一種復(fù)合菌制劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合菌制劑及其應(yīng)用，即來源于對蝦消化道的地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的復(fù)合菌株制劑，上述菌株組合使用可增強對蝦細胞和體液的免疫水平，特別是提高對蝦抗病毒感染能力。本發(fā)明的復(fù)合菌制劑，包括有地衣芽孢桿菌LV005菌株、短小芽孢桿菌LV012菌株和枯草芽孢桿菌LV023菌株。本發(fā)明的復(fù)合菌制劑包含的菌株均篩選自對蝦消化道，具有改善對蝦消化道優(yōu)勢菌群的組成和數(shù)量，形成并維持良好的消化道微生態(tài)平衡，通過營養(yǎng)競爭、空間競爭或分泌細菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；通過提高對蝦溶菌酶、過氧化氫酶等相關(guān)免疫酶活性，增強對蝦非特異免疫功能，減少病毒感染的機會。CCTCC M 201326320130616CCTCC M 201326220130616CCTCC M 201326420130616
【專利說明】一種復(fù)合菌制劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于益生菌篩選制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種復(fù)合菌制劑及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人類面臨人口、資源、環(huán)境三大問題，開發(fā)利用海洋已成為沿海各國的國家戰(zhàn)略。 隨著海洋捕撈資源的急劇衰減，海水養(yǎng)殖已成為國際社會為滿足人類日益增長的蛋白質(zhì)需 求普遍采納的主要舉措。發(fā)展可持續(xù)的水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為世界共同關(guān)注的主題，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn) 品作為高品質(zhì)蛋白來源已得到國際社會的廣泛認同和肯定。作為世界水產(chǎn)品生產(chǎn)大國，中 國水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量占全世界總產(chǎn)量的70%以上，連續(xù)多年居世界首位，對外貿(mào)易占農(nóng)產(chǎn)品 出口凈收入的50%以上，出口額連續(xù)多年居大宗農(nóng)產(chǎn)品首位。
[0003] 近年來，病害問題已成為限制海水養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素，造成了重大的經(jīng) 濟損失，而且逐年攀升。每年養(yǎng)殖對蝦、魚類的病害造成了百億元以上的經(jīng)濟損失，而盲目 使用藥物等造成了養(yǎng)殖環(huán)境惡化和沿海環(huán)境污染。殘留藥物不僅威脅國民健康，也嚴重影 響水產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。人們逐漸開始從生態(tài)平衡的角度制定新的水產(chǎn)健康養(yǎng)殖方案，益生 菌的使用就是其中重要的措施之一。
[0004] 水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道不僅是飼料消化和營養(yǎng)吸收的場所，也是動物機體免疫防御的 關(guān)鍵部位。改善動物腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)對于提高飼料營養(yǎng)價值和利用效率，增強動物 抗病力意義重大。有益微生物水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道中的作用效果包括：形成有益微生物屏障、 增加飼料的消化和利用、分泌抗菌素、刺激和活化免疫系統(tǒng)、與病原微生物的生存競爭等。 但目前對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用的芽孢桿菌菌株較少，且存在著菌種生物學(xué)性狀平平，活菌數(shù) 量偏低，作用效果不穩(wěn)定等不足，特別是還沒有抗對蝦病毒病菌株的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合菌制劑及其應(yīng)用，即來源于對蝦消化道的地衣芽孢 桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的復(fù)合菌株制劑，上述菌株組合使用可增強對蝦細胞 和體液的免疫水平，特別是提高對蝦抗病毒感染能力。
[0006] 本發(fā)明的復(fù)合菌制劑，包括有地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis)LV005菌 株、短小芽抱桿菌（Bacillus pumilus)LV012菌株和枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis) LV023菌株。
