焦磷酸測序法同時檢測cbfb-myh11和aml1-eto融合基因的引物對及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法同時檢測CBFB-MYH11和AML1-ETO融合基因的引物對及包含所述引物對的試劑盒，該試劑盒能夠一次性檢測CBFB-MYH11(type A)、CBFB-MYH11(type D)、AML1-ETO多種融合基因。通過對CBFB-MYH11、AML1-ETO融合基因的mRNA設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR后對產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，本試劑盒可以實(shí)現(xiàn)CBFB-MYH11、AML1-ETO融合基因的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測。
【專利說明】焦磷酸測序法同時檢測CBFB-MYH11和AML1-ET0融合基因 的引物對及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測序法同時檢測CBFB-MYH11、 AMLl-ETO融合基因的引物對，包含所述引物對的試劑盒及該試劑盒的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] CBFB-MYH1UAML1-ET0融合基因包括CBFB-MYHll(type A)、CBFB-MYH11 (type D)、 AMLl-ETO等多種類型，常見于急性髓系白血?。ˋML)中。
[0003] 當(dāng)前國內(nèi)外廣泛使用的分子生物學(xué)檢測CBFB-MYH11、AMLl-ETO融合基因的方法 中，熒光原位雜交技術(shù)（FISH)只能進(jìn)行定性檢測、操作復(fù)雜；熒光定量PCR存在著檢測通量 的局限性，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片（Biochip) 或基因芯片技術(shù)存在著可重復(fù)性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點(diǎn)。
[0004] 焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術(shù)，具備同時對大量 樣品進(jìn)行測序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進(jìn)行核苷酸分析和臨床檢驗(yàn)提 供了非常理想的技術(shù)操作平臺。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種焦磷酸測序法同時 檢測CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基因的引入對以及含有所述引物對的試劑盒，可以同時 檢測 CBFB-MYH11 (type A)、CBFB-MYH11 (type D)和 AMLl-ETO 多種融合基因，具有高靈敏 度、高特異性、高準(zhǔn)確度、檢測迅速等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出了一種焦磷酸測序法同時檢測 CBFB-MYH11 和 AMLl-ETO 融合基因的引物對，所述的 CBFB-MYH11 為 CBFB-MYHll(type A)和 CBFB-MYHlUtype D)中的任意一種或兩種，其特征在于，所述引物對包括：
[0007] (1)對于 CBFB-MYHll(type A)基因，
[0008] 擴(kuò)增引物為：
[0009] 上游引物：5，-CAGGTCTCATCGGGAGGAAAT-3'，
[0010] 下游引物：5，-TGACTTCCAGCCGCAGTT-3，，
[0011] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0012] 測序引物為：
[0013] 5; -GACTTCTCCAGCTCATG-3;；
[0014] (2)對于 CBFB-MYH11 (type D)基因：
[0015] 擴(kuò)增引物：
[0016] 上游引物：5，-AGCAGGAGGATGCATTAGCA-3，，
[0017] 下游引物：5，-ACGTCCTTGGCCAGCTTAATG-3，，
[0018] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0019] 測序引物：
[0020] 5，-TGTGACGCTCTCAACTT-3，
[0021] (3) AMLl-ETO ：
[0022] 擴(kuò)增引物：
[0023] 上游引物：5，-CACAAACCCACCGCAAGTC-3，，
[0024] 下游引物：5，-TTGTTGGAGGAGTCAGCCTAGA-3，，
[0025] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0026] 測序引物：
[0027] 5' -TGGAGTGCTTCTCAGTACG-3，。
[0028] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了一種焦磷酸測序法同時檢測CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基 因的試劑盒，所述的 CBFB-MYH11 為 CBFB-MYHlUtype A)和 CBFB-MYHlUtype D)中的任意 一種或兩種，其特征在于，所述試劑盒包含質(zhì)控品和如下引物：
[0029] (l)CBFB-MYHll(type A)：
[0030] 擴(kuò)增引物：
[0031] 上游引物：5，-CAGGTCTCATCGGGAGGAAAT-3'，
[0032] 下游引物：5，-TGACTTCCAGCCGCAGTT-3，，
[0033] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0034] 測序引物：
[0035] 5; -GACTTCTCCAGCTCATG-3;；
[0036] (2) CBFB-MYHlKtype D)：
[0037] 擴(kuò)增引物：
[0038] 上游引物：5，-AGCAGGAGGATGCATTAGCA-3，，
[0039] 下游引物：5，-ACGTCCTTGGCCAGCTTAATG-3，，
[0040] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0041] 測序引物：
[0042] 5，-TGTGACGCTCTCAACTT-3，；
[0043] (3) AMLl-ETO ：
[0044] 擴(kuò)增引物：
[0045] 上游引物：5，-CACAAACCCACCGCAAGTC-3，，
[0046] 下游引物：5，-TTGTTGGAGGAGTCAGCCTAGA-3，，
[0047] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0048] 測序引物：
