一種苦瓜白粉病菌的保存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種苦瓜白粉病菌的保存方法，是將病葉上的白粉菌接種到易感病的離體苦瓜葉片上，待葉片上產(chǎn)生新的白粉層后，挑出單個孢子或單條孢子梗，接種到無菌苗的離體葉片上進行純化，產(chǎn)生新菌落后再接種到無菌苦瓜子葉上，待子葉表面產(chǎn)生新菌落時，再密封保存。在離體條件下，本方法可保存苦瓜白粉病菌150d以上。本發(fā)明是在人工條件下對苦瓜白粉病的進行純化和保存，本方法具有占用空間小，保存時間可控的優(yōu)點，本發(fā)明為苦瓜白粉病的鑒定和防治，苦瓜抗白粉病新品種的選育和苦瓜白粉病菌生物學(xué)研究提供了極大方便，具有較高的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種苦瓜白粉病菌的保存方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病理【技術(shù)領(lǐng)域】中一種專性寄生菌的保存方法，尤其是涉及一種苦瓜白粉病菌的保存方法。

【背景技術(shù)】
[0002]苦瓜(Momordica charantia L.),又名涼瓜,是葫蘆科一年生攀緣草本植物?？喙鲜侨藗兿矏鄣囊环N蔬菜，原產(chǎn)地中國。在東南亞、中國、和加勒比海群島均有廣泛的種植。隨著苦瓜種植面積和規(guī)模的逐漸擴大，苦瓜病害發(fā)病率也日益嚴(yán)重。
[0003]苦瓜白粉病是苦瓜生產(chǎn)中常見的主要病害之一,屬于氣候性病害,主要在春秋兩季爆發(fā)流行，由于白粉病菌是一種專性寄生菌，只能寄生于活體寄主植物上，不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此難以在離體的條件下進行純化和長期的保存?，F(xiàn)有技術(shù)報道中的一些關(guān)于苦瓜白粉病菌的純化和保存方法大都是在春秋白粉病流行季節(jié)，將白粉病菌接種到感病的寄主植物上進行多次單對單轉(zhuǎn)接純化并保存，保存期限大概一個月左右。此類方法具有受環(huán)境和季節(jié)影響，占用空間大，工作量大和保存時間短的缺點，同時由于田間的白粉病菌含有大量雜菌造成純度較低，不能滿足后續(xù)研究工作的需求，比如白粉病菌鑒定、分子生物學(xué)研究、殺菌劑研制等都需要大量的純化的活體致病菌。因此，迫切需要一種高效的苦瓜白粉病菌的純化和保存方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明根據(jù)苦瓜的白粉病菌只能寄生于活體植物上的特點，提供一種苦瓜白粉病菌離體條件下的保存方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
[0006]一種苦瓜白粉病菌的保存方法，是將田間發(fā)病葉上的白粉菌接種到易感病的健康離體苦瓜葉片表面，置于28°C /16h、20°C /8h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，產(chǎn)生新的白粉層后，在無菌條件下，挑出單個孢子或單條孢子梗，接種到無菌苗的離體葉片上純化，產(chǎn)生新菌落后接種到無菌苦瓜子葉上，待子葉表面產(chǎn)生新菌落時，再置于溫度10°C?12°C、8h/16h光暗交替的條件下密封保存，在離體條件下，本方法可以保存白粉病菌150d以上。
[0007]本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，其步驟如下:
[0008](I)苦瓜白粉病菌的誘導(dǎo):先將苦瓜病葉上的白粉菌接種到健康離體苦瓜葉片上，然后將離體苦瓜葉片放入培養(yǎng)皿中，密封置于光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，誘導(dǎo)新的白粉病菌；
[0009](2)苦瓜無菌葉片和無菌子葉的準(zhǔn)備:將易感病材料的種子消毒后接種于培養(yǎng)基中，獲得無菌苗后，將長至寬3cm左右的葉片切下放入培養(yǎng)皿中待用；從下胚軸Icm處切下帶子葉的莖段并去掉側(cè)芽，插入每孔盛有3ml營養(yǎng)液的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入消毒的帶蓋盒子中待用；
[0010](3)苦瓜白粉病菌的純化:在無菌條件下，將誘導(dǎo)新生成的白粉病菌，在解剖鏡下挑出單個孢子或單根孢子梗，接種到準(zhǔn)備好的無菌苗離體葉片上，密封置于光暗交替條件下保濕培養(yǎng)純化；
[0011](4)苦瓜白粉病菌的保存:將純化后的白粉病菌接種到插入盛有營養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的無菌子葉上，再將細(xì)胞培養(yǎng)板放入消毒的帶蓋盒子中，密封置于光暗交替條件下進行培養(yǎng)，待子葉表面生產(chǎn)新的菌落后，再置于溫度10°c?12°C、光暗8h/16h條件下保存。
[0012]作為優(yōu)選，步驟⑴中所述葉片為易感病材料側(cè)枝上新生的第4?5張且小于9cm的幼嫩葉片。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(I)、(3)中所述光暗交替條件為281:/1611，201:/811，光照強度為2000Luxo
[0014]作為優(yōu)選，步驟(4)所述光暗交替條件為溫度10°C?12°C、光暗8h/16h，光照強度為 2000Lux。
[0015]作為優(yōu)選，步驟(2)中所述培養(yǎng)基為外加蔗糖20g/L、瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基；所述營養(yǎng)液為外加苯并咪唑100g/L、蔗糖15g/L的1/2MS培養(yǎng)基，其中1/2MS為大量元素減半的MS培養(yǎng)基。
[0016]本發(fā)明的有益.效果
[0017]1、本發(fā)明利用苦瓜子葉生命周期長的特點，將純化后的白粉病菌在苦瓜子葉上進行保存，打破了環(huán)境和季節(jié)對白粉病發(fā)病的制約，本發(fā)明的保存方法具有占用空間小、保存時間長的優(yōu)點。
