一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物及應(yīng)用與方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物及應(yīng)用與方法。所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物的DNA序列為：SPS-F2：5'GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA 3'SPS-R2：5'CATTAGGGCTGTCGAATGGT 3'。應(yīng)用為所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物在鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量中的應(yīng)用。方法包括前處理和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟。本發(fā)明通過(guò)對(duì)烤煙在團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期、打頂后、成熟期5個(gè)生育期的SPS酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，從而明確不同生育期蔗糖磷酸合成酶基因的變化特點(diǎn)，揭示烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點(diǎn)，并為改善烤煙品質(zhì)提供理論依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物及應(yīng)用與 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于鑒定檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因 (SPS)表達(dá)量的引物及應(yīng)用與方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 烤煙是世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉的品質(zhì)與其糖含量密切相關(guān)，水溶性糖 與氨基酸發(fā)生梅拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生多種香氣物質(zhì)。而蔗糖是主要的水溶性糖之一，它也是 煙草光合作用的主要產(chǎn)物，蔗糖可以為煙草的生長(zhǎng)提供碳源和能量，同時(shí)，也是細(xì)胞代謝的 調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、貯藏蛋白和編碼酶的基因的表達(dá)。
[0003] 與鹿糖代謝密切相關(guān)的酶主要有轉(zhuǎn)化酶（Invertase,Inv)、鹿糖合成酶（Sucrose Synthase,SuSy)和鹿糖憐酸合成酶（SucrosePhosphateSynthase,SPS)。SPS是調(diào)控植 物蔗糖合成的關(guān)鍵酶之一，其活力直接影響光合產(chǎn)物的分配，研究表明其與蔗糖形成呈正 相關(guān)。SuSy是一種可逆酶，既可催化蔗糖的合成，又可催化蔗糖的分解，通常認(rèn)為，它主要起 分解蔗糖的作用，能為細(xì)胞壁提供合成底物和合成淀粉。Inv酶與植物體內(nèi)形成蔗糖梯度相 關(guān)，Bachelier等研究表明，處在細(xì)胞壁中的轉(zhuǎn)化酶能調(diào)節(jié)鹿糖從韌皮部卸出，并且控制鹿 糖吸收速度，而在液泡中的轉(zhuǎn)化酶則可以調(diào)節(jié)蔗糖和己糖的貯存。
[0004] 為揭示烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點(diǎn)，為改善烤煙品質(zhì)提供理論依據(jù)，需 要明確不同生育期蔗糖代謝主要酶活性及酶基因的變化特點(diǎn)，目前，還沒(méi)有一種較好的方 法以達(dá)成以上目的，因此，開(kāi)發(fā)一種能解決上述問(wèn)題的測(cè)定方法是非常必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物；第 二目的在于提供所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物的應(yīng)用；第三目的在于 提供所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表 達(dá)量的方法。
[0006] 本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的 引物的DNA序列為： SPS-F2 :5'GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA3' SPS-R2 :5'CATTAGGGCTGTCGAATGGT3' 。
[0007] 本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的 引物在鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括前處理、PCR反應(yīng)、電泳檢測(cè)步驟，具體包 括： A、 前處理：提取待測(cè)烤煙樣品的基因組總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA; B、PCR反應(yīng)：以cDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增； 本發(fā)明通過(guò)對(duì)烤煙在團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期、打頂后、成熟期5個(gè)生育期的SPS酶基因 的表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，從而明確不同生育期蔗糖代謝主要酶SPS酶基因的變化特點(diǎn)，揭示 烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點(diǎn)，并為改善烤煙品質(zhì)提供理論依據(jù)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為烤煙品種z? 87在不同生育期SPS酶基因的表達(dá)情況不意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基 于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011] 本發(fā)明所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因（SPS)表達(dá)量的引物，其DNA序列為： SPS-F2 :5'GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA3' SPS-R2 :5'CATTAGGGCTGTCGAATGGT3' 。
