一種判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，取藍(lán)藻水華區(qū)域的水樣和室內(nèi)培養(yǎng)微囊藻，進(jìn)行RNA提取純化，然后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以引物 gvpC 擴(kuò)增微囊藻偽空胞基因，以引物 Micr 特異性擴(kuò)增微囊藻 16srRNA 內(nèi)參基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，兩者差值為校正后的細(xì)胞拷貝數(shù)，野外樣品與室內(nèi)樣品的細(xì)胞拷貝數(shù)差值為野外目的基因相對(duì)循環(huán)數(shù)，記作ΔΔCt，采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，2-ΔΔCt的值為縱坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)曲線確定越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限。本方法可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析，其重復(fù)性好且準(zhǔn)確，檢測(cè)時(shí)間短。
【專利說(shuō)明】一種判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，屬于水環(huán)境治理技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 近幾十年來(lái)，我國(guó)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的發(fā)展趨勢(shì)很快，大型淺水湖泊（如太湖）隨著富 營(yíng)養(yǎng)化加重，常常發(fā)生以銅綠微囊藻?is aerwgiflosa )為優(yōu)勢(shì)種群的水華。水華 多發(fā)生在夏季，有明顯季節(jié)性特點(diǎn)。有研究者根據(jù)生態(tài)學(xué)的基本理論和野外對(duì)水華形成過(guò) 程的原位檢測(cè)，將藍(lán)藻水華的形成分為相互區(qū)別而又連續(xù)的4個(gè)過(guò)程：下沉和越冬、復(fù)蘇、 生物量增加、上浮聚集形成水華。這一假設(shè)為治理藍(lán)藻水華提供了一條"分階段"治理的新 思路。藍(lán)藻越冬休眠或者春季復(fù)蘇是這些藻類生命過(guò)程中最薄弱的環(huán)節(jié)，越冬復(fù)蘇策略不 僅會(huì)影響水體中藍(lán)藻的種群變動(dòng)，而且可能有助于其越過(guò)環(huán)境惡劣的冬季，為隨后的浮游 生長(zhǎng)提供潛在的"種源"。要有效控制夏季藍(lán)藻水華，就要在藻類大量繁殖形成水華之前，采 取更加有針對(duì)性的措施抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)，在藻類大量復(fù)蘇生長(zhǎng)前對(duì)其進(jìn)行消減，就有可能 達(dá)到事半功倍的效果。在越冬期對(duì)藍(lán)藻開(kāi)展底泥翻耕類工程可以在藍(lán)藻進(jìn)入水體前阻斷藍(lán) 藻復(fù)蘇期的開(kāi)始，而在藍(lán)藻復(fù)蘇期開(kāi)展生物抑制(如水稻、大麥秸桿）措施將極大降低藍(lán)藻 的復(fù)蘇率。因此建立一種判別越冬藍(lán)藻的越冬復(fù)蘇期的檢測(cè)方法將有助于區(qū)分藍(lán)藻越冬期 和復(fù)蘇期的界限，為有針對(duì)性的開(kāi)展藍(lán)藻的種源清除提供依據(jù)。
[0003] 越冬期藍(lán)藻休眠體成為水華種源必須同時(shí)滿足兩個(gè)條件：保持活性和上浮。越 冬期底泥中具有活性的藍(lán)藻數(shù)量決定來(lái)年藍(lán)藻的復(fù)蘇量，是水華暴發(fā)的直接因素之一。而 在水華暴發(fā)這一過(guò)程中，藍(lán)藻能調(diào)節(jié)自身浮力進(jìn)行垂直遷移的特性也起到了關(guān)鍵的作用， 這種特性使藍(lán)藻群體的空間位置發(fā)生改變，使越冬期底泥中具有活性的藍(lán)藻上浮到水體表 層，并受風(fēng)力作用在湖岸局部地區(qū)大量聚集。藍(lán)藻之所以能夠形成水華與它胞內(nèi)偽空胞所 產(chǎn)生的漂浮能力是密不可分的。藍(lán)藻的偽空胞是由含有12個(gè)基因的8. 7Kb的基因簇組成 的，但是長(zhǎng)期以來(lái)偽空胞編碼基因和結(jié)構(gòu)蛋白的研究主要集中在和GvpA、GvpC 上。幾乎在所有產(chǎn)偽空胞的藍(lán)藻中出現(xiàn)，在大多數(shù)具有偽空胞的藻細(xì)胞檢測(cè)到基 因具有多拷貝，不同的藻細(xì)胞中，拷貝數(shù)有所不同，但基因拷貝數(shù)的多少影響偽空胞 的哪個(gè)表型特征并不清楚。而基因決定著偽空胞的直徑，失去GvpC蛋白結(jié)構(gòu)的偽空 胞更容易坍塌。
[0004] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從環(huán)境樣品中提取和處理核酸的技術(shù)逐漸被應(yīng)用到 微生物形態(tài)學(xué)中?？墒窃谝话闱闆r下，通常是從環(huán)境樣品中提取DNA，并以DNA為模板通過(guò) PCR技術(shù)來(lái)擴(kuò)增目的基因序列。由于DNA存在于垂死和已經(jīng)死亡的生物中，而且DNA還可能 存在于細(xì)胞外，所以這些生物的生態(tài)意義就很難判斷。