用于鑒定地頂孢霉誘變株mkl18的引物對和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的引物對和試劑盒。所述引物對的堿基序列為：正向引物：5'-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3'；反向引物：5'-GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3'。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)地頂孢霉誘變株MKL18的18S rDNA發(fā)生了變異，并且該變異能在傳代菌株中穩(wěn)定遺傳。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明針對頂孢霉屬18S rDNA中一段長度為230bp、比較保守的序列，設(shè)計了本發(fā)明的引物對，用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18及其傳代菌株，從而特異地將地頂孢霉誘變株MKL18與其野生出發(fā)菌株區(qū)分開來。
【專利說明】用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的引物對和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于菌種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的 引物對和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草是一類珍惜寶貴的傳統(tǒng)中藥材，在傳統(tǒng)中醫(yī)和現(xiàn)在醫(yī)學(xué)臨床中均有較廣 泛的應(yīng)用。野生蟲草對其生長條件要求苛刻，導(dǎo)致產(chǎn)量較低，所以利用其真菌無性形進行工 業(yè)化深層發(fā)酵，生產(chǎn)各種藥物、營養(yǎng)保健品和飼料添加劑等，已經(jīng)廣為多見。通過挖掘豐富 的野生資源、以及實驗室人工誘變，各種具有優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)性能的菌株也廣為報道。
[0003] 由于蟲草真菌無性形的分離鑒別方法尚不十分系統(tǒng)規(guī)范，對一些野生分離株的鑒 定，大多還是采用外觀及顯微形態(tài)的描述作為分類依據(jù)。這不僅給蟲草真菌的分類帶來一 定程度的混亂，也使得一些具備優(yōu)異生產(chǎn)性能的菌種及其相關(guān)的知識產(chǎn)權(quán)，難以得到實質(zhì) 意乂的保護。
[0004] 如何建立一種方法，方便且特異性地表征并進而保護這些生產(chǎn)性能好的優(yōu)質(zhì)菌 株、特別是其中的一些專利菌株，是一個現(xiàn)實的問題。
[0005] 核糖體RNA基因序列（rRNA基因，或稱rDNA)在進化過程中是十分保守的，因此隨 著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，rDNA序列已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)生物學(xué)中。18S rDNA序列用于 真菌的系統(tǒng)分類和進化樹的建立，也已經(jīng)比較普遍。
[0006] 申請?zhí)枮?01410016617. 2的中國專利文獻公開了 一種地頂孢霉誘變株 MKL18 (Acremonium terricola MKL18)，其保藏編號 CCTCC No. M2013654。該地頂孢霉誘變 株屬于蟲草真菌，用于生產(chǎn)一種綠色飼料添加劑。與出發(fā)野生菌株相比，地頂孢霉誘變株 MKL18生長優(yōu)勢明顯，在察氏培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵時，同期生物量可提高32%;菌絲體中腺苷、 麥角甾醇、粗蛋白和多糖的含量分別提高12% (腺苷）、42% (麥角甾醇）、8% (粗蛋白） 和35% (多糖），而這些活性成分賦予了地頂孢霉菌發(fā)酵產(chǎn)物促生長、抗腫瘤、提高免疫等 功效；并且這些優(yōu)異的生產(chǎn)性能都能隨菌株繁殖而穩(wěn)定遺傳。
[0007] 然而，地頂孢霉誘變株MKL18和野生出發(fā)菌株相比，兩者在菌落和顯微形態(tài)上沒 有任何差異，無法通過肉眼或顯微觀察進行區(qū)分。 申請人:雖然就該菌株提出了發(fā)明專利申 請并在保藏機構(gòu)保藏了菌種，但是對于這一優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)菌種，如因生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)部的原因?qū)е?可能的流失外泄，將不能很好監(jiān)控鑒別。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的引物對，利用該引物對對菌 株18S rDNA部分序列進行分析，能將地頂孢霉誘變株MKL18與其野生出發(fā)菌株區(qū)別開來。
