一株高產(chǎn)dha裂殖壺菌菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)DHA裂殖壺菌菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)BLCY-01，2014年07月15日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No：9461。本發(fā)明還涉及該菌株的培養(yǎng)方法與應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)過培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)酵54～72h后裂殖壺菌的生物量達(dá)到30～45g/L，DHA含量達(dá)到8.6～12.5g/L，較現(xiàn)有專利和文獻(xiàn)報(bào)道的微生物發(fā)酵產(chǎn)量高。
CGMCC No：9461
2014.07.15
【專利說明】一株局產(chǎn)DHA裂殖壺菌菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)DHA裂殖壺菌菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代生活習(xí)慣和飲食文化的發(fā)展演變，人們對食品保健的認(rèn)識和要求也在不 斷提高，其中多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)對人類健康重要性 的認(rèn)識已經(jīng)達(dá)到白熱化的程度。而二十二碳六烯酸（DHA)，分子式為C22H 32O2，作為ω-3系 列多不飽和脂肪酸（PUFA)中的重要一員而倍受青睞。研究表明：DHA含有五個(gè)不飽和鍵的 特殊結(jié)構(gòu)，因此，對人體健康有重要的生理功能。例如：調(diào)節(jié)血脂、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和預(yù)防及治 療心血管疾病、癌癥等功能；另外，DHA還是人體大腦皮層和視網(wǎng)膜中的主要物質(zhì)，具有促 進(jìn)嬰兒大腦合成、提高記憶力、增進(jìn)智力等重要作用。DHA還能提高魚苗的繁殖率和抗病性 能。市面上的DHA來源主要是魚油，但魚油資源非常短缺，因此，開發(fā)新的DHA微生物資源 成為近年來的研究熱點(diǎn)。
[0003] 裂殖壺菌（Schizochytrium sp.)，又稱裂弧藻，是一種海洋真菌，屬于真菌中的卵 囊菌綱、水霉目、脆霉壺菌科、裂殖壺菌屬。該菌種由于DHA含量高、幾乎不含EPA、質(zhì)量穩(wěn) 定、脂肪酸組成易被人體利用、不含魚腥味、不受重金屬污染等優(yōu)點(diǎn)，擁有替代魚油DHA的 絕對優(yōu)勢。其中裂殖壺菌是由于其生長迅速、DHA含量高、易于擴(kuò)大培養(yǎng)等優(yōu)勢成為目前發(fā) 酵法生產(chǎn)DHA研究最多的一種海洋真菌。食品與藥品管理局（FDA)規(guī)定嬰幼兒食品中DHA 只能選擇藻類DHA油脂。
[0004] Kw Fan等人以葡萄糖和酵母浸提物為碳、氮源培養(yǎng)裂殖壺菌DHA產(chǎn)量達(dá)到2. 79g/ L ;T. Yokocki等在搖瓶中采用多種碳源和氮源對裂殖壺菌進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，得到的最高DHA 的產(chǎn)量為4g/L ;
[0005] 中國專利文獻(xiàn)CN1648233A(申請?zhí)?00410075426. X)公開了一種海洋真菌裂殖壺 菌0UC88的工業(yè)應(yīng)用，經(jīng)過DES誘變篩選一株突變株，通過補(bǔ)加碳源進(jìn)行發(fā)酵，工藝優(yōu)化后 細(xì)胞干重為25g/L，DHA含量8. 27g/L，以上菌株和培養(yǎng)條件下DHA含量都不是很高。因此， 選育生產(chǎn)性能穩(wěn)定和DHA產(chǎn)量較高的發(fā)酵菌株，并對其培養(yǎng)工藝進(jìn)一步優(yōu)化來提高DHA產(chǎn) 量是急需攻克的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有DHA發(fā)酵產(chǎn)量低的不足，提供一株高產(chǎn)DHA裂殖壺菌菌株及其培 養(yǎng)方法與應(yīng)用。該菌株發(fā)酵DHA的產(chǎn)量可較原始菌株提高60 %，發(fā)酵液中的裂殖壺菌的生 物量可達(dá)到30-45g/L，DHA含量可達(dá)到8. 6-12. 5g/L。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 一株裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) BLCY-01，2014年07月15日保存于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科 學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No :9461。
[0009] 裂殖壺菌菌落及細(xì)胞形態(tài)：裂殖壺菌BLCY-Ol在篩選平板培養(yǎng)基上，25 °C培養(yǎng) 2-3d，菌落直徑為10-25um，乳白色，圓形，色澤光滑，無凸起；發(fā)酵液中培養(yǎng)細(xì)胞聚集成顆 粒存在；細(xì)胞顯微形態(tài)=BLCY-Ol細(xì)胞為圓形或橢圓形，胞內(nèi)有明顯的顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞主 要采用二分裂方式進(jìn)行繁殖，多形成二分體、四分體和八分體等細(xì)胞，菌體細(xì)胞多聚集成 團(tuán)，在分裂末期形成游動(dòng)孢子的孢子囊，繼而釋放游動(dòng)孢子，孢子卵圓形。
[0010] 篩選平板培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20,酵母膏5,蛋白胨5,海水晶15,瓊脂20,另加青 霉素和鏈霉素200mg/L。
[0011] 上述裂殖壺菌（Schizochytrium sp. ) BLCY-Ol的培養(yǎng)方法，步驟如下：
[0012] (1)將裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) BLCY-01接種于活化培養(yǎng)基中，20?30°C 活化培養(yǎng)24?48h，制得活化菌株；
