一種原發(fā)性高血壓易感基因變異位點(diǎn)及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)與原發(fā)性高血壓易感性相關(guān)的位點(diǎn)，并公開了一種檢測原發(fā)性高血壓相關(guān)基因-線粒體融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括檢測個(gè)體的線粒體融合基因2（Mfn2）/增殖抑制基因（HSG）5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒。
【專利說明】一種原發(fā)性高血壓易感基因變異位點(diǎn)及其檢測方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，涉及人線粒體融合基因2(Mitofusin 2，Mfn2 gene)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp的檢測。本發(fā)明還涉及檢測這個(gè)SNP位點(diǎn)的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0003]原發(fā)性高血壓(essential hypertens1n, EH)是一種常見而多發(fā)的、由環(huán)境與遺傳因素共同致病的多因素、多基因疾，對(duì)人類健康造成了極大的影響。隨著分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因已經(jīng)有150余種，但是EH的發(fā)病機(jī)制仍然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預(yù)防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環(huán)境共同作用的結(jié)果，血壓的變化30%-60%歸因于遺傳。由于環(huán)境因素是可以控制和確認(rèn)的，而對(duì)高血壓遺傳學(xué)因素卻是固定不變的。因此，對(duì)可變因素的控制，如對(duì)高血壓危險(xiǎn)因素的預(yù)防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發(fā)病，但是對(duì)固定不變的遺傳因素的認(rèn)識(shí)不足卻在一定程度上嚴(yán)重影響著對(duì)高血壓發(fā)病、診斷和治療。因此對(duì)高血壓遺傳學(xué)的研究十分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態(tài)性[J].高血壓雜志，2001，9:259-264)。
[0004]近二十余年來，有關(guān)高血壓治療的研究更多地集中在對(duì)血壓的控制和對(duì)靶器官的保護(hù)，并已取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對(duì)人類內(nèi)源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制是今后高血壓防治研究的主要方向之一，具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用前景，如果通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗高血壓機(jī)制治療高血壓病，將會(huì)促進(jìn)我國生物醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，并為我國每年節(jié)省巨大的醫(yī)療費(fèi)用。
[0005]目前所發(fā)現(xiàn)的高血壓相關(guān)基因，歸結(jié)起來可以概括為促高血壓基因和抗高血壓基因，Mfn2屬于后者。Mfn2的前身是我國學(xué)者陳光慧等[Chen GH, Zhang CH, Zhu YQ, et al.Express1n of a novel gene related to hypertens1n[J].Natl Med J China, 1997,77: 823-828.]于1997年對(duì)培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常Wistar Kyoto (WKY)大鼠的血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行差異顯示，克隆出一個(gè)新基因一增殖抑制基因(hyperplasiasuppressor gene，HSG)。它包含有4160bp的喊基對(duì)，共編碼661個(gè)氨基酸(NM_014874,GeneBank Access U41803)。后經(jīng)一系列體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[Chen KH, Guo XM, DalongMa, et al.Dysregulat1n of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nature Cell B1l, 2004, 6，872-883.]，HSG 可以明顯地抑制 Ras-Raf 蛋白-絲裂素活化蛋白激酶基因表達(dá)，并且可以激活抗癌基因的表達(dá)，有效地阻遏細(xì)胞周期和抑制多種細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用是通過細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)的。因此HSG基因是原發(fā)性高血壓的候選基因之一，后經(jīng)基因功能研究表明，HSG基因參與線粒體融合，因此正式命名為線粒體融合基因 2 (mitofusin 2, Mfn2)。
[0006]由于Mfn2基因在原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠血管和白細(xì)胞中主要的特點(diǎn)是出現(xiàn)表達(dá)下降，這應(yīng)該是其表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)了異常，但是目前對(duì)Mfn2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究較少。5’端非編碼區(qū)是處于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，2000bp以內(nèi)是啟動(dòng)子和主要轉(zhuǎn)錄因子存在部位，5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp (從起始密碼子的“A”起向上第1812bp至1813bp的位置，在SEQ ID NO:1中為第38至39位核苷酸)刪除變異正好處于這個(gè)位置。而且我們在進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于Mfn2基因5’端非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)2000bp內(nèi)，且該變異位點(diǎn)正好位于一個(gè)啟動(dòng)子內(nèi)，且處于相對(duì)保守的區(qū)域。另夕卜，該變異位點(diǎn)是一個(gè)非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-熱休克蛋白(Heat Shock Factor, HSF)的結(jié)合部位，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度而言，具有非常重要的價(jià)值，因而可能具有非常重要的意義。