[0009] 用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18 (Acremonium terricola MKL18)的引物對，堿基 序列為：
[0010] 正向引物：5' -CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3' ；
[0011] 反向引物：5' -GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3'。
[0012] 申請人:發(fā)現(xiàn)，在對野生型地頂孢霉進行誘變時，獲得的地頂孢霉誘變株MKL18除 了獲得更加優(yōu)異的菌種性能外，還使得18S rDNA序列發(fā)生了變異。雖然18S rDNA序列的 變異與新菌種性能之間并無直接關(guān)聯(lián)（即新菌種性能的產(chǎn)生并非是18S rDNA序列變異引 起的），但該變異后的18S rDNA序列、新菌種性能均能隨菌株繁殖而穩(wěn)定遺傳；這就使得通 過對18S rDNA序列進行分析，能夠?qū)⒕浜惋@微形態(tài)極為相似的地頂孢霉誘變株MKL18與 其野生出發(fā)菌株區(qū)分開來。
[0013] 在此基礎(chǔ)上，在Genebank上輸入"Acremonium 18S rRNA"，檢索到頂孢霉屬 各種相關(guān)序列 370 余條（詳見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore ? term = acremonium+18S+rRNA);而輸入 "Acremonium terricola 18S rRNA" 后搜索，則僅有一 條序列，且該序列只包含18S rDNA中的33個堿基（詳見http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/20385397)。參考 Glenn AE.et al 發(fā)表的文獻（Molecular phylogeny of Acremonium and its taxonomic implications. Mycologia, 1996, 88:369),我們選擇頂抱 霉屬18S rDNA中一段長度為230bp、比較保守的序列，設(shè)計了本發(fā)明的引物對，用于鑒定地 頂孢霉誘變株MKL18。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的試劑盒，包含有引物對， 所述引物對即為本發(fā)明所述用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的引物對。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的方法，包括：
[0016] (1)提取待測菌株的基因組DNA ;
[0017] (2)以所述基因組DNA為模板，利用所述的引物對進行PCR擴增；
[0018] PCR擴增的反應(yīng)體系為：按50 μ L體系計，其中包括：5U/μ L的高保真耐高溫聚合 酶 L 0 μ L，10 X 緩沖液 5. 0 μ L，25mM 的 MgCl23. 0 μ L，各 2. 5mM 的 dNTPs 混合物 4. 0 μ L，正 向和反向引物各1. 〇μ L，100ng/y L的基因組DNAL 0μ L，滅菌雙蒸水34μ L。
[0019] PCR擴增程度為：95°C預(yù)變性4min ;95°C變性45s，68°C退火/延伸反應(yīng)45s，共計 25個循環(huán)；72°C延伸3min。
[0020] (3)對擴增產(chǎn)物進行序列測定，根據(jù)測序結(jié)果鑒定待測菌株是否為地頂孢霉誘變 株 MKL18。
[0021] 本發(fā)明中，所述引物對的擴增產(chǎn)物是地頂孢霉18S rDNA的230bp目標片段。相對 于野生出發(fā)菌株，地頂孢霉誘變株MKL18的18S rDNA上發(fā)生的堿基突變均發(fā)生在該區(qū)段 上，且230bp長度的目標片段便于采用一般的PCR鑒定試劑盒進行擴增。
[0022] 測序結(jié)果顯示，地頂孢霉誘變株MKL18的的擴增產(chǎn)物的堿基序列如SEQ ID No. 1 所示。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，地頂孢霉誘變株MKL1818S rDNA的230bp目標片 段中，有5個位點發(fā)生了變異，分別為A42T(表示第42位的堿基A突變?yōu)閴A基T，下同）、 G45A、C52T、C113A、T114G。