[0013] (2)取步驟（1)制得的活化菌株，接種于種子液體培養(yǎng)基中，在20?30°C、200? 240r/min條件下，培養(yǎng)24?48h，制得裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) BLCY-01菌液。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述活化培養(yǎng)基每升組分如下：
[0015] 葡萄糖30g，蛋白胨IOg,酵母浸粉5g，海水晶15g，水定容至1L，pH自然。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述種子液體培養(yǎng)基每升組分如下：
[0017] 葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，海水晶15g，磷酸氫二鉀I. 5g，無水硫酸鎂 〇. 5g，大豆油0. 3g，水定容至1L，pH自然。
[0018] 上述裂殖壺菌（Schizochytrium sp. ) BLCY-01在制備DHA中的應(yīng)用，步驟如下：
[0019] I、取上述制備的裂殖壺菌（Schizochytrium sp. )BLCY_01菌液，按體積百分比 5?10%接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25?281：、通氣量0.3?0.5-111、？!15.0?7.0 的條件下，攪拌發(fā)酵40?50h，流加碳源溶液和氮源溶液，使發(fā)酵罐中的碳源濃度為10? 20g/L，氮源濃度為0. 8?I. 2g/L，然后在溫度20?25°C、通氣量0. 3?0. 5vvm的條件下， 繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)6?24h，制得發(fā)酵液；
[0020] 所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基每升組分如下：
[0021] 碳源30?90g、氮源1?10g、海水晶15?50g，水定容至1L，pH為4. 5?7. 5 ;
[0022] II、取步驟I制得的發(fā)酵液，經(jīng)固液分離，取沉淀，經(jīng)菌體破碎、DHA提取、純化，制 得 DHA。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟I中的攪拌速度為180?220rpm。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟I中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌速度為100?150rpm。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟I中流加碳源溶液的質(zhì)量濃度為50g/L。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟I中流加氮源溶液的質(zhì)量濃度為3g/L。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟I中碳源選自：葡萄糖、甘油或果糖；氮源選自：蛋白 胨、酵母浸粉、玉米漿粉、豆柏粉、硝酸鈉或硫酸銨。
[0028] 上述菌體破碎、DHA提取、純化步驟均可采用本領(lǐng)域常用技術(shù)。
[0029] 有益效果
[0030] 1、本發(fā)明以從裂殖壺菌原始菌株出發(fā)，經(jīng)過傳統(tǒng)的紫外誘變和光復(fù)活交替處理的 方法，通過高濃度的丙二酸和碘乙酸選擇性篩選獲得一株生長快速、DHA含量高的新裂殖壺 菌 BLCY-01。
[0031] 2、本發(fā)明經(jīng)過培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)酵54?72h后裂殖壺菌的生物量 達(dá)到30?45g/L，DHA含量達(dá)到8. 6?12. 5g/L，較現(xiàn)有專利和文獻(xiàn)報(bào)道的微生物發(fā)酵產(chǎn)量 商。
[0032] 3、本發(fā)明采取玉米漿粉等粗放碳源、氮源替代精細(xì)原料蛋白胨和酵母浸粉，原料 的粗細(xì)搭配使用，不僅提高了裂殖壺菌DHA的產(chǎn)量，而且很大程度上降低了生產(chǎn)成本。
[0033] 4、本發(fā)明采用的裂殖壺菌生產(chǎn)的脂肪酸組成比較簡單，飽和脂肪酸以棕櫚酸為 主，不飽和脂肪酸中DHA含量占90 %左右，除了有少數(shù)的DPA之外，基本不含EPA。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0035] 實(shí)施例1 :裂殖壺菌BLCY-Ol的誘變選育
[0036] 本發(fā)明所述的裂殖壺菌（Schizochytrium sp. )BLCY_01的野生菌株分離自山東 青島市黃海水域，將預(yù)先經(jīng)過濾膜除菌的海水置于滅好的培養(yǎng)基中，用松花粉做誘餌，20? 30°C培養(yǎng)2?3d，用花粉在平板上劃線并培養(yǎng)至菌落產(chǎn)生，挑取單菌落反復(fù)劃線直至獲得 細(xì)胞形態(tài)一致的純培養(yǎng)物，并接種于試管和甘油管保存，獲得裂殖壺菌（Schizochytrium sp.)BLCY-Ol的野生菌株。
[0037] 篩選培養(yǎng)基每升組分如下：
[0038] 葡萄糖20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，海水晶15g，青霉素200mg，鏈霉素200mg。
[0039] 通過紫外誘變和光復(fù)活交替處理的手段對裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) BLCY-Ol的野生菌株進(jìn)行誘變選育，最終獲得一株性能穩(wěn)定的DHA高產(chǎn)菌株裂殖壺菌 (Schizochytrium sp.)BLCY_01，誘變選育步驟如下：
[0040] (I)取裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) BLCY-01的野生菌株的試管斜面種子1環(huán) 接種于盛有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，20-30°C，220r/min振蕩培養(yǎng)36h，然后按 照5% (v/v)的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中，20-30°C，220r/min振蕩培養(yǎng)24h，使細(xì) 胞進(jìn)入對數(shù)生長期。無菌水洗滌離心制成適宜濃度（(?_在0. 3-1.0之間）的菌懸液。
