一株齊整小核菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株適用于工業(yè)生產(chǎn)硬葡聚糖的齊整小核菌，該菌株名為齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010，菌株已于2014年7月6日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO.M2014325。本發(fā)明還公開了所述齊整小核菌在發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖中的應(yīng)用，通過采用分階段控制發(fā)酵條件工藝，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了菌體快速生長與高效產(chǎn)糖的完美結(jié)合，保證的發(fā)酵過程的穩(wěn)定運(yùn)行，使發(fā)酵產(chǎn)率、生產(chǎn)強(qiáng)度可分別達(dá)到35g/L、0.44g/L/h，收率顯著高于現(xiàn)有工藝，所制備的產(chǎn)品粘度高，穩(wěn)定性良好，粘度變化小，具有良好的應(yīng)用性能。
CCTCC NO：M2014325
20140706
【專利說明】-株齊整小核菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物多糖硬葡聚糖生產(chǎn)菌株，尤其涉及一株齊整小核菌及其在 發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 硬葡聚糖（也稱為小核菌多糖或小核菌膠）是由絲狀真菌產(chǎn)生的非離子水溶性同 多糖。其分子是由含有β-D-(1，6)-葡萄糖殘基側(cè)鏈的線性β-D-(1，3)-葡萄糖殘基鏈組 成。硬葡聚糖的顯著特性是良好的流變性與穩(wěn)定性，其廣泛的在ρΗ(1?12)、礦化度（0? 200, OOOppm)和溫度（130°C )均具有良好的穩(wěn)定性。
[0003] 硬葡聚糖在食品、醫(yī)藥、化妝品、石油等工業(yè)都具有良好的應(yīng)用價(jià)值。目前在國際 市場中，硬葡聚糖作為保濕、抗炎、增稠成分普遍應(yīng)用在化妝品中，常被國際知名化妝品品 牌所采用。硬葡聚糖還能夠提高原油采收率，在當(dāng)前普遍進(jìn)入三次、四次采油的趨勢下，其 具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 由于硬葡聚糖的發(fā)酵產(chǎn)率不高導(dǎo)致其價(jià)格居高不下，這嚴(yán)重限制了其市場（特別 是石油工業(yè)領(lǐng)域）的開發(fā)拓展。因此，研究如何提高硬葡聚糖的產(chǎn)量是主要關(guān)注點(diǎn)。目前 報(bào)道的關(guān)于硬葡聚糖發(fā)酵生產(chǎn)的研究多集中于發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，但其仍然存在發(fā)酵時(shí)間 長（96h以上），產(chǎn)率低（20g/l左右），生產(chǎn)成本較高的缺陷。雖然已公開的關(guān)于提高硬葡 聚糖發(fā)酵生產(chǎn)的國內(nèi)外專利CN201110006769. 0、CN201310283916. 8和EP 1417325A2產(chǎn)率 最高可達(dá)32g/L，但其工藝控制復(fù)雜，且穩(wěn)定性不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決問題是提供一株具有獨(dú)特發(fā)酵規(guī)律的適用于 工業(yè)化的硬葡聚糖高效發(fā)酵生產(chǎn)菌種一一齊整小核菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述適用于工業(yè)生產(chǎn)硬葡聚糖的齊整小核菌，其特征在于：該菌株名為齊 整小核菌（Sclerotium rolfsii)SCL2010,菌株已于2014年7月6日保藏在中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC，地址：中國·武 漢·武漢大學(xué)），其保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2014325。
[0007] 上述齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌落形態(tài)及顯微特征如下：
[0008] 所述菌在PDA培養(yǎng)基上生長快，28 °C條件下培養(yǎng)3天，菌絲長滿培養(yǎng)皿，菌絲茂盛， 棉絮狀，氣生，白色。
[0009] 菌絲壁薄，直徑2. 5?6. 5 μ m，分支，具有鎖狀聯(lián)合。
[0010] 菌落邊緣產(chǎn)生菌核，初為乳白色，后逐漸變?yōu)闇\黃色至棕褐色或黑色，球形或卵圓 形，大小0. 5?2mm，表面光滑具光澤。
[0011] 對(duì)本發(fā)明所述齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010測定18S rDNA的基因 序列（PCR通用引物為NSlF和NS8R)的結(jié)果顯示，其基因序列長度為1694bp，具體核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 其中：所述PCR通用引物NSlF和NS8R序列如下：