[0018]2、本發(fā)明解決了當(dāng)前苦瓜白粉病菌保存時間短的問題，為苦瓜白粉病的鑒定和防治，苦瓜抗白粉病新品種的選育以及苦瓜白粉病菌生物學(xué)研究提供極大方便，具有較高的應(yīng)用價值。

【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。
[0020]實施例
[0021]1、供試的植物材料
[0022]純化白粉病菌用的苦瓜離體葉片為田間采集易感病材料MC105側(cè)枝上新生的第4張且小于9cm的健康幼嫩葉片；純化用的無菌離體葉片和保存用的子葉為易感病的苦瓜材料MC105種子播種于MS培養(yǎng)基中所獲得。
[0023]2、實施步驟
[0024]2.1苦瓜白粉病菌的采集和分離
[0025]田間采集感病材料MC105尚保持綠色的病葉，將白粉菌接種到健康離體苦瓜葉片上，將離體葉片放入裝有濾紙的培養(yǎng)皿中，密封置于28°C /16h，20°C /8h的條件下光暗交替保濕培養(yǎng)誘導(dǎo)新的白粉病菌。待第4d可觀察到葉表面產(chǎn)生新的模糊白粉層，第7?1d的白粉層加厚，即可用于純化。
[0026]2.2苦瓜無菌葉片和無菌子葉的準(zhǔn)備
[0027]將易感病材料MC105的種子消毒后接種于外加蔗糖20g/L、瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基中，第5d種子萌發(fā)，獲得無菌苗，第1d左右時將長至寬3cm左右的葉片切下放入裝有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中待用；從下胚軸Icm處切下帶子葉的莖段并去掉側(cè)芽，插入每孔盛有3ml營養(yǎng)液的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，不蓋蓋子，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入消毒的帶蓋盒子中待用。
[0028]2.3苦瓜白粉病菌的純化
[0029]在無菌條件下將誘導(dǎo)新生成的白粉病菌，在解剖鏡下挑出單個孢子或單條孢子梗，接種到無菌苗離體葉片上，密封置于28°C /16h，20°C /8h的條件下光暗交替保濕培養(yǎng)純化，第7d左右，用肉眼可見新產(chǎn)生的菌落。
[0030]2.4苦瓜白粉病菌的保存
[0031]將純化的白粉病菌接種到無菌子葉上，將不蓋蓋子的細(xì)胞培養(yǎng)板放入消毒的帶蓋盒子中，密封后置于28°C /16h，20°C /8h的條件下光暗交替培養(yǎng)，第1d左右，子葉表面產(chǎn)生新的菌落，然后置于溫度10°C?12°C、光暗8h/16h條件下保存。
[0032]3、苦瓜白粉病菌保存效果
[0033]接菌的子葉在溫度10°C?12°C、光暗8h/16h條件下保存，150d子葉仍能保持較青綠，說明此時的子葉還是白粉病菌的活體寄主植物，把接菌子葉置于28°C /16h，20°C /8h的條件下光暗交替恢復(fù)生長3d，將子葉上的白粉菌接種到健康的易感苦瓜材料葉片上，致病效果跟前述一樣，說明在子葉上保存了 150d的白粉病菌仍有較強的致病力。
[0034]前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。
【權(quán)利要求】
1.一種苦瓜白粉病菌的保存方法，其具體步驟如下: (1)苦瓜白粉病菌的誘導(dǎo):先將苦瓜病葉上的白粉菌接種到健康離體苦瓜葉片上，然后將離體苦瓜葉片放入培養(yǎng)皿中，密封置于光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，誘導(dǎo)新的白粉病菌； (2)苦瓜無菌葉片和無菌子葉的準(zhǔn)備:將易感病材料的種子消毒后接種于培養(yǎng)基中，獲得無菌苗后，將長至寬3cm左右的葉片切下放入培養(yǎng)皿中待用；從下胚軸Icm處切下帶子葉的莖段并去掉側(cè)芽，插入每孔盛有3ml營養(yǎng)液的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入消毒的帶蓋盒子中待用； (3)苦瓜白粉病菌的純化:無菌條件下，將誘導(dǎo)新生成的白粉病菌，在解剖鏡下挑出單個孢子或單條孢子梗，接種到準(zhǔn)備好的無菌苗離體葉片上，密封置于光暗交替條件下保濕培養(yǎng)純化； (4)苦瓜白粉病菌的保存:將純化后的白粉病菌接種到插入盛有營養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的無菌子葉上，再將細(xì)胞培養(yǎng)板放入消毒的帶蓋盒子中，密封置于光暗交替條件下進行培養(yǎng)，待子葉表面生產(chǎn)新的菌落后，再置于溫度10?12°C，光暗8h/16h條件下保存。
2.如權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于:步驟(I)中所述葉片為易感病材料側(cè)枝上新生的第4?5張且小于9cm的幼嫩葉片。
3.如權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于:步驟(I)和(3)中所述光暗交替條件為28 V /16h，20°C /8h ;步驟(4)中所述光暗交替條件則為溫度10?12°C，光暗8h/16h，光照強度均為2000LUX。
4.如權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于:步驟(2)中所述培養(yǎng)基為外加蔗糖20g/L、瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基；所述營養(yǎng)液為外加苯并咪唑100g/L、蔗糖15g/L的1/2MS培養(yǎng)基，其中1/2MS為大量元素減半的MS培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12N1/04GK104293670SQ201410583749
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】黃如葵, 陳小鳳, 黃熊娟, 劉萌芽, 黃玉輝, 馮誠誠, 陳振東, 梁家作, 劉杏連, 車江旅 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所