[0007] 地衣芽抱桿菌（Bacillus lincheniformis)LV005菌株于2013年6月16日在武 漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為=CCTCC M 2013262。
[0008] 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)LV012菌株于2013年6月16日在武漢的中國 典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為=CCTCC M 2013263。
[0009] 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)LV023菌株于2013年6月16日在武漢的中 國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為=CCTCC M 2013264。
[0010] 其中混合菌液中，活菌總濃度> IO9CFUAiL ;且地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯 草芽孢桿菌優(yōu)選為1 :1 :1。
[0011] 本發(fā)明的復(fù)合菌制劑，是將地衣芽孢桿菌LV005發(fā)酵菌液、短小芽孢桿菌LV012發(fā) 酵菌液、枯草芽孢桿菌LV023發(fā)酵菌液混合后制備的。
[0012] 其中地衣芽孢桿菌LV005發(fā)酵菌液制備方法如下：從-80°c保存的菌種挑取少量 劃線于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液 中，37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā) 酵溫度控制在37°C ;當發(fā)酵液0D600值達到1. 5?1. 7時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；發(fā)酵 液中地衣芽孢桿菌LV005活菌濃度彡109CFU/mL。
[0013] 地衣芽孢桿菌LV005的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨，1. 5% ;酵母粉，0. 4% ; 蔗糖，1.0% ;氯化鈉，2.5% ;磷酸高鐵，0.001 % ;硫酸鎂，0.02% ;硫酸錳，0.05%。
[0014] 短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液制備方法如下：從-80°c保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中， 37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵 溫度控制在37°C ;當發(fā)酵液0D600值達到1. 2?1. 4時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；發(fā)酵液 中短小芽孢桿菌LV012活菌濃度彡109CFU/mL。
[0015] 短小芽孢桿菌LV012的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨，0. 5% ;酵母粉，0. 1% ; 蔗糖，1.5% ;氯化鈉，2.5% ;硫酸鐵，0.05% ;硫酸鎂，0.004% ;硫酸錳，0.01 %。
[0016] 枯草芽孢桿菌LV023發(fā)酵菌液制備方法如下：從-80°c保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中， 37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵 溫度控制在28°C ;當發(fā)酵液0D600值達到1. 2?1. 4時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；發(fā)酵液 中枯草芽孢桿菌LV023活菌濃度彡109CFU/mL。
[0017] 枯草芽孢桿菌LV023的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨，1.0% ;酵母粉，0.2% ; 蔗糖，1.0% ;氯化鈉，3.0% ;硫酸鐵，0.001 % ;硫酸鎂，0.005%。
[0018] 本發(fā)明的復(fù)合菌制劑用于制備對蝦飼料添加劑或是免疫增強劑。