[0013] NSlF :5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'
[0014] NS8R : 5 ' -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3 '
[0015] 本發(fā)明所述的齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌種選育的基本方法 是：從山東省濰坊市壽光市、高密市、臨朐縣感染白絹病的馬鈴薯植株和塊莖上收集白絹病 菌核，以菌核為分離材料，無菌條件下將菌核接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌核萌發(fā)菌 絲長出后，進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上保存。
[0016] 將分離純化轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上的菌絲分別轉(zhuǎn)接于新的PDA平板上，28°C培養(yǎng)連 續(xù)觀察，待菌絲生長鋪滿平板并結(jié)出菌核，直至菌核變色成熟為止，記錄菌絲生長情況、結(jié) 核及菌核變化情況，結(jié)合顯微鏡觀察確定其中的齊整小核菌菌株并進(jìn)行菌株編號(hào)；將已確 定為齊整小核菌的菌核轉(zhuǎn)接與PDA平板上，觀察記錄菌核萌發(fā)情況、萌發(fā)率、菌絲生長情 況、結(jié)菌核時(shí)間和菌核量。選取菌核萌發(fā)快、萌發(fā)率>75%、結(jié)菌核時(shí)間快（72h左右）、菌 核量多的菌株進(jìn)行硬葡聚糖搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過大量實(shí)驗(yàn)，最終獲得高產(chǎn)硬葡聚糖的齊整 小核菌，命名為齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌株，該菌株菌核萌發(fā)率高達(dá) 80%，發(fā)酵最終pH < 2. 5,產(chǎn)率可達(dá)到35g/L，傳代實(shí)驗(yàn)表明該菌株遺傳穩(wěn)定性良好。
[0017] 本發(fā)明所述齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010在發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖中的 應(yīng)用。
[0018] 為便于發(fā)酵過程順利實(shí)現(xiàn)，降低生產(chǎn)成本，應(yīng)用方法優(yōu)選的技術(shù)方案是：將齊整小 核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010經(jīng)固體斜面和種子液擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì) 量百分?jǐn)?shù)4?10%的量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液里，分階段控制發(fā)酵條件，發(fā)酵獲得硬葡聚糖。
[0019] 其中，所述應(yīng)用方法涉及的具體步驟順序如下：
[0020] (1)硬葡聚糖生產(chǎn)菌種齊整小核菌茄形瓶斜面固體培養(yǎng)：
[0021] 將齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010的成熟菌核接種于茄形瓶斜面固體 培養(yǎng)基上，30?34°C靜置培養(yǎng)5?7天，獲得大量成熟齊整小核菌，用于發(fā)酵生產(chǎn)種子液制 備。
[0022] 上述斜面固體PDA組成（單位：g/L):馬鈴薯200 (經(jīng)水煮爛后過濾），葡萄糖20， 瓊脂20。
[0023] (2)硬葡聚糖發(fā)酵生產(chǎn)種子液制備：
[0024] 將培養(yǎng)成熟的齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010用無菌生理鹽水洗一 下，按常規(guī)量接種于種子培養(yǎng)液里，調(diào)整種子培養(yǎng)液的PH至4?5, 30?34°C進(jìn)行通氣攪拌 培養(yǎng)30?36h，獲得含大量菌絲體的硬葡聚糖發(fā)酵生產(chǎn)種子液。
[0025] 其中：所述的種子培養(yǎng)液由如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分組成（單位：g/L):
[0026] 葡萄糖：10?20,酵母膏3?6,硝酸鈉 2?3,磷酸氫二鉀2?5,硫酸鎂1?3， 聚醚消泡劑0. 2?1，其他為軟化水，pH 4?5。
[0027] (3)硬葡聚糖發(fā)酵生產(chǎn)及分階段控制發(fā)酵條件工藝：
[0028] 將培養(yǎng)成熟的齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010發(fā)酵生產(chǎn)種子液按常規(guī) 量接種到含有碳源的發(fā)酵培養(yǎng)液中，調(diào)整培養(yǎng)液的PH，進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，通過分階段 控制發(fā)酵條件，生產(chǎn)獲得硬葡聚糖。
