用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組和試劑盒。本發(fā)明的引物探針組的核酸序列如SEQ ID NO：1-12所示。本發(fā)明的檢測試劑盒包括主反應液混合物和引物探針組，其核酸序列如SEQ ID NO：1-6所示，其中，SEQ ID NO：1-2所示的序列作為公共引物，用于對瘧原蟲的檢測，SEQ ID NO：3-6所示的序列作為探針，分別用于對惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲進行分型檢測。本發(fā)明的試劑盒擴增反應條件高度一致，大大提高檢測效率，保證了單重、雙重、三重、四重的反應環(huán)境更均一、更穩(wěn)定、更高效，能簡便快速對惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲分型鑒別。
【專利說明】用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組和試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物 探針組和試劑盒。

【背景技術】
[0002] 目前瘧疾診斷的主要方法以鏡檢和膠體金為主。鏡檢不但需要操作者具有豐富的 經驗，而且有一定的局限性。當原蟲密度較低（〈50個/μ 1血）時，靠鏡檢難以查到原蟲， 容易出現(xiàn)漏診；由于國內少見三日瘧和卵形瘧，容易將兩者誤判為形態(tài)和臨床癥狀相似的 間日瘧和惡性瘧；當發(fā)生瘧原蟲混合感染時，鏡檢不易將惡性瘧的環(huán)狀體或早期滋養(yǎng)體與 間日瘧的環(huán)狀體區(qū)分開，特別是用藥后蟲體形態(tài)發(fā)生變化，蟲種鑒別較難，容易出現(xiàn)誤診， 并只按單一瘧原蟲感染進行治療，影響治療效果；鏡檢耗時，不適用于大量人群的篩查。因 此，傳統(tǒng)的"金標準"鏡檢法已不是瘧疾評價效率較高的診斷方法。瘧疾的膠體金雖然快速， 但對原蟲密度低的血樣也易漏診，而且僅能判斷惡性瘧感染，不能區(qū)分間日瘧、三日瘧和卵 形瘧感染以及混合感染。為了配合衛(wèi)生部和檢驗檢疫機構等多部委制定的"中國消除瘧疾 行動計劃（2010-2020年）"，有效控制輸入性瘧疾尤其是惡性瘧的傳入，檢驗檢疫機構必須 在口岸加強對自東南亞、非洲等瘧疾高流行區(qū)返鄉(xiāng)人員瘧疾的檢測和監(jiān)測，迫切需要建立 瘧疾新型的快速、準確和高效的檢測方法。
[0003] 多重實時熒光PCR技術是將PCR技術和多色熒光標記探針相結合的先進技術，該 方法具有快速、特異、靈敏、自動化程度高等特點，結合防污染技術處理，特別適合于大規(guī) 模、快速診斷的需求。該技術采用多色熒光對多條種特異性探針進行標記，配合多重PCR技 術，可以在同一個PCR反應管中對多個病原體同時進行擴增，各色熒光的增長信號與相應 PCR產物的增長量成等比關系，并被自動化熒光檢測儀收集，最后可通過分析熒光增長曲線 達到診斷病毒類型的目的；反應時間快，整個反應約〇. 5小時-1小時完成；不需要檢測后 的電泳操作，減少了實驗室污染。但目前尚未見多重熒光PCR用于瘧原蟲分型檢測。