[0019] 本發(fā)明的復(fù)合菌制劑包含的菌株均篩選自對蝦消化道，具有改善對蝦消化道優(yōu)勢 菌群的組成和數(shù)量，形成并維持良好的消化道微生態(tài)平衡，通過營養(yǎng)競爭、空間競爭或分泌 細菌素等抵御病毒在消化道的黏附和增殖；通過提高對蝦溶菌酶、過氧化氫酶、酚氧化酶、 磷酸酶、超氧化物歧化酶等相關(guān)免疫酶活性，增強對蝦非特異免疫功能，減少病毒感染的機 會；激活對蝦酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、溶菌酶、熱休克蛋白、脂多糖-葡聚糖結(jié)合蛋 白、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子等與抗病原感染相關(guān)分子的表達，減緩病毒在對蝦體內(nèi)的增 值速率；提高對蝦蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，促進對蝦消化能力和飼料養(yǎng)分的消化， 提_對4下抗應(yīng)激反應(yīng)能力等多種生物學(xué)功能。

【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述
[0021] 實施例1 :地衣芽孢桿菌的篩選
[0022] 本發(fā)明的地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis)LV0005菌株篩選自凡納濱對 蝦消化道。將采集的健康對蝦樣品放在盛有海水的充氣袋中運回實驗室。無菌操作臺上用 75 %的酒精擦拭活蝦體表進行消毒，無菌操作將活蝦解剖，取出對蝦腸道組織。將取出的腸 道組織用無菌的PBS(pH = 7.0)緩沖液沖洗3-4次后，用無菌研磨棒研磨均勻。之后用無 菌PBS緩沖液適當稀釋，取0. Iml涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)16h-20h。觀察2216E平板上細菌的菌落形態(tài)，對菌落形態(tài)一致的細菌進行編號，無菌條 件下用接種環(huán)挑取優(yōu)勢菌單菌落接種于2216E海水固體培養(yǎng)基中進行反復(fù)純化培養(yǎng)。純化 后的單菌落接種于2216E海水液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為180rpm/min，28°C振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1611-2011，取0.81111菌懸液放入保種管中，再加入0.21111的70%滅菌甘油，混勻，用封口膜封 好，放于-80°C冰箱保存。
[0023] 純化的菌株活化培養(yǎng)后稀釋至IO5?107CFU/ml，注射健康凡納濱對蝦，每個梯度 為一組，每組3個平行，每個平行10尾，用于考察該菌株的對養(yǎng)殖對蝦的安全性。在此基礎(chǔ) 上通過對蝦養(yǎng)殖實驗和病原感染實驗，綜合考察該菌株提高對蝦免疫水平和抗病原感染能 力的效果，與對照組對蝦比較達到顯著性差異的初步結(jié)果后，該菌株作為抗病候選菌株，并 進行下一步生理生化特性分析和16sRNA分子特性鑒定。
[0024] 地衣芽孢桿菌在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：菌落直徑約2_3mm，菌落呈圓形，白 色、半透明，表面光滑濕潤、有凸起且邊緣整齊，菌落黏稠不易挑起，培養(yǎng)時間延長菌落中間 會塌進去形成中間扁平四周高的形狀。
[0025] 碳源利用情況為：β -甲基-D-葡萄糖苷、D -阿糖醇、腺苷、D-丙氨酸、松二糖、 L-乳酸、L-丙氨酸、麥芽三糖、木糖醇、L-丙氨酰-甘氨酸、N-乙酰-L谷氨酸、D-蜜三糖 /棉子糖、D-木糖、琥珀酸單甲基酯、α -甲基-D-半乳糖苷、D-甘露糖、L-鼠李糖、丙酮酸 甲酯、5' -磷酸腺苷、D-半乳糖、D-松三糖、γ -羥丁酸、3-甲基-D-葡萄糖、2, 3- 丁二醇、 6-磷酸-D-葡萄糖、苦杏仁苷在Biolog中碳源消耗中呈現(xiàn)陽性。
[0026] 其它生理生化特性：淀粉水解陽性，明膠液化陽性，氧化酶試驗陽性，過氧化氫酶 試驗陽性。
[0027] 將制得的IOOmL地衣芽孢桿菌LV005溶液與IOKg基礎(chǔ)對蝦飼料原料（含魚粉 30%、蝦粉10%、豆粉25%、花生粉25%、面粉3%、玉米粉3%、復(fù)合維生素1% )混合，制 成含地衣芽孢桿菌LV005的免疫飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，準確稱重后逐級充分 混勻，以褐藻酸鈉作為粘合劑，加適量水用小型絞肉機擠壓制成顆粒飼料，在40°C條件下烘 干至水分含量10%以下，分袋包裝，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0028] 健康凡納濱對蝦300余尾，實驗對蝦初始平均體長為6. 3cm，隨機為實驗組和對照 組2個處理組，每個處理組有3個平行，每個平行組養(yǎng)殖對蝦50尾。實驗組連續(xù)4天投喂 免疫飼料，3天投喂基礎(chǔ)飼料，7天一個循環(huán)，直至實驗結(jié)束。對照組在整個實驗階段一直投 喂基礎(chǔ)飼料。水溫24-26°C，連續(xù)充氣；每日換水1次，日換水量為1/3 ;每日投喂飼料4次， 日投餌量約為1. 2-1. 4克/10尾，投喂Ih后吸去剩余飼料，并根據(jù)殘餌的多少調(diào)節(jié)投餌量。 