[0029] 其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)液由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成（單位：g/L):
[0030] 碳源：45?60,豆柏粉1?3,玉米漿0. 5?2,硝酸鈉1?3,磷酸氫二鉀1?2， 硫酸鎂0.5?1，聚醚消泡劑0.2?1，其他為軟化水，pH 4?5。培養(yǎng)液中的碳源選自淀 粉、蔗糖和葡萄糖中的一種或其任意重量比例的混合物。
[0031] 由于發(fā)酵過程分為菌體生長期與產(chǎn)糖期，而且隨著發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵液粘度快速上 升，因此優(yōu)選的技術(shù)方案是在不同的發(fā)酵階段進(jìn)行培養(yǎng)溫度、pH、通風(fēng)比、溶解氧（DO)的階 段性控制，以有效提高發(fā)酵產(chǎn)率。優(yōu)選的發(fā)酵控制條件是：
[0032] 0 ?24h :溫度 30 ?34°C、pH 4. 0 ?5. 0、通風(fēng)量 0· 1 ?0· 4v. v.m.、壓力為 0· 04 ? 0.0510^、溶解氧30%?50%。
[0033] 24h ?放罐（60 ?72h):溫度 26 ?28°C、pH 2. 5、通風(fēng)量 0· 5 ?2· 0ν· V. m.、壓力 為0· 04?0· 05MPa、溶解氧5%?15%。
[0034] 應(yīng)用上述方法制備的硬葡聚糖性能指標(biāo)檢測結(jié)果如下：
[0035] (1)產(chǎn)率測定
[0036] 根據(jù)文獻(xiàn)中一般采用的方法如下：
[0037] A.所用儀器：恒溫箱、分析天平（0· OOlg)。
[0038] B.測定方法：準(zhǔn)確量取一定體積的發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至7. 0,采用90%?95%的乙 醇沉淀多糖，過濾后再用90%?95%的乙醇洗滌一遍，濾干后置于105°C恒溫箱里干燥至 恒重，降溫后稱重。
[0039] 產(chǎn)率=樣品干重/發(fā)酵液體積X 100%
[0040] C.檢測結(jié)果：采用齊整小核菌（Sclerotium rolfsii)SCL2010及以上發(fā)酵方法所 得硬葡聚糖的產(chǎn)率為32?35g/L，高于現(xiàn)有研究報(bào)道。
[0041] D.文獻(xiàn)：劉如林，衡斌，趙大健、周與良.由淀粉生產(chǎn)小核菌葡聚糖的研究[J]南 開大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），1990,4:15-22。
[0042] Y. Wang, B. McNeil. Effect of temperature on scleroglucan synthesis and organic acid production by Sclerotium glucanicum[J]. Enzyme and Microbial Technology,1995,17:893-899.
[0043] Shrikant A. Survase, Parag S. Saudagar, Rekha S. Singhal. Enhanced production of scleroglucan by Sclerotium rolfsii MTCC2156by use of metabolic precursors[J]. Bioresource Technology,2007,98:410-415.
[0044] (2)產(chǎn)品粘度測定
[0045] (1)所用儀器：冊1-1型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，3#轉(zhuǎn)子，6〇171^11，2〇1：測定。
[0046] (2)測定方法：準(zhǔn)確稱取采用本發(fā)明方法制備的硬葡聚糖產(chǎn)品2. Og溶于200. OmL 蒸餾水中，充分溶脹60min后，采用高剪切均質(zhì)機(jī)均質(zhì)3?5min，靜置30min進(jìn)行粘度測定。
[0047] (3)測定結(jié)果：采用齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010及以上發(fā)酵方法 所得硬葡聚糖產(chǎn)品1% (w/v)的粘度在800mPa. s以上。
[0048] 本發(fā)明所取得的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)效果在于：
[0049] 1、本發(fā)明公開了 一株能夠發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖的齊整小核菌，即齊整小核菌 (Sclerotium rolfsii)SCL2010CCTCC No. M2014325〇
[0050] 2、采用本發(fā)明所述齊整小核菌及其應(yīng)用方法發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖，收率顯著高于現(xiàn) 有工藝，所制備的產(chǎn)品粘度高，穩(wěn)定性良好，粘度變化小，具有良好的應(yīng)用性能。