[0041] 種子培養(yǎng)基每升組分如下：
[0042] 葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，海水晶15g，磷酸氫二鉀I. 5g，無水硫酸鎂 〇. 5g，大豆油0. 3g，水定容至1L，pH自然。
[0043] (II)將菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中（帶磁棒），用距離25-30cm的10-30W紫外燈照射 150s，將照射后的菌懸液在20-30°C、220r/min條件下振蕩培養(yǎng)12-18h，梯度稀釋后進(jìn)行平 板涂布，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，在20-30°C恒溫培養(yǎng)箱中暗室培養(yǎng)2-3d，待長出單菌落后 計(jì)算致死率，具體步驟如下：
[0044] 取試管斜面種子或甘油管種子接種于盛有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中， 20-30°C，220r/min振蕩培養(yǎng)36h，然后按照5% (v/v)的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基 中，20-30°C，220r/min振蕩培養(yǎng)24h，使細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期。無菌水洗滌離心2次制成適 宜濃度（0D600在0. 3-1. 0之間）的菌懸液。加5ml上述的菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中（帶磁 棒），用距離25-30cm的30W紫外燈照射0-150S，將照射后的菌懸液在20-30°C、220r/min 條件下振蕩培養(yǎng)12_18h，梯度稀釋后進(jìn)行平板涂布，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，在20-30°C恒 溫培養(yǎng)箱中暗室培養(yǎng)2-3d，待長出單菌落后計(jì)算致死率（見表1-1)。
[0045] 表1-1 :不同誘變時(shí)間下裂殖壺菌的致死率：
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一株裂殖壺菌（Schizochytrium sp.)BLCY-01，2014年07月15日保存于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué) 院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No :9461。
2. 權(quán)利要求1所述裂殖壺菌（Schizochytrium sp.)BLCY-Ol的培養(yǎng)方法，其特征在于， 步驟如下： (1) 將裂殖壺菌（Schizochytrium sp.)BLCY-〇l接種于活化培養(yǎng)基中，20?30°C活化 培養(yǎng)24?48h，制得活化菌株； (2) 取步驟（1)制得的活化菌株，接種于種子液體培養(yǎng)基中，在20?30°C、200?240r/ min條件下，培養(yǎng)24?48h，制得裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) BLCY-Ol菌液。
3. 如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述活化培養(yǎng)基每升組分如下： 葡萄糖30g，蛋白胨IOg,酵母浸粉5g，海水晶15g，水定容至1L，pH自然。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述種子液體培養(yǎng)基每升組分如下： 葡萄糖30,蛋白胨10,酵母浸粉5,海水晶15,磷酸氫二鉀1. 5,無水硫酸鎂0. 5,大豆油 0.3,水定容至1L，pH自然。
5. 權(quán)利要求1所述裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) BLCY-01在制備DHA中的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下： I、 取上述制備的裂殖壺菌（Schizochytrium sp.)BLCY-〇l菌液，按體積百分比5? 10%接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25?281：、通氣量0.3?0.5^1114冊.0?7.0的條 件下，攪拌發(fā)酵40?50h，流加碳源溶液和氮源溶液，使發(fā)酵罐中的碳源濃度為10?20g/ L，氮源濃度為0.8?I.2g/L，然后在溫度20?25°C、通氣量0. 3?0. 5vvm的條件下，繼續(xù) 發(fā)酵培養(yǎng)6?24h，制得發(fā)酵液； 所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基每升組分如下： 碳源30?90g、氮源1?10g、海水晶15?50g，水定容至1L，pH為4. 5?7. 5 ; II、 取步驟I制得的發(fā)酵液，經(jīng)固液分離，取沉淀，經(jīng)菌體破碎、DHA提取、純化，制得 DHA。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟I中的攪拌速度為180?220rpm; 優(yōu)選的，所述步驟I中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌速度為100?150rpm。
8. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟I中流加碳源溶液的質(zhì)量濃度為50g/L。
9. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟I中流加氮源溶液的質(zhì)量濃度為 3g/L。
10. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟I中碳源選自：葡萄糖、甘油或果 糖；氮源選自：蛋白胨、酵母浸粉、玉米漿粉、豆柏粉、硝酸鈉或硫酸銨。
【文檔編號】C12R1/645GK104312929SQ201410584234
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】黎麗, 竇光朋, 干昭波, 霍文嚴(yán), 魏巍 申請人:山東廣博生物技術(shù)服務(wù)有限公司