因此，通過(guò)提取環(huán)境中RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí) 熒光定量PCR技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上研究野外藍(lán)藻偽空胞基因的表達(dá)，從而確定有活 性藍(lán)藻的上浮能力，就能清楚的將藍(lán)藻復(fù)蘇期和越冬期劃清界限，為種源的清除提供依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限 的方法，該方法采用在轉(zhuǎn)錄水平上的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，能夠快速準(zhǔn)確的定量檢測(cè)出 藍(lán)藻偽空胞基因的表達(dá)，通過(guò)結(jié)果分析出藍(lán)藻偽空胞基因是在哪個(gè)時(shí)間段 開(kāi)始表達(dá)并在哪個(gè)時(shí)間段表達(dá)下降，從而將藍(lán)藻復(fù)蘇期和越冬期劃清界限，為種源的清除 提供依據(jù)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，包括如下步驟： 1) 取發(fā)生藍(lán)藻水華區(qū)域的水樣，進(jìn)行總RNA提取純化，得到RNA樣本a ; 2) 室內(nèi)培養(yǎng)微囊藻，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期離心收集藻細(xì)胞，進(jìn)行總RNA提取純化，得到RNA樣 本b ; 3) 分別以RNA樣本a和RNA樣本b進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA-a和cDNA-b ; 4) 以步驟3)得到的cDNA-a作為熒光定量PCR的模板，以引物擴(kuò)增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為;以引物#icr特異性擴(kuò)增微 囊藻財(cái)內(nèi)參基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為Ct 16s ;兩者差 值Ct野外目的翻_Ct野外同一樣本16s為校正后的細(xì)胞拷貝數(shù)，記作Δ Ct野外目的基因； 5) 以步驟3)得到的cDNA-b作為熒光定量PCR的模板，以引物擴(kuò)增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為Cts__H ;以引物#icr特異性擴(kuò)增微 囊藻財(cái)內(nèi)參基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為Cts_n 16s ;兩者差 值Ct室內(nèi)目腿因_ Ct室內(nèi)同一樣本16s為校正后的細(xì)胞拷貝數(shù)，記作ACt室內(nèi)目腿因； 6) 與ACt室肖_基_差值為里了外目的基因相對(duì)循環(huán)數(shù)，記作Δ ACt，米用 計(jì)算相對(duì)表達(dá)量； 7) 取不同時(shí)間的水樣重復(fù)上述步驟1)?6)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，步驟6) 2^ 的值為 縱坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)曲線確定越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限。
[0007] 步驟2)中微囊藻為微囊藻aerwgifliosa 7汾形。
[0008] 步驟2)中室內(nèi)培養(yǎng)微囊藻的培養(yǎng)基為BG-11，培養(yǎng)溫度為28?35 °C，光照強(qiáng)度 為 20 ?60 μ E · (m2 · s) S光照周期為 9 h:15 h ?12 h:12 h。
[0009] 引物 序列為5' -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3'， gvpC-R^ -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3, 〇
[0010] 引物 #icr 引物序列為:#icr7財(cái)F 5、GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3\ Micr431R^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3, 〇
[0011] 熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3 min，緊接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0012] 閾值循環(huán)數(shù)值！Threshold cycle value,簡(jiǎn)寫Ct值，定義為突光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的 閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，目的基因的拷貝數(shù)與Ct值呈負(fù)相關(guān)。熒光閾值的設(shè)定：一般將PCR 反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo) 準(zhǔn)差的10倍，熒光閾值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。以16srRNA為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照基因來(lái)校正 PCR模板的細(xì)胞拷貝數(shù)Ct 從而消除組間加樣量的影響。
[0013] 為了保證目的基因（仍€)和內(nèi)參基因（16S)的擴(kuò)增效率一致，將室內(nèi)樣品的cDNA 模板稀釋成一系列梯度，利用內(nèi)參基因16S和目的基因引物擴(kuò)增，通過(guò)cDNA濃度梯 度的log值對(duì)ACt值（Z 0=^_細(xì)7-0_顏）作圖，所得直線為y=-0. 0931X+10. 109,所 得直線斜率絕對(duì)值接近于〇，說(shuō)明擴(kuò)增效率相同。
[0014] 具體步驟如下： 1.利用室內(nèi)培養(yǎng)的微囊藻始'^/-〇<^75^'5· aerwgifliosa 7汾形為對(duì)照，培養(yǎng)基為BG-11， 培養(yǎng)溫度為28?35 °C，光照強(qiáng)度為20?60 μ E · (m2 · s)-1，光照周期為9 h: 15 h?12 h: 12 h，離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞，進(jìn)行總RNA提取純化，得到RNA樣本b。
[0015] 2.取發(fā)生藍(lán)藻水華的湖泊水樣，經(jīng)GF/C膜過(guò)濾后，將濾物進(jìn)行總RNA提取純化，得 到RNA樣本a。