[0051] 3、本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)液組分采用淀粉、蔗糖和葡萄糖為基礎(chǔ)碳源，價(jià)格便宜；氮源則 采用豆柏粉、玉米漿等常見有機(jī)氮源，操作簡單、安全，價(jià)格低廉。
[0052] 4、本發(fā)明按照發(fā)酵過程中不同階段的功能特點(diǎn)采用分階段控制發(fā)酵條件（尤其 是溫度、PH和溶解氧的控制）工藝，實(shí)現(xiàn)了菌體快速生長與高效產(chǎn)糖的完美結(jié)合，保證的發(fā) 酵過程的穩(wěn)定運(yùn)行。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1 :本發(fā)明所述齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010平板生長圖。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行完整詳細(xì)地描述，顯然，所描述的實(shí)施例 僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0055] 實(shí)施例 1 :齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010 的選育
[0056] 從山東省濰坊市壽光市、高密市、臨朐縣感染白絹病的馬鈴薯植株和塊莖上收集 白絹病菌核，以菌核為分離材料，無菌條件下將菌核接種與PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌核 萌發(fā)菌絲長出后，進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上保存。
[0057] 將分離純化轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上的菌絲分別轉(zhuǎn)接于新的PDA平板上，28°C培養(yǎng)連 續(xù)觀察，待菌絲生長鋪滿平板并結(jié)出菌核，直至菌核變色成熟為止，記錄菌絲生長情況、結(jié) 核及菌核變化情況，結(jié)合顯微鏡觀察確定其中的齊整小核菌菌株并進(jìn)行菌株編號(hào)；將已確 定為齊整小核菌的菌核轉(zhuǎn)接與PDA平板上，觀察記錄菌核萌發(fā)情況、萌發(fā)率、菌絲生長情 況、結(jié)菌核時(shí)間和菌核量。選取菌核萌發(fā)快、萌發(fā)率>75%、結(jié)菌核時(shí)間快（72h左右）、菌 核量多的菌株進(jìn)行硬葡聚糖搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過大量實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過進(jìn)一步分離篩選，選育得到 一株遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、菌核萌發(fā)率高達(dá)80%，硬葡聚糖產(chǎn)率最高達(dá)37g/L的齊整小核菌，該菌 株命名為齊整小核菌（Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株。
[0058] 上述菌株齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010,已于2014年7月6日保藏 在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC， 地址：中國.武漢.武漢大學(xué)），其保藏編號(hào)為CCTCC NO. M2014325。
[0059] 上述斜面培養(yǎng)基組成為（單位：g/L):馬鈴薯200 (經(jīng)水煮爛后過濾），葡萄糖20， 瓊脂20。
[0060] 上述種子培養(yǎng)基組成（單位：g/L):葡萄糖10,酵母膏3,磷酸氫二鉀2. 5,硫酸鎂 1. 5,聚醚消泡劑0. 2,其他為軟化水，pH 4?5。
[0061] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成（單位：g/L):葡萄糖55,豆柏粉1，玉米漿2,磷酸氫二鉀 2, 硫酸鎂1，聚醚消泡劑0. 8,其他為軟化水，pH 4?5。
[0062] 實(shí)施例2 :齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌株18S rDNA的基因序列 測序
[0063] 將實(shí)施例1選育得到的齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌株即CCTCC NO. M2014325菌株委托華大基因測序。
[0064] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0065] (1)將一定量新結(jié)菌核用生理鹽水洗入種子培養(yǎng)基里，28°C培養(yǎng)36h，菌核萌發(fā)產(chǎn) 生大量菌絲后，8000r/min離心獲得菌絲體；
[0066] (2)采用Takara9765真菌DNA提取試劑盒從獲得的菌絲體里提取基因組后送測序 公司測序。
