一種同時(shí)檢測(cè)豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測(cè)豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方法。本發(fā)明首先篩選出具有該病原體基因型特點(diǎn)的保守性基因片段，作為PCR檢測(cè)的三個(gè)基因靶點(diǎn)，分別合成擴(kuò)增這些靶點(diǎn)基因的引物；然后將3個(gè)基因片段的3對(duì)引物放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系，建立直接從樣品中一次檢測(cè)三種病原體的三重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明一方面既可以準(zhǔn)確檢測(cè)病原體，還可以對(duì)混合感染狀況進(jìn)行分析，從而掌握其疫情流行發(fā)展趨勢(shì)，起到一箭雙雕的效果。另一方面其較常規(guī)PCR方法縮短了24小時(shí)的檢測(cè)時(shí)間，達(dá)到了快速檢測(cè)實(shí)際樣品的目的，并降低了成本。
【專利說明】一種同時(shí)檢測(cè)豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜 血桿菌的三重PCR方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】的多重PCR檢測(cè)方法，具體是一種能同時(shí)檢測(cè)豬肺 炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬呼吸道疾病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重要群發(fā)性疾病之一。研究表明，豬呼吸道疾 病是由一種或多種細(xì)菌、病毒混合感染引起的疾病。通常由病毒或支原體首先侵襲呼吸道， 破壞防御屏障，各種氣源性病菌如多殺性巴氏桿菌以及副豬嗜血桿菌等進(jìn)入呼吸道和肺部 而造成繼發(fā)或混合感染。豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是的主要原發(fā) 性病原之一，由于豬群感染MPS后難以治愈，且該病難以凈化，避免接觸MPS是最有效的預(yù) 防措施，因此早期快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)診斷十分必要。豬肺炎支原體是一種介于細(xì)菌和病毒 之間的原核生物，其對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，且在培養(yǎng)過程能夠使PH值升高，通過酚紅可以 看到液體培養(yǎng)基變紅，一般作為分離豬肺炎支原體的初步判斷。然而這種檢測(cè)費(fèi)時(shí)且主觀 性強(qiáng)，難以達(dá)到準(zhǔn)確診斷。另一個(gè)豬呼吸道常見病原體，豬多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)屬革蘭氏陰性菌，用印度墨汁等染料染色時(shí)可以看到清晰的莢膜，主要導(dǎo)致豬 的出急性血性敗血癥、豬肺疫和萎縮性鼻炎，常與其他病毒和細(xì)菌呈混合感染或者繼發(fā)感 染。對(duì)巴氏桿菌的鑒定多采用形態(tài)觀察、生理生化鑒定及其免疫學(xué)鑒定等傳統(tǒng)的方法，這些 方法耗時(shí)耗力且準(zhǔn)確度差，因此僅僅依靠常規(guī)檢驗(yàn)方法和臨床經(jīng)驗(yàn)很難對(duì)病原進(jìn)行判斷， 進(jìn)而會(huì)貽誤動(dòng)物疫病的防控的最佳時(shí)機(jī)；而副豬嗜血桿菌則是一種革蘭氏陰性菌，能夠引 起豬纖維性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎等，且常與豬呼吸道疾病有關(guān)。副豬嗜血桿菌是比豬肺 炎支原體還要難培養(yǎng)的病原菌之一，目前對(duì)其的分離檢測(cè)要比養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際感染率少20%以 上，其通常與豬肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌、豬繁殖與呼吸病毒等病原菌混合感染，由于 其培養(yǎng)條件苛刻，限制了對(duì)其的研究。因此，建立一種靈敏快速的檢測(cè)豬上述呼吸道三種常 見病原體方法十分必要。
[0003] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，于一個(gè)PCR反應(yīng)體 系中加入多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的 PCR技術(shù)。其可在同一 PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于以上三種病原體豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌均是豬場(chǎng) PRDC的常見重要病原體，且往往是混合感染。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)如細(xì)菌分離、免疫學(xué)試驗(yàn)等費(fèi) 時(shí)費(fèi)力，不適于臨床快速診斷，也不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)狀，本發(fā)明目的在于克 服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種直接從樣品中一次檢測(cè)豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和 副豬嗜血桿菌的三重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明方法簡單，成本低廉，檢測(cè)快速，效率高。