[0016] 3.反轉(zhuǎn)錄：米用 QIAGEN 公司的 QuantiTect Reverse Transcription Kit 試劑 盒。根據(jù)RNA濃度計(jì)算IygRNA所需的體積。按照試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：加入2μ L gDNA Wipeout Buffer，1 μ gRNA，和 RNase-free H2O，總體積 14 μ L，混勻后至于 PCR 儀中 42°C溫 浴 2min〇 然后向其中力口入 IuL Reverse-transcription master mix,4 μ L Quantiscript RT Buffer及IyL RT Primer Mix,混合后至于PCR儀中42°C溫浴15min，然后95°C滅活 3min。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA-a和cDNA-b稀釋10倍作為熒光定量PCR模板。
[0017] 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其 PCR混合液包括 12.5 yL 2XQuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μ M 引物，1 μ L 模板，無(wú) RNA 酶的水 10. 5 μ L。引物仍^ -丁0(：1'176〇61^六61'(：1'17〇：-3'）與^^^-7?(5,-了〇：1'1^六〇^61'1766(：1'(：1'-3'）特異性擴(kuò) 增微囊藻偽空胞基因，引物 #icr7財(cái)F (5 'GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3 J 與 (5^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3J特異性擴(kuò)增微囊藻財(cái)內(nèi)參基因。
[0018] 5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3 min，緊接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包 括 95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0019] 6.分別取步驟3中得到的cDNA-a和cDNA-b作為模板，按步驟4和步驟5實(shí)時(shí)熒 光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR完成后，導(dǎo)出相 應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值（Threshold cycle value，簡(jiǎn)寫Ct值，定義為熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值 時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，目的基因的拷貝數(shù)與Ct值呈負(fù)相關(guān)。熒光閾值的設(shè)定：一般將PCR反 應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn) 差的10倍，熒光閾值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量用表示，Λ ACt @的基因= ACt野外目的基因 -ACt室內(nèi)目的基因）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，2 Gt的值為縱坐標(biāo)繪制曲線，根 據(jù)曲線確定越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限。
[0020] 有益效果：傳統(tǒng)的測(cè)定藻類現(xiàn)存量的方法以及基于DNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法 難以區(qū)分死活細(xì)胞，不能真正反映具有活性的越冬藻類的狀態(tài)。而且絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)熒光 定量PCR方法，需要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)。而采用本發(fā)明的方法，通過(guò)對(duì)室 內(nèi)微囊藻以及野外樣品RNA的提取，運(yùn)用相對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，比較野外不同時(shí) 間段內(nèi)樣品和室內(nèi)微囊藻基因之間的表達(dá)差異，檢測(cè)出水體藍(lán)藻在時(shí)間上和空間上的動(dòng)態(tài) 變化。這種方法可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析，而且不受環(huán)境樣品懸浮顆粒物和藻類群體 狀態(tài)等影響，體現(xiàn)出其重復(fù)性好且準(zhǔn)確。對(duì)樣品的定量檢測(cè)能在短時(shí)間內(nèi)完成（3個(gè)小時(shí)左 右，多個(gè)樣品可同時(shí)進(jìn)行)，其它研究偽空胞形態(tài)和特性的壓力毛細(xì)管法等需要將偽空胞從 細(xì)胞中分離純化，耗時(shí)費(fèi)力。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是太湖流域取樣位點(diǎn)分布圖； 圖2是2012年11月至2013年7月太湖梅梁灣水體藍(lán)藻基因相對(duì)表達(dá)量； 圖3是2012年11月至2013年7月太湖湖心水體藍(lán)藻基因相對(duì)表達(dá)量。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步描述。
[0023] 以下實(shí)施例中所采用的的微囊藻為微囊藻#/<^〇<^75^5· aerwgifliosa ，該藻 種由中科院典型培養(yǎng)物種保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)（FACHB)提供。
