)。因此，需要建 立一種快速有效的檢測JUMPY基因11號外顯子無義突變的方法。
[0006] 表I JUMPY基因失活突變
[0007]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測人類JUMPY基因11號外顯子R336Q失活突變的方法，其特征在于包括 以下步驟： (1) 、合成檢測所需的引物對，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如 SEQ ID N0:1 所示：5'-CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3'；所述下游引物的基因序列如 SEQ ID N0:2所示：5'-ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3';合成特異性探針，其基因序列如SEQIDN0:3 所示：5 'FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-NFQ-3' ； (2) 、合成阻斷核酸，其基因序列如SEQ ID N0:4所示：5 'VIC-TGGGATCAGACCC C-MGB-NFQ-3,； (3) 、對待檢測樣品進行處理并提取DNA ; (4) 、配制熒光定量PCR反應(yīng)體系A(chǔ)，對待測樣品上樣量進行監(jiān)測，利用引物對和特異性 探針擴增待測樣品，得到樣品DNA的檢測Ct值，作為樣品的質(zhì)控Ct值； (5) 、配制熒光定量PCR反應(yīng)體系B，對待測樣品進行PCR擴增檢測，利用阻斷核酸抑 制待測樣品中存在的野生型DNA即未發(fā)生JUMPY基因11號外顯子突變的DNA，利用引物對 和特異性探針擴增待測樣品中可能存在的JUMPY基因11號外顯子無義突變DNA，得到樣品 DNA的突變檢測Ct值； (6) 、以質(zhì)控Ct值作為上樣量是否適當?shù)臉藴?，質(zhì)控Ct值< 30則上樣量合適，檢測結(jié) 果有效；30 <質(zhì)控Ct值< 34則上樣量偏低，可適當提高上樣量后檢測；以突變檢測Ct值 與質(zhì)控Ct的差值Λ Ct值作為JUMPY基因11號外顯子是否發(fā)生無義突變的判斷標準，Λ Ct 值< 6則樣品存在突變，Λ Ct值> 6則樣品無該突變或低于突變檢測下限。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于：步驟⑷中所述的熒光定量PCR反應(yīng) 體系A(chǔ)包括PCR緩沖液、上游引物、下游引物、特異性探針、Taq酶、樣品DNA以及水，其中PCR 緩沖液的體積濃度為50-60%，上游引物和下游引物的濃度均為0. 2 μ Μ-1 μ M，特異性探針 的濃度為〇· 1 μ Μ-0. 5 μ M，Taq酶的酶活力為0· 5U-1. 0U，樣品DNA的體積濃度為8-20%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于：步驟（5)中所述的熒光定量PCR反 應(yīng)體系B包括PCR緩沖液、上游引物、下游引物、特異性探針、阻斷核酸、Taq酶、樣品DNA以 及水，其中PCR緩沖液的體積濃度為50-60%，上游引物、下游引物和阻斷核酸的濃度均為 0· 2 μ Μ-1 μ M，特異性探針的濃度為(λ 1 μ M-0. 5 μ M，Taq酶的酶活力為0· 5U-L 0U，樣品DNA 的體積濃度為8-20%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于：步驟（4)和（5)中PCR擴增反應(yīng)步 驟為：95°C 5min;95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)；每個循環(huán)后收集FAM或VIC熒光信號。
5. 權(quán)利要求1中所述的用于檢測人類JUMPY基因11號外顯子R336Q失活突變的基因 探針，其特征在于：該探針的基因序列如SEQIDNO:3所示：5'FAM-TGGGATCGGACCCC-MGB-N FQ-3，。
6. 權(quán)利要求1中所述的用于檢測人類JUMPY基因11號外顯子R336Q失活突變的引 物對，其特征在于：包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如SEQ ID NO: 1 所示：5'-CGGGCTGCTGGTACACTGTAT-3'；所述下游引物的基因序列如SEQIDN0:2所示 ： 5, -ATCCTAACACACCCAAAGAGCAG-3，。
7. 權(quán)利要求1中所述的用于檢測人類JUMPY基因11號外顯子R336Q失活突變的阻斷 核酸，其特征在于：所述阻斷核酸的基因序列如SEQ ID N0:4所示：5'VIC-TGGGATCAGACCCC -MGB-NFQ-3，。
【文檔編號】C12N15/11GK104293965SQ201410571512
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】沈金花, 呂印, 劉慶華 申請人:中南民族大學(xué)