[0067] 測序結(jié)果：齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌株18S rDNA的基因序列 長度為1694bp，具體核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0068] 通過使用美國生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI)BLASTN程序比對(duì)，發(fā)現(xiàn) CCTCC NO. M2014325 菌株 18S rDNA 序列與 NCBI 注冊的多株齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) 18S rDNA序列具有高度同源性，說明CCTCC NO. M2014325菌株是一株齊整小核菌（Sclerotium rolfsii)。進(jìn)一步的，其18S rDNA序列 中堿基之間的序列又不是完全相同，產(chǎn)物用途也有別，說明本發(fā)明菌株與已公開菌株不是 同一菌株。
[0069] 上述種子培養(yǎng)基組成（單位：g/L):葡萄糖10,酵母膏3,磷酸氫二鉀2. 5,硫酸鎂 1. 5,聚醚消泡劑0. 5,其他為軟化水，pH 4?5。
[0070] 實(shí)施例3 :齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌株發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖的 方法
[0071] (1)將齊整小核菌CCTCC No. M2014325的成熟菌核接種于茄形瓶斜面固體培養(yǎng)基 上，30?34°C靜置培養(yǎng)5?7天，以獲得大量成熟菌核用于種子培養(yǎng)。
[0072] (2)將培養(yǎng)成熟的齊整小核菌CCTCC No. M2014325菌核用無菌生理鹽水洗下，適 量接種于種子培養(yǎng)基里，34°C通氣攪拌培養(yǎng)30h。
[0073] (3)硬葡聚糖發(fā)酵生產(chǎn)工藝：
[0074] 將通過種子培養(yǎng)成熟的齊整小核菌CCTCC No. M2014325作為發(fā)酵菌種適量接種到 發(fā)酵培養(yǎng)基里，通氣攪拌控制發(fā)酵以生產(chǎn)硬葡聚糖。
[0075] 優(yōu)選的發(fā)酵控制條件：
[0076] 0 ?24h :溫度 32 ?34°C、pH 4.0 ?5.0、通風(fēng)量 0· lv. v.m.、壓力為 0.04 ? 0. 05MPa、D0 40%。
[0077] 24 ?放罐（60 ?72h):溫度 26 ?28°C、pH 2. 5、通風(fēng)量 I. 5ν· v.m.、壓力為 0· 04 ? 0. 05MPa、D0 10%。
[0078] (4)本實(shí)施例的工藝硬葡聚糖收率為35g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為0· 49g/L/h，1 % (w/v)粘 度為 IlOOmPa. s。
[0079] 上述茄形瓶斜面培養(yǎng)基組成為（單位：g/L):馬鈴薯200 (經(jīng)水煮爛后過濾），葡萄 糖20,瓊脂20。
[0080] 上述種子培養(yǎng)基組成（單位：g/L):葡萄糖20,酵母膏3,硝酸鈉3,磷酸氫二鉀2 ; 硫酸鎂3,聚醚消泡劑0. 5 ;其他為軟化水，pH 4?5。
[0081] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為（單位：g/L):蔗糖35,葡萄糖25,豆柏粉3,玉米漿0.5,磷 酸氫二鉀1，硫酸鎂0. 5,聚醚消泡劑0. 5,其他為軟化水，pH 4?5。
[0082] 實(shí)施例4 :齊整小核菌（Sclerotium rolfsii) SCL2010菌株發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖的 方法
[0083] (1)將齊整小核菌CCTCC No. M2014325的成熟菌核接種于茄形瓶斜面固體培養(yǎng)基 上，30?34°C靜置培養(yǎng)5?7天，以獲得大量成熟菌核用于種子培養(yǎng)。
[0084] (2)將培養(yǎng)成熟的齊整小核菌CCTCC No. M2014325菌核用無菌生理鹽水洗下，適 量接種于種子培養(yǎng)基里，34°C通氣攪拌培養(yǎng)30h。
[0085] (3)硬葡聚糖發(fā)酵生產(chǎn)工藝：
[0086] 將通過種子培養(yǎng)成熟的齊整小核菌CCTCC No. M2014325作為發(fā)酵菌種適量接種到 發(fā)酵培養(yǎng)基里，通氣攪拌控制發(fā)酵以生產(chǎn)硬葡聚糖。
[0087] 優(yōu)選的發(fā)酵控制條件：
[0088] 0 ?24h :溫度 32 ?34 °C、pH 4. 0 ?5. 0、通風(fēng)量 0· 2ν· V. m.、壓力為 0· 04 ? 0. 05MPa、D0 50%。
[0089] 24 ?放罐（60 ?72h):溫度 26 ?28°C、pH 2. 5、通風(fēng)量 I. 5ν· v.m.、壓力為 0· 04 ? 0. 05MPa、D0 12%。
[0090] (4)本實(shí)施例的工藝硬葡聚糖收率為32g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為0· 44g/L/h，1 % (w/v)粘 度為 1220mPa. s。