[0024] 實(shí)施例1 1.樣品采集和RNA提取 2012年11月至2013年7月每月采集太湖梅梁灣（N2)水樣，在采樣點(diǎn)立即用GF/C濾 膜過(guò)濾IOOml水樣，迅速放入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室放在-70°C中保存直到RNA提取。取 40mL室內(nèi)培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微囊藻(室內(nèi)培養(yǎng)微囊藻的培養(yǎng)基為BG-11，培養(yǎng)溫度 為30 °C，光照強(qiáng)度為30 μΕ^Οι^^Γ1，光照周期為12 h:12 h)，，進(jìn)行離心收集藻細(xì)胞，然 后提取RNA。野外樣本和室內(nèi)樣本的RNA的提取均采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit試劑盒。野外樣品和室內(nèi)樣本分別轉(zhuǎn)移到相對(duì)應(yīng)編號(hào)的裂解管B (Lysing MatrixB， 直徑0. I mm)中，然后每個(gè)裂解管B中加入500 μ L Buffer RLT，將裂解管B放置于Fast Pr印-24樣品處理儀器中。設(shè)置Fast Pr印-24樣品處理儀器參數(shù)，速度6 m/s，時(shí)間35 s。 擊打破碎之后，立即取出裂解管B并放入冰上。然后將裂解管B在4 °C，12000 rpm條件下 離心10 s，緊接著將上清液轉(zhuǎn)移至無(wú) RNase 2 mL離心管中。按試劑盒說(shuō)明提取RNAdfi 清液轉(zhuǎn)移至于淡紫色的QIA shredder spin柱中，12000rmp離心2分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至新 的無(wú) RNase的2mL離心管內(nèi)，加入0. 5倍體積的無(wú)水乙醇，迅速吹打混勻。然后轉(zhuǎn)移至2mL 粉色1?他387 8口;[11柱中，120001'115)離心158，將濾出物丟棄。加入700以1^1?￥1，120001'115)離 心15s清洗柱子上的濾膜，丟棄濾出物。再用RPE清洗兩次柱子。再用30 μ L無(wú) RNA酶的 dd H2O洗脫RNA。測(cè)定RNA濃度和純度，記作RNA樣本a和RNA樣本b。
[0025] 2.分別對(duì)RNA樣本a和RNA樣本b進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：采用QIAGEN公司的QuantiTect Reverse Transcription Kit試劑盒。根據(jù)RNA濃度計(jì)算IygRNA所需的體積。按照試 劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：加入 2 μ L gDNA Wipeout Buffer，1 μ gRNA，和 RNase-free H2O，總體積 14 μ L，混勻后至于PCR儀中42°C溫浴2min。然后向其中加入1 μ L Reverse-transcription master mix，4 μ L Quantiscript RT Buffer 及 1μ L RT Primer Mix，混合后至于 PCR 儀 中42°C溫浴15min，然后95°C滅活3min。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA-a和cDNA-b稀釋10倍作為熒 光定量PCR模板。
[0026] 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其 PCR混合液包括 12.5 yL 2XQuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μ M 引物，1 μ L 模板，無(wú) RNA 酶的水 10. 5 μ L。引物仍^ -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-31 )與 -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-31 )特異性擴(kuò)增微 囊藻偽空胞基因，引物 #icr7財(cái)F (5 ^ -GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3 J 與 #icr^?77? (5 ^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3 J特異性擴(kuò)增微囊藻16srRNA內(nèi)參基因。
[0027] 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3 min，緊接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包 括 95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0028] 5.分別以步驟2得到的9個(gè)水樣的反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA-a和cDNA-b樣本為模板， 按上述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。以 引物擴(kuò)增微囊藻偽空胞基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為Ct a^hgws 因、Ct室內(nèi)目的基因，以引物#化，特異性擴(kuò)增微囊藻財(cái)內(nèi)參基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的 閾值循環(huán)數(shù)值，記為Cts外肖-樣本16s、Ct室肖樣本16s ;兩者差值（Cts外目_g_Ct|j外肖-樣本16s)、 (Ct室內(nèi)目的基因-Ct室內(nèi)同一樣本16s)為校正后的細(xì)胞拷貝數(shù)，記作Δ Ct野外目的基因、Δ Ct室內(nèi)目的基因；以 16srRNA為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照基因來(lái)校正PCR模板的細(xì)胞拷貝數(shù)從而消除組間加樣量差異。