[0049] 5' -TGGAGTGCTTCTCAGTACG-3，。
[0050] 其中，所述質(zhì)控品包括陽性對照品和陰性對照品，其中，所述的陽性對照品為含有 CBFB-MYHlUtype A)、CBFB-MYH11 (type D)和AMLl-ETO的質(zhì)粒的混合液，所述的陰性對照 品為不含 CBFB-MYH11 (type A)、CBFB-MYH11 (type D)和 AMLl-ETO 的質(zhì)粒溶液。
[0051] 本發(fā)明還提出了上述引物對及包含上述引物對的試劑盒在制備同時檢測 CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基因的試劑中的應(yīng)用。
[0052] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的焦磷酸測序法同時檢測CBFB-MYH11、 AMLl-ETO融合基因的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡便、高效、準(zhǔn)確的檢測CBFB-MYH11 (type A)、CBFB-MYH11 (type D)、AMLl-ETO 融合基因，為制備用于檢測 CBFB-MYH11 (type A)、 CBFB-MYH11 (type D)、AMLl-ETO融合基因的試劑提供了理論基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0053] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0054] 弓丨物由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試 劑盒購置于Fermentas公司；多重PCR試劑盒購置于QIAGEN公司；焦磷酸測序試劑購置于 QIAGEN 公司。
[0055] -種焦磷酸測序法檢測CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基因的試劑盒，所述的 CBFB-MYH11 為 CBFB-MYHll(type A)和 CBFB-MYHll(type D)中的任意一種或兩種，包括質(zhì) 控品和如下引物：
[0056] (l)CBFB-MYHll(type A)：
[0057] 擴(kuò)增引物：
[0058] 上游引物：5，-CAGGTCTCATCGGGAGGAAAT-3'，
[0059] 下游引物：5，-TGACTTCCAGCCGCAGTT-3，，
[0060] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0061] 測序引物：
[0062] 5， -GACTTCTCCAGCTCATG-3'，
[0063] (2) CBFB-MYHlKtype D)：
[0064] 擴(kuò)增引物：
[0065] 上游引物：5，-AGCAGGAGGATGCATTAGCA-3，，
[0066] 下游引物：5，-ACGTCCTTGGCCAGCTTAATG-3，，
[0067] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0068] 測序引物：
[0069] 5，-TGTGACGCTCTCAACTT-3，
[0070] (3) AMLl-ETO ：
[0071] 擴(kuò)增引物：
[0072] 上游引物：5，-CACAAACCCACCGCAAGTC-3，，
[0073] 下游引物：5，-TTGTTGGAGGAGTCAGCCTAGA-3，，
[0074] 其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0075] 測序引物：
[0076] 5' -TGGAGTGCTTCTCAGTACG-3'，其中下游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
[0077] 其中，質(zhì)控品（質(zhì)控品DNA)包括陽性對照品和陰性對照品，陽性對照品為含有 CBFB-MYHlUtype A)、CBFB-MYHlUtype D)和AMLl-ETO的質(zhì)粒的混合液，所述的陰性對 照品作為陽性對照品的對照，與陽性對照品相比，陰性對照品為不含CBFB-MYH11 (type A)、 CBFB-MYH11 (type D)和 AMLl-ETO 的質(zhì)粒溶液。
[0078] 檢測方法包括如下步驟：
[0079] ( -）RNA 提?。?br> [0080] 取13個AML患者的臨床樣本；1?13號患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提 取 RNA :
[0081] (1)淋巴細(xì)胞提?。喝⌒迈r全血2ml加 Iml 3wt%檸檬酸鈉，混勻后在4°C下 3000r/min離心lOmin，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細(xì)胞，得到淋巴細(xì)胞液；
[0082] (2)取1個離心管（經(jīng)DEPC水處理）加入⑴中的淋巴細(xì)胞液150 μ 1，然后加 Iml Trizol，室溫放置5min，使其充分裂解；
[0083] (3) 12, OOOr/min 離心 5min，取上清；
[0084] (4)向上清中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ;
[0085] (5) 4°C 12, OOOg 下離心 15min ;
[0086] (6)吸取上層水相，將水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中；
[0087] (7)向水相中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5?IOmin ;
[0088] (8)4°C 12, OOOg下離心lOmin，棄上清，RNA沉于管底；
[0089] (9)向步驟⑶的管中加入Iml 75% (v/v)乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；
[0090] (10) 4°C 8, OOOg 離心 5min，盡量棄上清；
[0091] (11)室溫瞭干或真空干燥5?IOmin ;
[0092] (12)用 50ul RNase-free dH20 溶解 RNA 樣品，55 ?6(TC，5 ?IOmin ;
[0093] (13)測OD值定量RNA濃度。
[0094] 按照上述步驟，分別獲得1-13號樣本的mRNA。
[0095] (二）多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增：
[0096] 按照如下方法對上述的1-13號樣本的mRNA進(jìn)行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增：
[0097] (l)cDNA第一鏈的合成
[0098] ①取一 RNase-free的離心管，置于冰上，建立下列反應(yīng)體系；
[0099] Total RNA 5 ~ 10 μ g/3 μ 1