[0007]綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)根治原發(fā)性高血壓，本領(lǐng)域迫切需要深入研究原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制，尋找原發(fā)性高血壓易感基因，篩選出具有高風(fēng)險(xiǎn)的原發(fā)性高血壓患者，開發(fā)檢測原發(fā)性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種檢測高血壓易感基因Mfn2多態(tài)性位點(diǎn)的方法及檢測試劑盒。
[0009]本發(fā)明提供了一種可以通過高血壓易感性基因的檢測預(yù)測高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，即檢測Mfn2基因5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的基因型。5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)刪除的基因型的個(gè)體其高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通人群。
[0010]所述的5，端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)，位于Mfn2的5，端非編碼區(qū)中(1ρ36.22:NC_000001.10 位置 11978368 至 11978369 TT/-)。其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號(hào):5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位置基于SEQ ID NO:1 ;引物I基于SEQ ID NO:2 ;引物2基于SEQ ID NO:3 ;擴(kuò)增產(chǎn)物基于SEQ ID NO:4。
[0011]具體而言，該方法包括步驟:(a)抽提樣品的基因組DNA，擴(kuò)增獲得Mfn2基因5’端非編碼區(qū)；(b)通過特異性的引物擴(kuò)增獲得Mfn2基因包含5’端非編碼區(qū)_1812bp至-1813bp位點(diǎn)的區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID NO:4 ; (c)檢測步驟(b)產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的基因型。
[0012]所述的擴(kuò)增Mfn2基因5’端非編碼區(qū)的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
[0013]上述方法中涉及的測序、擴(kuò)增、抽提基因組DNA等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作方法。
[0014]本發(fā)明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，它含有可以包括特異性擴(kuò)增Mfn2基因5’端非編碼區(qū)中包含5’端非編碼區(qū)-1812bp至_1813bp位點(diǎn)的區(qū)域的引物。
[0015]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與特異性擴(kuò)增Mfn2基因5’端非編碼區(qū)中包含5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的區(qū)域的引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所
/Jn ο
[0016]本發(fā)明經(jīng)研究顯示，首次證明了 Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5’端非編碼區(qū)-1812bp 至-1813bp (位于 Mfn2 5’ 端非編碼區(qū)中，1ρ36.22:NC_000001.10 位置11978368至11978369 TT/-)與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能:Mfn2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5，端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位于Mfn2，5’端非編碼區(qū)中(1ρ36.22:NC_000001.10位置11978368至11978369 TT/-)基因型的改變將導(dǎo)致高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高。其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在Mfn2基因5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp TT刪除(TT/-)突變在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(p〈0.05)，即在原發(fā)性高血壓患者中該基因型主要表現(xiàn)為TT刪除(TT/-)，而在正常對(duì)照組中該基因型主要為TT，該TT刪除變化可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明提供了一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟:檢測該個(gè)體的Mfn2基因5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的基因型，以此判斷該個(gè)體患高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否高于普通人群。
[0018]在一優(yōu)選例中，所述的差異是選自5’端非編碼區(qū)-1812bp至_1813bp的單核苷酸多態(tài)性。5，端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位于Mfn2基因5，端非編碼區(qū)中(1ρ36.22:NC_000001.10 位置 11978368 至 11978369 TT/-)。其中，5’端非編碼區(qū)-1812bp 至 _1813bp位置基于SEQ ID NO:1。
[0019]本發(fā)明提供了一種檢測樣品是否存在Mfn2基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟:
(a)用Mfn2基因5’端非編碼區(qū)特異性引物擴(kuò)增樣品的基因組DNA，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和