ACt 野外目的基因與Mt室細(xì)貓因差值為野外目的基因相對(duì)循環(huán)數(shù)，記作AACt，采用計(jì)算相 對(duì)表達(dá)量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以的值為縱坐標(biāo)繪制曲線見(jiàn)圖2,由圖2可以看出太湖 梅梁灣水體藍(lán)藻基因相對(duì)表達(dá)量在2012年11月到2013年2月處于較低水平階段， 到2013年3月^基因相對(duì)表達(dá)量急劇升高并持續(xù)到5月，但到6月份時(shí)又急劇下降，說(shuō) 明2013年3月到2013年5月是藍(lán)藻的復(fù)蘇期，而3月份是藍(lán)藻越冬期與復(fù)蘇期的分界線。 所以在2013年3月份即藍(lán)藻復(fù)蘇之前對(duì)太湖梅梁灣藍(lán)藻開(kāi)展底泥翻耕類工程，之后在2013 年7月到2013年9月連續(xù)三個(gè)月時(shí)間采集太湖梅梁灣水樣檢測(cè)藍(lán)藻生物量(通常根據(jù)藍(lán)藻 體內(nèi)參與光合作用的藻藍(lán)蛋白濃度表征藍(lán)藻生物量)。與2012年7月到2012年9月同一 時(shí)間段但未采取措施處理之前相比，藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白濃度大大下降，結(jié)果間表1。
[0029] 表1 :處理前與處理后太湖梅梁灣水體藻藍(lán)蛋白濃度對(duì)比 實(shí)施例2

【權(quán)利要求】
1. 一種判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，其特征在于包括如下步驟： 1) 取發(fā)生藍(lán)藻水華區(qū)域的水樣，進(jìn)行總RNA提取純化，得到RNA樣本a ; 2) 室內(nèi)培養(yǎng)微囊藻，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期離心收集藻細(xì)胞，進(jìn)行總RNA提取純化，得到RNA樣 本b ; 3) 分別以RNA樣本a和RNA樣本b進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA-a和cDNA-b ; 4) 以步驟3)得到的cDNA-a作為熒光定量PCR的模板，以引物^擴(kuò)增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為;以引物#icr特異性擴(kuò)增微 囊藻MsrTS財(cái)內(nèi)參基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為Ct 16s ;兩者差 值Ct野外目的翻-Ct野外同一樣本16s為校正后的細(xì)胞拷貝數(shù)，記作ACt野外目的基因； 5) 以步驟3)得到的cDNA-b作為熒光定量PCR的模板，以引物^擴(kuò)增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為Cts__H ;以引物#icr特異性擴(kuò)增微 囊藻MsrTS財(cái)內(nèi)參基因，PCR完成后，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)值，記為Cts_n16s ;兩者差 值Ct室內(nèi)目腿因_ Ct室內(nèi)同一樣本16s為校正后的細(xì)胞拷貝數(shù)，記作ACt室內(nèi)目腿因； 6) 八(]1:野外_基_與ACt室肖_基_差值為里了外目的基因相對(duì)循環(huán)數(shù)，記作A ACt，米用 fAAet計(jì)算相對(duì)表達(dá)量； 7) 取不同時(shí)間的水樣重復(fù)上述步驟1)?6)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，步驟6) Aet的值為 縱坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)曲線確定越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，其特征在于：步驟2) 中微囊藻為微囊藻 (is aerygifliosa 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，其特征在于：步驟 2)中室內(nèi)培養(yǎng)微囊藻的培養(yǎng)基為BG-11，培養(yǎng)溫度為28?35 °C，光照強(qiáng)度為20?60 ii E ? (m2 ? s) \光照周期為 9 h:15 h ?12 h:12 h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，其特征在于：引物 序列為：g^7d5' -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3'， gvpC-R^ -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3, 〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，其特征在于：引物 #icr 引物序列為 -GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3、 Micr431R^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3, 〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的判別越冬藍(lán)藻越冬復(fù)蘇期界限的方法，其特征在于：熒光定 量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3min，緊接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95°C 15s、55°C 30s和 72°C 45s〇
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK104388544SQ201410587421
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】虞龍, 張金麗, 李玉燕, 于洋, 杜明勇 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)