[0091] 上述茄形瓶斜面培養(yǎng)基組成為（單位：g/L):馬鈴薯200 (經(jīng)水煮爛后過濾），葡萄 糖20,瓊脂20。
[0092] 上述種子培養(yǎng)基組成（單位：g/L):葡萄糖15,酵母膏4,硝酸鈉2. 5,磷酸氫二鉀 2 ;硫酸鎂2,聚醚消泡劑0. 5 ;其他為軟化水，pH 4?5。
[0093] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為（單位：g/L):淀粉25,葡萄糖25,豆柏粉1，玉米漿2,硝酸 鈉1. 5,磷酸氫二鉀2,硫酸鎂1，聚醚消泡劑0. 8,其他為軟化水，pH 4?5。
[0094] 實(shí)施例5 :齊整小核菌（Sclerotium rolfsii)SCL2010菌株發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖的 方法
[0095] (1)將齊整小核菌CCTCC No. M2014325的成熟菌核接種于茄形瓶斜面固體培養(yǎng)基 上，30?34°C靜置培養(yǎng)5?7天，以獲得大量成熟菌核用于種子培養(yǎng)。
[0096] (2)將培養(yǎng)成熟的齊整小核菌CCTCC No. M2014325菌核用無菌生理鹽水洗下，適 量接種于種子培養(yǎng)基里，32?34°C通氣攪拌培養(yǎng)33h。
[0097] (3)硬葡聚糖發(fā)酵生產(chǎn)工藝：
[0098] 將通過種子培養(yǎng)成熟的齊整小核菌CCTCC No. M2014325作為發(fā)酵菌種適量接種到 發(fā)酵培養(yǎng)基里，通氣攪拌控制發(fā)酵以生產(chǎn)硬葡聚糖。
[0099] 優(yōu)選的發(fā)酵控制條件：
[0100] 0 ?24h :溫度 32 ?34°C、pH 4. 0 ?5. 0、通風(fēng)量 0· 3v. v.m.、壓力為 0· 04 ? 0. 05MPa、D0 40%。
[0101] 24 ?放罐（60 ?72h):溫度 26 ?28°C、pH 2. 5、通風(fēng)量 I. 2ν· v.m.、壓力為 0· 04 ? 0. 05MPa、D0 7%。
[0102] (4)本實(shí)施例的工藝硬葡聚糖收率為34g/L，發(fā)酵強(qiáng)度為0· 47g/L/h，1% (w/v)粘 度為 1016mPa. s。
[0103] 上述茄形瓶斜面培養(yǎng)基組成為（g/L):馬鈴薯200 (經(jīng)水煮爛后過濾），葡萄糖20， 瓊脂20。
[0104] 上述種子培養(yǎng)基組成（g/L):葡萄糖10,酵母膏2,硝酸鈉2,磷酸氫二鉀2 ;硫酸鎂 3,聚醚消泡劑1 ;其他為軟化水，pH 4?5。
[0105] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為（g/L):淀粉10,蔗糖45,豆柏粉15,玉米漿15,硝酸鈉1， 磷酸氫二鉀1. 5,硫酸鎂1，聚醚消泡劑1，其他為軟化水，pH 4?5。
【權(quán)利要求】
1. 一株適用于工業(yè)生產(chǎn)硬葡聚糖的齊整小核菌，其特征在于：該菌株名為齊整小核菌 (Sclerotium rolfsii)SCL2010,菌株已于2014年7月6日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，其保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2014325。
2. 權(quán)利要求1所述齊整小核菌在發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：在發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖過程中采用分階段控 制發(fā)酵條件工藝，即： 發(fā)酵0至24h時(shí)發(fā)酵條件為：溫度30?34°C、pH 4. 0?5. 0、通風(fēng)量0. 1?0. 4v. v. m.、 壓力為〇.〇4?0.0510^、溶解氧30%?50%; 發(fā)酵24h至放罐發(fā)酵60?72h時(shí)發(fā)酵條件為：溫度26?28°C、pH 2. 5、通風(fēng)量0. 5? 2. 0v. v. m.、壓力為 0? 04 ?0? 05MPa、溶解氧 5%?15% ; 上述發(fā)酵生產(chǎn)硬葡聚糖過程中所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成為： 碳源：45?60g/L ;豆柏粉1?3g/L ;玉米楽0? 5?2g/L ;硝酸鈉1?3g/L ;磷酸氫二 鉀1?2g/L ;硫酸鎂0. 5?lg/L ;聚醚消泡劑0. 2?lg/L ;余量為軟化水；pH 4?5 ;培養(yǎng) 液中的碳源選自淀粉、蔗糖、葡萄糖、中的一種或其任意重量比例的混合物。
【文檔編號(hào)】C12P19/08GK104371933SQ201410572695
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月23日
【發(fā)明者】董學(xué)前, 張永剛, 武琳, 吉武科, 劉建軍, 王偉 申請(qǐng)人:山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院