(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp的基因型。
[0020]Mfn2基因的詳細(xì)序列可參見登錄號(hào)為(NG_007945.1) 5’端非編碼區(qū)_1812bp至 _1813bp 的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。
[0021]本發(fā)明人對(duì)Mfn2基因中的5’端非編碼區(qū)中(1ρ36.22:NC_000001.10位置
11978368至 11978369 TT/-)區(qū)域進(jìn)行了測序。
[0022]Mfn2基因的5’端非編碼區(qū)_1812bp至_1813bp的基因型可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。
[0023]本發(fā)明公開了一個(gè)與原發(fā)性高血壓易感性相關(guān)的位點(diǎn)。提供了一種檢測原發(fā)性高血壓易感性基因Mfn2多態(tài)性的方法，它包括檢測線粒體融合基因2 (Mfn2)的5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴(kuò)增5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的引物，還可以包括擴(kuò)增Mfn2基因5’端非編碼區(qū)的引物。利用本發(fā)明檢測5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為該基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測和原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測提供了一個(gè)簡捷的新途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是經(jīng)過使用本專利的引物通過PCR擴(kuò)增后所得產(chǎn)物測序結(jié)果截圖。顯了 5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp的一種SNP基因型的測序結(jié)果。5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位于Mfn2基因5，端非編碼區(qū)中(1ρ36.22:NC_000001.10位置11978368至
11978369TT/-)。其中A為正常對(duì)照組正向測序圖，B為原發(fā)性高血壓患者組正向測序圖。從正向測序圖中可以看出，正常對(duì)照組的TT堿基存在，而在原發(fā)性高血壓組則出現(xiàn)TT缺失變異。
[0025]

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克?。粚?shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0027]實(shí)施例1
用測序法檢測原發(fā)性高血壓易感基因MFn2基因的5’端非編碼區(qū)-1812bp至_1813bp位點(diǎn)。挑選上述高血壓病例-對(duì)照組樣本各30例進(jìn)行測序判斷5’端非編碼區(qū)_1812bp至-1813bp的基因型。
[0028]一、實(shí)驗(yàn)方法
PCR測序引物仍采用上述PCR用引物，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序。測序的儀器是ABI公司的3130x1遺傳分析儀,用sequence analysis 5.2分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用chromas也可以查看。
[0029]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
測序結(jié)果截圖如圖1所示。
[0030]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用做參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種與原發(fā)性高血壓密切相關(guān)的DNA片段，其特征在于所述DNA片段包含如SEQ IDN0.1所示的序列。
2.線粒體融合基因2( Mfn2) 5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)多態(tài)性在制備檢測高血壓易感性的試劑中的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp 位點(diǎn)位于 1ρ36.22:NC_000001.10 位置 11978368 至 11978368 的 TT 刪除(TT/-)突變。
4.如權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于所述Mfn2基因5’端非編碼區(qū)_1812bp至-1813bp位點(diǎn)的TT刪除突變增加原發(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)。
5.一種用于檢測高血壓易感性的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括能夠特異性擴(kuò)增Mfn2基因包含5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的區(qū)域的引物。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述Mfn2基因5’端非編碼區(qū)_1812bp至-1813bp 位點(diǎn)位于 1ρ36.22:NC_000001.10 位置 11978368 至 11978369 的 TT 刪除(TT/-)突變。
7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述引物序列如SEQID NO:2和SEQID NO:3 所示。
8.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于通過所述引物特異性擴(kuò)增獲得Mfn2基因包含5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的DNA片段；并檢測獲得的DNA片段中5’端非編碼區(qū)-1812bp至-1813bp位點(diǎn)的核苷酸，所述位點(diǎn)的TT刪除(TT/-)突變增加原發(fā)性高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于檢測Mfn2基因5’端非編碼區(qū)_1812bp至-1813bp位點(diǎn)的核苷酸的方法選自=Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450690SQ201410586952
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】王佐廣, 魏永祥, 李梅, 劉潔琳, 劉雅, 文杰, 牛秋麗, 彭曉云, 溫紹君 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院