免疫飼料養(yǎng)殖21天后，進行白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV)人工注射 感染實驗。感染前1天停止投喂飼料，次日每尾對蝦在第2腹節(jié)處注射50 μ L WSSV粗提液 (濃度為〇. 16g/mL)，以PBS溶液為陰性對照組。攻毒后各組繼續(xù)投喂相應(yīng)飼料，每天及時 撿出死蝦，記錄死亡數(shù)量，14d后結(jié)束感染實驗。實驗組和對照組每日平均累計死亡率結(jié)果 見下表，實驗結(jié)果顯示在感染5d內(nèi)，實驗組與對照組累積死亡率為差異不顯著（P>0. 05); 從第6d始各組均呈明顯的上升趨勢，對照組累積死亡率較實驗組差異顯著（P〈0. 05);至感 染實驗結(jié)束前1天對照組的累積死亡率為100%，實驗組的累積死亡率為75%。
[0029] 實施例2 :短小芽孢桿菌的篩選
[0030] 本發(fā)明的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)LV012菌株篩選自凡納濱對蝦消化 道。將采集的健康對蝦樣品放在盛有海水的充氣袋中運回實驗室。無菌操作臺上用75% 的酒精擦拭活蝦體表進行消毒，無菌操作將活蝦解剖，取出對蝦腸道組織。將取出的腸道 組織用無菌的PBS(pH = 7. 0)緩沖液沖洗3-4次后，用無菌研磨棒研磨均勻。之后用無菌 PBS緩沖液適當稀釋，取0. Iml涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)16h-20h。觀察2216E平板上細菌的菌落形態(tài)，對菌落形態(tài)一致的細菌進行編號，無菌條 件下用接種環(huán)挑取優(yōu)勢菌單菌落接種于2216E海水固體培養(yǎng)基中進行反復(fù)純化培養(yǎng)。純化 后的單菌落接種于2216E海水液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為180rpm/min，28°C振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16h-20h，取0. 8ml菌懸液放入保種管中，再加入0. 2ml的70%滅菌甘油，混勻，用封口膜封 好，放于-80°C冰箱保存。
[0031] 篩選的短小芽孢桿菌在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：菌落直徑約l-2mm，菌落呈圓 形，乳白色、不透明，表面呈蠟狀，有凸起且邊緣整齊。
[0032] 碳源利用情況為α -環(huán)式糊精、β -甲基-D-葡萄糖苷、D -阿糖醇、腺苷、D-丙氨 酸、2' -脫氧腺苷、β -環(huán)式糊精、松二糖、L-丙氨酸、麥芽三糖、D-阿洛酮糖、木糖醇、D-蘋 果酸、D-甘露醇、D-蜜三糖/棉子糖、D-木糖、L-天門冬酰胺、琥珀酸單甲基酯、D-甘露糖、 L-鼠李糖、丙酮酸甲酯、5'-磷酸腺苷、D-半乳糖、D-松三糖、吐溫80、龍膽二糖、γ -羥丁 酸、P-羥基苯乙酸、β-甲基-D-半乳糖苷、α-酮戊二酸、2, 3-丁二醇、6-磷酸-D-葡萄 糖、苦杏仁苷在Biolog碳源消耗中呈現(xiàn)陽性。
[0033] 其它生理生化特性：淀粉水解呈陰性，明膠液化陰性，氧化酶試驗陽性，過氧化氫 酶試驗陽性。
[0034] 短小芽孢桿菌LV012菌株可用于制備短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液。
[0035] 短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液制備方法如下：從_80°C保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中， 37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵 溫度控制在37°C ;當發(fā)酵液0D600值達到1. 2?1. 4時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；發(fā)酵液 中短小芽孢桿菌LV012活菌濃度彡109CFU/mL。
[0036] 短小芽孢桿菌LV012的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨，0. 5% ;酵母粉，0. 1% ; 蔗糖，1.5% ;氯化鈉，2.5% ;硫酸鐵，0.05% ;硫酸鎂，0.004% ;硫酸錳，0.01 %。