[0005] 本發(fā)明本著一次檢測(cè)就可以檢出樣品中三種病原體的目標(biāo)，首先從已發(fā)表的文獻(xiàn) 中分別篩選出具有豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌三病原體基因型特點(diǎn) 的保守性基因片段，作為PCR檢測(cè)的三個(gè)基因靶點(diǎn)，分別合成擴(kuò)增這些靶點(diǎn)基因的引物，將 該3對(duì)引物放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系，通過各項(xiàng)參數(shù)調(diào)整優(yōu)化，建立直接從樣品中一次檢測(cè)三 種病原體的三重PCR檢測(cè)方法；本發(fā)明還進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)場(chǎng)樣品前處理方法，通過縮短前處 理時(shí)間，進(jìn)一步達(dá)到利用該三重PCR方法快速檢測(cè)實(shí)際樣品的目的。
[0006] 本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007] -種同時(shí)檢測(cè)豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方 法，具體步驟如下：
[0008] (1)篩選具有豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌三個(gè)病原體基因 型特點(diǎn)的保守性基因片段，作為PCR檢測(cè)的三個(gè)基因靶點(diǎn)，分別合成擴(kuò)增上述靶點(diǎn)基因的 引物；
[0009] (2)將3對(duì)引物放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，擴(kuò)增靶點(diǎn)基因；
[0010] ⑶通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中：
[0011] 擴(kuò)增豬肺炎支原體的上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示；擴(kuò)增豬多殺性巴氏桿菌的上游引物的序列如SEQ ID NO. 3所示；下游引物的 序列如SEQ ID NO. 4所示；擴(kuò)增副豬嗜血桿菌的上游引物的序列如SEQID NO. 5所示；下游 引物的序列如SEQ ID NO. 6所示（見表1)。
[0012] 表1引物序列及PCR產(chǎn)物

【權(quán)利要求】
1. 一種同時(shí)檢測(cè)豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的三重PCR方法， 其特征在于，具體步驟如下： (1) 篩選具有豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌三個(gè)病原體基因型特 點(diǎn)的保守性基因片段，作為PCR檢測(cè)的三個(gè)基因靶點(diǎn)，分別合成擴(kuò)增上述靶點(diǎn)基因的引物； (2) 將3對(duì)引物放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，擴(kuò)增靶點(diǎn)基因； (3) 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中： 擴(kuò)增豬肺炎支原體的上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示； 擴(kuò)增豬多殺性巴氏桿菌的上游引物的序列如SEQ ID NO. 3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 4 所示； 擴(kuò)增副豬嗜血桿菌的上游引物的序列如SEQ ID NO. 5所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 6所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步驟（1)中，豬肺炎支原體的保 守性基因片段為Sp36基因，豬多殺性巴氏桿菌的保守性基因片段為KMT基因，副豬嗜血桿 菌的保守性基因片段為Trimeric autotransporter基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，步驟⑵中，PCR反應(yīng)體系如下： cDNA模板1μ 1，3對(duì)上、下游引物各0. 5μ 1，PCR Mix 12. 5μ 1，超純水補(bǔ)充至50μ 1 ;PCR反 應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，進(jìn)入95°C 60s，58°C lmin和72°C lmin的循環(huán)，循環(huán)35次，最后 72°C 延伸 5min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重PCR方法，其特征在于，對(duì)實(shí)際待檢測(cè)樣品前處理時(shí)，選 擇豬多殺性巴氏桿菌、豬肺炎支原體都適宜的TSB培養(yǎng)基，將現(xiàn)場(chǎng)采到組織樣品直接接種 在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，取菌液提取豬被檢病原體DNA樣品，作為模板，進(jìn)行三重 PCR檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263845SQ201410576967
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】朱建國, 韓少鵬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)