[0023] 對地頂孢霉誘變株MKL18的傳代菌株進行18S rDNA序列分析，同樣發(fā)現(xiàn)了上述變 異，表明這些變異在誘變株中是穩(wěn)定遺傳的。
[0024] 由此可見，本發(fā)明的引物對可用于特異性地鑒定地頂孢霉誘變株MKL18及其傳代 菌株。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0026] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)地頂孢霉誘變株MKL18的18S rDNA發(fā)生了變異，并且該變異能在傳代 菌株中穩(wěn)定遺傳，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明針對頂孢霉屬18S rDNA中一段長度為230bp、比較保 守的序列，設(shè)計了本發(fā)明的引物對，用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18及其傳代菌株，從而特 異地將地頂孢霉誘變株MKL18與其野生出發(fā)菌株區(qū)分開來。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為地頂孢霉誘變株MKL18與其野生出發(fā)株相關(guān)序列的PCR結(jié)果圖；
[0028] 其中，泳道1為核酸低分子量標記，泳道2為PCR陰性對照，泳道3為地頂孢霉野 生出發(fā)菌株的PCR產(chǎn)物，泳道4為地頂孢霉誘變株MKL18原代菌種的PCR產(chǎn)物，泳道5為地 頂孢霉誘變株MKL18的第20代次菌種的PCR產(chǎn)物，泳道6為核酸分子量標記，泳道7為地 頂孢霉染色體DNA ;
[0029] 圖2為地頂孢霉誘變株MKL18及其傳代菌株與其野生出發(fā)株18S rDNA部分序列 比對結(jié)果圖；
[0030] 其中，AT-y表示地頂孢霉野生出發(fā)菌株，AT-ml表示地頂孢霉誘變株MKL18原代 菌種，AT-m20表示誘變株MKL18的第20代次菌種；Consensus表示三種菌株相同部分的序 列；
[0031] 圖3為地頂孢霉野生出發(fā)菌株18S rDNA部分序列的Blast分析結(jié)果；
[0032] 圖4為地頂孢霉誘變株MKL1818S rDNA部分序列的Blast分析結(jié)果。

【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0034] 本實施例一種鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的方法，包括以下步驟：1、地頂孢霉的 培養(yǎng)和染色體DNA提取
[0035] ①地頂孢霉培養(yǎng)：取保存于_80°C超低溫冰箱的地頂孢霉野生出發(fā)菌株、地頂孢 霉誘變株MKL18原代菌種和第20代次菌種（中國發(fā)明專利CN 201410016617. 2)，接種于含 1〇1111液體察氏培養(yǎng)基（似勵30.2%、1(2冊040.2%、1((：10.5%、]\%50 40.4%、卩65040 . 001%、蔗 糖2%，其余為水）的三角搖瓶，25°C、200rpm振蕩培養(yǎng)96小時。
[0036] ②染色體DNA提?。喝?ml菌液，5000rpm離心5分鐘獲取菌絲體，PBS懸浮洗滌兩 次，將菌絲按1:20 (g/ml)的比例加到2ml酶解液中（蝸牛酶0. 5%，纖維素酶0. 3%，0. 6M 甘露醇），33°C反應(yīng)0. 5?1小時，沸水浴3分鐘，酚、酚/氯仿抽提，輕柔操作，抽提上清液 加入2倍體積無水乙醇，-20°C沉淀2小時，15000rpm低溫離心10分鐘，沉淀用70%乙醇輕 柔懸浮洗滌兩次，自然晾干后用200 μ 1水溶解，-20°C保存。
[0037] 電泳檢測結(jié)果（見圖1)可見所提取的染色體DNA是完整的，沒有碎片，大致定量 為 100ng/ml。
[0038] 2、18S rDNA部分序列的特異性引物的合成和PCR擴增：
[0039] ①18S rDNA部分序列的特異性引物的合成：參照Genebank檢索結(jié)果和文 獻(Glenn AE.et al Molecular phylogeny of Acremonium and its taxonomic implications. Mycologia, 1996,88:369)內(nèi)容，選擇頂抱霉屬已發(fā)表的18S rDNA序列中相 對保守的230bp目標區(qū)段，據(jù)此設(shè)計一對引物：
[0040] 正向引物：5,-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3' ；
[0041] 反向引物：5' -GGGATTGGGTAATTTGCGCGCCT-3' ；
[0042] 兩條引物的TM值分別為71. 3°C和72. 4°C，目標擴增產(chǎn)物長度應(yīng)為230bp。
[0043] ②18S rDNA部分序列的PCR擴增：