[0037] 將制得的IOOmL短小芽孢桿菌LV012溶液與IOKg基礎(chǔ)對蝦飼料原料（含魚粉 30%、蝦粉10%、豆粉25%、花生粉25%、面粉3%、玉米粉3%、復(fù)合維生素1% )混合，制 成含短小芽孢桿菌LV012的免疫飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，準確稱重后逐級充分 混勻，以褐藻酸鈉作為粘合劑，加適量水用小型絞肉機擠壓制成顆粒飼料，在40°C條件下烘 干至水分含量10%以下，分袋包裝，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0038] 健康凡納濱對蝦300余尾，實驗對蝦初始平均體長為6. 3cm，隨機為實驗組和對照 組2個處理組，每個處理組有3個平行，每個平行組養(yǎng)殖對蝦50尾。實驗組連續(xù)4天投喂 免疫飼料，3天投喂基礎(chǔ)飼料，7天一個循環(huán)，直至實驗結(jié)束。對照組在整個實驗階段一直投 喂基礎(chǔ)飼料。水溫24-26°C，連續(xù)充氣；每日換水1次，日換水量為1/3 ;每日投喂飼料4次， 日投餌量約為I. 2-1. 4克/10尾，投喂Ih后吸去剩余飼料，并根據(jù)殘餌的多少調(diào)節(jié)投餌量。 免疫飼料養(yǎng)殖21天后，進行白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV)人工注射 感染實驗。感染前1天停止投喂飼料，次日每尾對蝦在第2腹節(jié)處注射50 μ L WSSV粗提液 (濃度為〇. 16g/mL)，以PBS溶液為陰性對照組。攻毒后各組繼續(xù)投喂相應(yīng)飼料，每天及時 撿出死蝦，記錄死亡數(shù)量，14d后結(jié)束感染實驗。實驗組和對照組每日平均累計死亡率結(jié)果 見下表，實驗結(jié)果顯示在感染4d內(nèi)，實驗組與對照組累積死亡率為差異不顯著（P>0. 05); 從第5d始各組均呈明顯的上升趨勢，對照組累積死亡率較實驗組差異顯著（P〈0. 05);至感 染實驗結(jié)束前1天對照組的累積死亡率為100%，實驗組的累積死亡率為63. 3%。
[0039] 實施例3枯草芽孢桿菌的篩選
[0040] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)LV023菌株篩選自凡納濱對蝦消化 道。將采集的健康對蝦樣品放在盛有海水的充氣袋中運回實驗室。無菌操作臺上用75% 的酒精擦拭活蝦體表進行消毒，無菌操作將活蝦解剖，取出對蝦腸道組織。將取出的腸道 組織用無菌的PBS(pH = 7.0)緩沖液沖洗3-4次后，用無菌研磨棒研磨均勻。之后用無菌 PBS緩沖液適當稀釋，取0. Iml涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)16h-20h。觀察2216E平板上細菌的菌落形態(tài)，對菌落形態(tài)一致的細菌進行編號，無菌條 件下用接種環(huán)挑取優(yōu)勢菌單菌落接種于2216E海水固體培養(yǎng)基中進行反復(fù)純化培養(yǎng)。純化 后的單菌落接種于2216E海水液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為180rpm/min，28°C振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16h-20h，取0. 8ml菌懸液放入保種管中，再加入0. 2ml的70%滅菌甘油，混勻，用封口膜封 好，放于-80°C冰箱保存。
[0041] 枯草芽孢桿菌在2216E培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：菌落直徑約2-3mm，菌落呈圓形，白 色、扁平、表面粗糙干燥，邊緣不整齊。
[0042] 碳源利用情況為L-阿拉伯糖、a -D-乳糖、α -環(huán)式糊精、D -阿糖醇、D-丙氨酸、 2' -脫氧腺苷、β -環(huán)式糊精、麥芽三糖、D-阿洛酮糖、D-蘋果酸、琥珀酸單甲基酯D-甘露 糖、L-鼠李糖、5'-磷酸腺苷、D-半乳糖、α-羥丁酸、龍膽二糖、水蘇（四）糖、D-L-α-磷 酸甘油在Biolog中的碳源消耗中都呈現(xiàn)陽性結(jié)果。
[0043] 其它生理生化特性：淀粉水解陽性，明膠液化陽性，氧化酶試驗陽性，過氧化氫酶 試驗陽性。
[0044] 枯草芽孢桿菌LV023菌株可用于制備枯草芽孢桿菌LV023發(fā)酵菌液。
[0045] 枯草芽孢桿菌LV023發(fā)酵菌液制備方法如下：從_80°C保存的菌種挑取少量劃線 于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中， 37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵 溫度控制在28°C ;當發(fā)酵液0D600值達到1. 2?1. 4時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；發(fā)酵液 中枯草芽孢桿菌LV023活菌濃度彡109CFU/mL。
[0046] 枯草芽孢桿菌LV023的發(fā)酵液成分質(zhì)量百分比為：蛋白胨，1. 0% ;酵母粉，0. 2% ; 蔗糖，1.0% ;氯化鈉，3.0% ;硫酸鐵，0.001 % ;硫酸鎂，0.005%。