[0100] Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ I) 1 μ I
[0101] RNase-free dH20 加至 12 μ I
[0102] 輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；
[0103] ②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機(jī)稍微離 心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；
[0104] ③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應(yīng)液；
[0105] 5 X reaction buffer 4 μ I
[0106] RNase Inhibitor (20U/μ I) I μ I
[0107] IOmMdNTPsMix 2μ 1
[0108] 輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；
[0109] ④離心管于37°C溫育5分鐘；
[0110] ⑤加入 1 μ I RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ;
[0111] ⑥離心管于42°C反應(yīng)60分鐘；
[0112] ⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應(yīng)，之后迅速取出置于冰中冷卻。
[0113] 如此，合成 cDNA 第一鏈，即模板 cDNA(Template cDNA)。
[0114] (2)多重 PCR
[0115] 采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR試劑盒，體系如下
[0116]

【權(quán)利要求】
1. 一種焦磷酸測序法同時檢測CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基因的引物對，所述的 CBFB-MYH11 為 CBFB-MYHll(type A)和 CBFB-MYHll(type D)中的任意一種或兩種，其特征 在于，所述引物對包括： (1) 對于 CBFB-MYHll(type A)基因， 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -CAGGTCTCATCGGGAGGAAAT-3'， 下游引物：5' -TGACTTCCAGCCGCAGIT-3'， 其中下游引物的5 '端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測序引物為： 5 ; -GACTTCTCCAGCTCATG-3 ;； (2) 對于 CBFB-MYHll(type D)基因： 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -AGCAGGAGGATGCATTAGCA-3'， 下游引物：5' -ACGTCCTTGGCCAGCTTAATG-3'， 其中下游引物的5 '端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測序引物： 5 ' -TGTGACGCTCTCAACTT_3 ; ⑶對于AMLl-ETO基因： 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -CACAAACCCACCGCAAGTC-3'， 下游引物：5' -TTGITGGAGGAGTCAGCCTAGA-3'， 其中下游引物的5 '端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測序引物： 5 ^ -TGGAGTGCTTCTCAGTACG-3 ^ 。
2. -種焦磷酸測序法同時檢測CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基因的試劑盒，所述的 CBFB-MYH11 為 CBFB-MYHll(type A)和 CBFB-MYHll(type D)中的任意一種或兩種，其特征 在于，所述試劑盒包含如下所述的引物對： (1) 對于 CBFB-MYHll(type A)基因， 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -CAGGTCTCATCGGGAGGAAAT-3'， 下游引物：5' -TGACTTCCAGCCGCAGIT-3'， 其中下游引物的5 '端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測序引物為： 5 ; -GACTTCTCCAGCTCATG-3 ;； (2) 對于 CBFB-MYHll(type D)基因： 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -AGCAGGAGGATGCATTAGCA-3'， 下游引物：5' -ACGTCCTTGGCCAGCTTAATG-3'， 其中下游引物的5 '端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測序引物： 5 ' -TGTGACGCTCTCAACTT-3 ' ⑶對于AMLl-ETO基因： 擴(kuò)增引物為： 上游引物：5' -CACAAACCCACCGCAAGTC-3'， 下游引物：5' -TTGITGGAGGAGTCAGCCTAGA-3'， 其中下游引物的5 '端進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測序引物： 5 ^ -TGGAGTGCTTCTCAGTACG-3 ^ 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括質(zhì)控品，所述質(zhì)控品 包括陽性對照品和陰性對照品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照品為含有 CBFB-MYHlUtype A)、CBFB-MYH11 (type D)和AMLl-ETO的質(zhì)粒的混合液，所述的陰性對照 品為不含 CBFB-MYHll(type A)、CBFB-MYHll(type D)和 AMLl-ETO 的質(zhì)粒溶液。
5. 權(quán)利要求1所述的引物對在制備同時檢測CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基因的試劑 中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2或3所述的試劑盒在制備同時檢測CBFB-MYH11和AMLl-ETO融合基因的 試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313160SQ201410589440
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】邵棠, 陳慶, 李玲, 段彪 申請人:邵棠