[0012] 本發(fā)明的應(yīng)用為所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物在鑒定烤煙 蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物鑒定烤煙蔗糖磷酸合 成酶基因表達(dá)量的方法，包括前處理和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，具體包括： A、 前處理：提取待測(cè)烤煙樣品的基因組總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA; B、PCR反應(yīng)：以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0014]B步驟中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2XSYBRPremix12. 5μ1，F(xiàn)orward Primer0· 4μM，ReversePrimer0· 4μM，Rox1μM，加ddH20 補(bǔ)充至 25μ1。
[0015]B步驟中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95°C30secI個(gè)循環(huán)；95°C5sec, 58 °C30sec45 個(gè)循環(huán)；95°C30sec，58°CImin，95°CImin1 個(gè)循環(huán)。
[0016] 本發(fā)明的具體操作如下： 1.材料與方法 I. 1供試材料：試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在玉溪研和基地，采集云煙87的第12片葉（自下而上)在移 栽后第20天（團(tuán)棵期）、第40天(旺長(zhǎng)期)、第60天(現(xiàn)蕾期)、第80天(打頂后)、第100天 (成熟期)，將新鮮煙葉Ig放入液氮罐冷凍后，置于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0017] 1.2試驗(yàn)方法： 1. 2. 1總RNA的提取 總RNA提取按照RNAisoPlus和RNAisonateforPlantTissue試劑盒（寶生物工 程（大連）有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用核酸蛋白紫外分析儀檢測(cè)A260 /A280的比值以鑒 定RNA抽提質(zhì)量，1. 8 <A260 /A280 < 2. 0,表明總RNA質(zhì)量較好，同時(shí)測(cè)定其標(biāo)本總RNA 濃度。
[0018]L2. 2總RNA的反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit試劑盒(寶生物工程 (大連）有限公司）進(jìn)行，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0019] 1.2.3引物設(shè)計(jì) 選擇內(nèi)參基因Actin以及3個(gè)關(guān)鍵酶基因：蔗糖合成酶基因、蔗糖磷酸合成酶基因以 及蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)原則，避免引物3端互補(bǔ)，以及 "發(fā)卡"結(jié)構(gòu)，引物的長(zhǎng)度為18?22bp，注意到堿基的隨機(jī)分配，GC含量在40%?60%之 間，擴(kuò)增片段小于200bp。并應(yīng)用Primer3 (v. 0.4.0)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物。引物合 成由Invitrogen公司完成。引物序列見(jiàn)下表。
[0020] 表1弓丨物序列

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物，其特征在于所述的鑒定烤煙蔗糖 磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物的DNA序列為： SPS-F2 :5' GGTGGTTTTCGTTGGAGAAA 3' SPS-R2 :5' CATTAGGGCTGTCGAATGGT 3' 。
2. -種權(quán)利要求1所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物的應(yīng)用，其特征 在于所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物在鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因 表達(dá)量中的應(yīng)用。
3. -種權(quán)利要求1所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物鑒定烤煙蔗糖 磷酸合成酶基因表達(dá)量的方法，其特征在于包括前處理和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)驟，具體 包括： A、 前處理：提取待測(cè)烤煙樣品的基因組總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA ; B、 PCR反應(yīng)：以cDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物鑒定烤 煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的方法，其特征在于B步驟中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為： 2XSYBR Premix 12. 5 μ 1, Forward Primer 0. 4 μ M, Reverse Primer 0. 4 μ M, Rox 1 μ Μ, 加 ddH20補(bǔ)充至25 μ?。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的鑒定烤煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的引物鑒定烤 煙蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量的方法，其特征在于Β步驟中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為： 95? 30 sec 1 個(gè)循環(huán)；95°C 5 sec，58 ? 30 sec 45 個(gè)循環(huán)；95? 30 sec，58 °C 1 min， 95 °C 1 min 1 個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104278103SQ201410574793
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月25日
【發(fā)明者】馬俊紅, 李軍營(yíng), 馬二登 申請(qǐng)人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院