[0047] 將制得的IOOmL枯草芽孢桿菌LV023溶液與IOKg基礎(chǔ)對蝦飼料原料（含魚粉 30%、蝦粉10%、豆粉25%、花生粉25%、面粉3%、玉米粉3%、復(fù)合維生素1% )混合，制 成含枯草芽孢桿菌LV023的免疫飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，準確稱重后逐級充分 混勻，以褐藻酸鈉作為粘合劑，加適量水用小型絞肉機擠壓制成顆粒飼料，在40°C條件下烘 干至水分含量10%以下，分袋包裝，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0048] 健康凡納濱對蝦300余尾，實驗對蝦初始平均體長為6. 3cm，隨機為實驗組和對照 組2個處理組，每個處理組有3個平行，每個平行組養(yǎng)殖對蝦50尾。實驗組連續(xù)4天投喂 免疫飼料，3天投喂基礎(chǔ)飼料，7天一個循環(huán)，直至實驗結(jié)束。對照組在整個實驗階段一直投 喂基礎(chǔ)飼料。水溫24-26°C，連續(xù)充氣；每日換水1次，日換水量為1/3 ;每日投喂飼料4次， 日投餌量約為1. 2-1. 4克/10尾，投喂Ih后吸去剩余飼料，并根據(jù)殘餌的多少調(diào)節(jié)投餌量。 免疫飼料養(yǎng)殖21天后，進行白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV)人工注射 感染實驗。感染前1天停止投喂飼料，次日每尾對蝦在第2腹節(jié)處注射50 μ L WSSV粗提液 (濃度為〇. 16g/mL)，以PBS溶液為陰性對照組。攻毒后各組繼續(xù)投喂相應(yīng)飼料，每天及時 撿出死蝦，記錄死亡數(shù)量，14d后結(jié)束感染實驗。實驗組和對照組每日平均累計死亡率結(jié)果 見下表，實驗結(jié)果顯示在感染7d內(nèi)，實驗組與對照組累積死亡率為差異不顯著（P>0. 05); 從第8d始對照組呈明顯的上升趨勢，對照組累積死亡率較實驗組差異顯著（P〈0. 05);至感 染實驗結(jié)束前1天對照組的累積死亡率為100%，實驗組的累積死亡率為73%。
[0049] 將上述制備的地衣芽孢桿菌LV005發(fā)酵菌液、短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液、枯 草芽孢桿菌LV023發(fā)酵菌液按等體積混合后制成復(fù)合菌制劑，復(fù)合菌制劑中活菌總濃度 > IO9CFUAiL ;地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的數(shù)量比近似為1 :1 :1。
[0050] 下面對本發(fā)明的復(fù)合菌制劑的效果進行描述。
[0051] 實施例4:
[0052] 將制得的IOOmL混合芽孢桿菌制劑與IOKg基礎(chǔ)對蝦飼料原料（含魚粉30 %、蝦粉 10%、豆粉25%、花生粉25%、面粉3%、玉米粉3%、復(fù)合維生素1% )混合，制成含混合芽 孢桿菌制劑的免疫飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，準確稱重后逐級充分混勻，以褐藻 酸鈉作為粘合劑，加適量水用小型絞肉機擠壓制成顆粒飼料，在40°C條件下烘干至水分含 量10%以下，分袋包裝，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0053] 健康凡納濱對蝦300余尾，實驗對蝦初始平均體長為6. 3cm，隨機為實驗組和對照 組2個處理組，每個處理組有3個平行，每個平行組養(yǎng)殖對蝦50尾。實驗組連續(xù)4天投喂 免疫飼料，3天投喂基礎(chǔ)飼料，7天一個循環(huán)，直至實驗結(jié)束。對照組在整個實驗階段一直投 喂基礎(chǔ)飼料。水溫24-26°C，連續(xù)充氣；每日換水1次，日換水量為1/3 ;每日投喂飼料4次， 日投餌量約為1. 2-1. 4克/10尾，投喂Ih后吸去剩余飼料，并根據(jù)殘餌的多少調(diào)節(jié)投餌量。 免疫飼料養(yǎng)殖21天后，進行白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV)人工注射 感染實驗。感染前1天停止投喂飼料，次日每尾對蝦在第2腹節(jié)處注射50 μ L WSSV粗提液 (濃度為〇. 16g/mL)，以PBS溶液為陰性對照組。攻毒后各組繼續(xù)投喂相應(yīng)飼料，每天及時 撿出死蝦，記錄死亡數(shù)量，14d后結(jié)束感染實驗。實驗組和對照組每日平均累計死亡率結(jié)果 見下表，實驗結(jié)果顯示在感染4d內(nèi)，實驗組與對照組累積死亡率為差異不顯著（P>0. 05); 從第5d始各組均呈明顯的上升趨勢，對照組累積死亡率較實驗組差異顯著（P〈0. 05);至感 染實驗結(jié)束前1天對照組的累積死亡率為100%，實驗組的累積死亡率為50%。
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 一種復(fù)合菌制劑，其特征在于，所述的復(fù)合菌制劑包含有地衣芽孢桿菌LV005菌株、 短小芽孢桿菌LV012菌株和枯草芽孢桿菌LV023菌株。
2. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌制劑，其特征在于，所述的地衣芽孢桿菌的保藏編號為 CCTCC M 2013262。
3. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌制劑，其特征在于，所述的短小芽孢桿菌的保藏編號為 CCTCC M 2013263。
4. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌制劑，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌的保藏編號為 CCTCC M 2013264。
5. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌制劑，其特征在于，所述的復(fù)合菌制劑中活菌總濃度 彡 109CFU/mL。
6. 權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌制劑的制備方法，其特征在于，是將地衣芽孢桿菌LV005發(fā) 酵菌液、短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液、枯草芽孢桿菌LV023發(fā)酵菌液混合后制備的。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的地衣芽孢桿菌LV005發(fā)酵菌液 的制備方法如下：從_80°C保存的菌種挑取少量劃線于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h 獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中，37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子 液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在37°C ;當發(fā)酵液0D600值達到 1. 5?1. 7時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；所述的地衣芽孢桿菌LV005的發(fā)酵液成分質(zhì)量百 分比為：蛋白胨，1.5% ;酵母粉，0.4% ;蔗糖，1.0% ;氯化鈉，2.5% ;磷酸高鐵，0.001% ;硫 酸鎂，0.02% ;硫酸錳，0.05%。
8. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的短小芽孢桿菌LV012發(fā)酵菌液 的制備方法如下：從_80°C保存的菌種挑取少量劃線于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h 獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中，37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子 液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在37°C ;當發(fā)酵液0D600值達到 1. 2?1. 4時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；所述的短小芽孢桿菌LV012的發(fā)酵液成分質(zhì)量百 分比為：蛋白胨，0.5% ;酵母粉，0. 1% ;蔗糖，1.5% ;氯化鈉，2.5% ;硫酸鐵，0.05% ;硫酸 鎂，0.004% ;硫酸錳，0.01 %。
9. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌LV023發(fā)酵菌液 的制備方法如下：從_80°C保存的菌種挑取少量劃線于2216E固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24h 獲得單菌落，取一單菌落接種于2216E培養(yǎng)液中，37°C搖瓶培養(yǎng)24h獲得種子液，再把種子 液接種于地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在28°C ;當發(fā)酵液0D600值達到 1. 2?1. 4時，終止發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液；所述的枯草芽孢桿菌LV023的發(fā)酵液成分質(zhì)量百 分比為：蛋白胨，1.0% ;酵母粉，0.2% ;蔗糖，1.0% ;氯化鈉，3.0% ;硫酸鐵，0.001 % ;硫酸 鎂，0? 005%。
10. 權(quán)利要求1所述的復(fù)合菌制劑在制備對蝦飼料添加劑或免疫增強劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/08GK104388338SQ201410584300
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】宋曉玲, 黃倢, 楊冰, 許華, 李玉宏 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所