【發(fā)明內容】

[0004] 為克服上述技術缺陷，本發(fā)明提供了用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組 和試劑盒。該引物探針組和試劑盒可以實現(xiàn)對惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形 瘧原蟲快速簡便的分型檢測。
[0005] 本發(fā)明的瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組，其核酸序列如SEQ ID NO :1-12 所示。所述分型包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲四種型別。
[0006] 本發(fā)明的用于瘧原蟲多重熒光分型檢測試劑盒，包括主反應液混合物，還包括引 物探針組，所述引物探針組的核酸序列如SEQ ID NO :1-6所示，所述核酸序列如SEQ ID NO: 1-2所示的序列作為公共引物，用于對瘧原蟲的檢測，所述核酸序列如SEQ ID NO :3-6所示 的序列作為探針，分別用于對惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲進行分型 檢測。
[0007] 具體如下：
[0008] SEQ ID NO :1 5'-TGTTGCAGTTAAAACGCTCG-3'
[0009] SEQ ID NO :2 5'-TCAATTTTGTTATTCCATGCTGT-3'
[0010] 惡性瘧原蟲（PF)的探針5端標記FAM、3端標記BHQ1，擴增長度為289bp，探針的 核酸序列如下：
[0011] SEQ ID NO :3PF-P 5'-FAM-CCGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGGG-BHQl-3'
[0012] 間日瘧原蟲（PV)的探針5端標記VIC，3端標記BHQ2,擴增長度為264bp，探針的 核酸序列如下：
[0013] SEQ ID NO:4PV-P 5'-VIC-TGATACTTCGTATCGACTTTGTGCGCAT-BHQ2-3'
[0014] 三日瘧原蟲（PM)的探針5端標記ROX，3端標記BHQ2,擴增長度為300bp，探針的 核酸序列如下：
[0015] SEQ ID NO:5PM-P 5'-R0X AGAATAAACGCCAAGCGTTATATTTTTTCTG-BHQ2-3'
[0016] 卵形瘧原蟲（PO)的探針5端標記CY5,3端標記BHQ2,擴增長度為290bp，探針的 核酸序列如下：
[0017] SEQ ID NO:6P0 5'-CY5-ACAACGTATCTGTTCTTTGCATTCCTTATG-BHQ2-3'
[0018] 利用本發(fā)明的瘧原蟲多重熒光檢測試劑盒按如下方法檢測，多重熒光PCR反應選 用的QPCR主反應液混合物為試劑盒HR Qpcr Master Mix(中國CYbio公司產品）中的主 反應液混合物，每個反應管的反應體系如下：
[0019] 2 X QPCR 主反應混合物：12. 5 μ 1 ;
[0020] 10μΜ 正向引物：1· 25μ 1 ;
[0021] 10μΜ 反向引物：1· 25μ 1 ;
[0022] 10μΜ 探針：0· 625μ 1 ;
[0023] 模板DNA:5yl;
[0024] 超純水補足到反應總體積25 μ L。
[0025] 擴增和檢測選用ABI7500HT Fast熒光定量PCR儀器上進行。
[0026] 瘧原蟲多重熒光PCR反應程序如下：95°C 5min，95°C 10秒一58°C 45秒，40次循 環(huán)，在58°C收集熒光。熒光檢測通道在FAM、VIC、CY5和R0X。
[0027] 本試劑盒在陰性對照和陽性對照成立的前提下，根據(jù)以下條件進行結果判定：
[0028] (1)某種種類瘧原蟲探針對應的檢驗樣本無明顯擴增曲線，且檢測不到Ct值時， 判斷為該種類瘧原蟲熒光PCR檢測陰性；
[0029] (2)某種種類瘧原蟲探針對應的檢驗樣本Ct值< 35,并有明顯擴增曲線，判斷為 該種類瘧原蟲熒光PCR檢測陽性；
[0030] (3)某種種類瘧原蟲探針對應的檢驗樣本Ct值大于35且小于40的標本應重做。
[0031] 若重做結果仍然有明顯擴增曲線，則判斷為該種類瘧原蟲熒光PCR檢測陽性，否 則為陰性。
[0032] 本發(fā)明的惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲的多色定量PCR檢測 (Q-PCR)試劑盒使用一對通用的"公共引物"與四條具備分型能力的"特異探針"，且擴增反 應條件也高度一致，大大提高檢測效率，保證了單重、雙重、三重、四重的反應環(huán)境更均一、 更穩(wěn)定、更1?效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是惡性瘧原蟲（PF)的單重熒光PCR反應與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應的結果比較圖；其中，虛線是PF單色，實 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0034] 圖2是間日瘧原蟲（PV)的單重熒光PCR反應與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應的結果比較圖；其中，虛線是PV單色，實 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0035] 圖3是卵形瘧原蟲（PO)的單重熒光PCR反應與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應的結果比較圖；其中，虛線是PO單色，實 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0036] 圖4是三日瘧原蟲（PM)的單重熒光PCR反應與惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲 (PV)、三日瘧原蟲（PM)、卵形瘧原蟲（PO)多重反應的結果比較圖；其中，虛線是PM單色，實 線是多色PF/PV/PM/P0 ;
[0037] 圖5為瘧原蟲多重熒光PCR的特異性分析實驗結果圖。

【具體實施方式】
[0038] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
[0039] 本發(fā)明所用的試劑來源情況如下：
[0040] 痕原蟲核酸提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Extraction Minikit):購自德國 Qiagen 公司；
[0041] SYBR 熒光 PCR 試劑（QuantiTect SYBR Green PCR Kit):購自德國 Qiagen 公司；
[0042] 探針法熒光PCR試劑（TaqMan? Fast Universal PCR Master Mix)購自美國 ABI 公司；
[0043] HR Qpcr Master Mix 購自中國 CYbio 公司；
[0044] PCR 試劑盒 HotStarTaq PCR Master Mix 購自德國 QIAGEN 公司；
[0045] LAMP檢測試劑購自廣州迪澳公司；
[0046] 吉氏染色液購自珠海貝索生物公司。
[0047] 實施例1 :用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組的設計
[0048] 本發(fā)明中的PCR檢測引物和探針由發(fā)明人設計，設計公共引物實現(xiàn)對瘧原蟲的檢 測，通過四個特異性探針，實現(xiàn)對惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲四種型 別的分型檢測。引物探針委托廣州裒源生物公司合成。
[0049] 引物探針組序列見表1。
[0050] 表 1
[0051]

【權利要求】
1. 用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的引物探針組，其特征在于， 所述分型包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲四種型別； 所述引物探針組的核酸序列如SEQ ID N0:l-6所示。
2. 用于瘧原蟲多重熒光分型檢測的試劑盒，包括主反應液混合物，其特征在于，還包括 引物探針組，所述引物探針組的核酸序列如SEQ ID NO :1-6所示， 所述核酸序列如SEQ ID NO :1-2所示的引物用于瘧原蟲的檢測； 所述核酸序列如SEQ ID NO :3所示的探針用于惡性瘧原蟲的檢測； 所述核酸序列如SEQ ID NO :4所示的探針用于間日瘧原蟲的檢測； 所述核酸序列如SEQ ID NO :5所示的探針用于三日瘧原蟲的檢測； 所述核酸序列如SEQ ID NO :6所示的探針用于卵形瘧原蟲的檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263847SQ201410583682
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權日:2014年10月27日
【發(fā)明者】師永霞, 黃吉城, 李燕, 李小波, 蘇錦坤, 鄭夔, 方盛藩, 馮慶文 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心