[0044] 配制以下擴增體系：按50 μ L體系計，其中5U/μ L高保真耐高溫聚合酶1.0 μ L， IOX緩沖液5. 0 μ L，25mM的MgCl23. 0 μ L，各2. 5mM的dNTPs混合物4. 0 μ L，正向和反向引 物各1. 〇 μ L, IOOng/ μ L模板DNA L 0 μ L,滅菌雙蒸水34 μ L。
[0045] 由于兩條引物的GC比較高、TM值也都相對較高，所以執(zhí)行的PCR程序也相對簡化 了。具體程序為：95°C預(yù)變性4min ;95°C變性45s，68°C退火/延伸反應(yīng)45s，共計25個循 環(huán)；72°C 延伸 3min。
[0046] 3、PCR產(chǎn)物的電泳鑒定和序列分析
[0047] ① PCR產(chǎn)物的電泳鑒定：取PCR產(chǎn)物2 μ L進行瓊脂糖電泳（1. 5% )，PCR產(chǎn)物在 230bp處出現(xiàn)特異條帶（圖1)。
[0048] ②PCR產(chǎn)物的序列分析：將18S rDNA PCR產(chǎn)物克隆到T載體上，用載體正向測序 引物進行序列測定，并將地頂孢霉野生出發(fā)菌株與地頂孢霉誘變株MKL18原代菌種的序列 進行比對（地頂孢霉誘變株MKL18原代菌種和第20代次菌種的序列一致），比對結(jié)果見圖 2 〇
[0049] 由圖2可見，與地頂孢霉野生出發(fā)菌株相比，地頂孢霉誘變株MKL18原代菌種的序 列上發(fā)生了 5個堿基的點突變，位置和突變情況分別為：A42T、G45A、C52T、C113A、T114G。
[0050] 進一步進行Blast分析發(fā)現(xiàn)，地頂孢霉野生出發(fā)菌株的這段18S rDNA序列，只與 一株Acremonium blochii strain CBS 424. 93的相應(yīng)序列有100%同源性（圖3);而地頂 孢霉誘變株MKL18這段18S rDNA序列，和任何其他序列都沒有100 %同源性（圖4)。
[0051] 由此可見，本發(fā)明的引物對和方法能用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18及其傳代菌 株，從而特異地將地頂孢霉誘變株MKL18與野生型菌株區(qū)分開來。
【權(quán)利要求】
1?用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18(Acremonium terricola MKL18)的引物對，其特征 在于，喊基序列為： 正向引物：5'-CCAATGCCCTTCGGGGCTCTCTGG-3' ； 反向引物：5'-GGGAirGGGTAAITTGCGCGCCT-3'。
2. -種用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的試劑盒，包含有引物對，其特征在于，所述引 物對為如權(quán)利要求1所述用于鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的引物對。
3. -種鑒定地頂孢霉誘變株MKL18的方法，其特征在于，包括： (1) 提取待測菌株的基因組DNA ; (2) 以所述基因組DNA為模板，利用如權(quán)利要求1所述的引物對進行PCR擴增； (3) 對擴增產(chǎn)物進行序列測定，根據(jù)測序結(jié)果鑒定待測菌株是否為地頂孢霉誘變株 MKL18。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，PCR擴增的反應(yīng)體系為：按 50 ii L體系計，其中包括：5U/ ii L的高保真耐高溫聚合酶I. 0 ii L，10 X緩沖液5. 0 ii L，25mM 的MgCl23. 0 ii L，各2. 5mM的dNTPs混合物4. 0 ii L，正向和反向引物各I. 0 ii L，IOOng/ ii L的 基因組DNA I. 0 u L,滅菌雙蒸水34 u L。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟⑵中，PCR擴增程序為：95°C預(yù)變性 4min ;95°C變性45s，68°C退火/延伸反應(yīng)45s，共計25個循環(huán)；72°C延伸3min。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物對的擴增產(chǎn)物是地頂孢霉18S rDNA的230bp目標片段。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，地頂孢霉誘變株MKL18擴增產(chǎn)物的堿基序列 如 SEQ ID No. 1 所示。
【文檔編號】C12R1/645GK104313151SQ201410572451
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】石應(yīng)輝, 胡青松, 桂向東, 李曉祥 申請人:安徽新星生物工程有限公司