一種耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將葡萄糖氧化酶556位點(diǎn)的甲硫氨酸分別突變?yōu)榱涟彼?，并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母Pichia pastoris GS115中，經(jīng)篩選鑒定得到一株較原有菌株耐氧化性提高的菌株。該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶相比于對(duì)照酶，耐氧化性在不同濃度的H2O2處理后剩余酶活均有不同程度的提高，在100mmol·L-1和500mmol·L-1 H2O2存在下是對(duì)照酶的2倍。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，簡(jiǎn)稱(chēng)G0D)是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一， 自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面將其應(yīng)用于血糖測(cè)定以來(lái)，GOD 被廣泛應(yīng)用于食品飼料醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄糖氧化酶的研究主要集中產(chǎn)該酶的 新菌株的篩選，菌株的定向改良以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面。
[0003] 在食品工業(yè)中，由于氧的存在引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微 生物生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。目前許多國(guó)家已將GOD作為公認(rèn)的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食 品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于將葡萄糖氧化形成過(guò)氧化氫和 葡萄糖酸。利用其專(zhuān)一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析儀能快速準(zhǔn)確簡(jiǎn)易地測(cè)定各種 食品中的葡萄糖含量指導(dǎo)生產(chǎn)。在醫(yī)藥工業(yè)中GOD作為試劑盒酶電極等用于血清（漿）尿 液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑牙垢和 齲齒的形成，防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外由于可以催化生成H 2O2，還可用于對(duì)H2O2敏 感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動(dòng)物腸道環(huán) 境調(diào)節(jié)飼料消化促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。含葡萄糖氧化酶乳酸過(guò)氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加 劑可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染腹瀉并有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用。從動(dòng)植物組織中提取GOD有一 定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用黑曲霉和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn) 菌。我國(guó)及美國(guó)均采用點(diǎn)青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)G0D，日本常用尼奇青霉，俄羅斯用生機(jī)青霉。 近年報(bào)道膠霉屬（Clioctadium)、擬青霉屬（Paecilomyces)和帚霉屬（Scopulariopsis)也 能生產(chǎn)G0D。葡萄糖氧化酶主要來(lái)源是黑曲霉，由于黑曲霉所產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶活低、催化 效率低和雜蛋白較多而使得其在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。
[0004] GOD反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)氧化氫，使得該酶具有抗菌殺菌的作用，但是過(guò)氧化氫的積 累會(huì)抑制GOD的活性而影響其本身的催化效率。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到30mM時(shí)就 會(huì)對(duì)GOD活性產(chǎn)生抑制作用。因此提高GOD對(duì)氧的耐受性事目前亟待解決的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，其特征在于，編碼所述葡萄糖氧 化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。
[0006] 編碼所述葡萄糖氧化酶的核苷酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。
[0007] 所述葡萄糖氧化酶是以SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，將第556位 的甲硫氨酸M突變?yōu)榱涟彼酟 ;所得突變葡萄糖氧化酶分別命名為M556L。
[0008] 編碼SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 所述發(fā)生突變的第556位的甲硫氨酸位于葡萄糖氧化酶的催化活性中心。
[0010] 本發(fā)明還提供一種表達(dá)所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌。
[0011] 所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是以畢赤酵母（Pichia pastoris) GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達(dá)SEQ ID NO. 4所示序列的基因的工程菌。
[0012] 所述基因工程菌的構(gòu)建方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將序列如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸片段連接到表達(dá)載體pPIC9K上形成重組載體，在將重組載體轉(zhuǎn)化 P. pastoris GS115,即獲得基因工程菌。
[0013] 本發(fā)明還提供一種利用所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，其特征在 于，包括：（1)將基因工程菌活化后培養(yǎng)至〇D_ = 1. 6-1. 7,作為種子液；（2)種子液接種于 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，于28°C -30°C培養(yǎng)至0D_ = 1. 2-1. 5 ; (3)收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培 養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)蛋白。
[0014] 所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中為BMGY培養(yǎng)基。
[0015] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中為BMMY培養(yǎng)基。
[0016] 本發(fā)明還提供一種測(cè)定權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶的耐氧化性的方法，其特征 在于，是將葡萄糖氧化酶采用無(wú)載體交聯(lián)固定化技術(shù)進(jìn)行固定化之后，將固定化酶于不同 濃度的H 2O2中處理，處理后離心、棄去上清，用緩沖液洗沉淀直到上清中無(wú)法檢測(cè)到H2O 2，計(jì) 算經(jīng)H2O2處理與不經(jīng)H2O2處理的固定化葡萄糖氧化酶的酶活比值。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶M556L相比于對(duì)照酶，耐氧化性 在不同濃度的H 2O2處理后剩余酶活均有不同程度的提高，經(jīng)50-500mmol ^r1H2O2處理后，突 變酶M556L的酶活約為對(duì)照酶的2倍。本發(fā)明提供的葡萄糖氧化酶，其氧化穩(wěn)定性顯著提 高，在工業(yè)上具有重大應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1 :葡萄糖氧化酶蛋白電泳（SDS-PAGE) ;M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :突變株M556L 產(chǎn)酶純化后；2 :對(duì)照菌株產(chǎn)酶純化后；
[0019] 圖2 :對(duì)照酶與突變酶的耐氧化性比較。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 葡萄糖氧化酶酶活測(cè)定方法：G0D活性測(cè)定采用鄰-聯(lián)（二）茴香胺分光光度法。 在有氧的條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在過(guò)氧化物酶（POD)作用下，氧供體鄰-聯(lián) (二）茴香胺（DH2)被氧化成棕色產(chǎn)物。測(cè)540nm處吸光度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果 計(jì)算葡萄糖氧化酶活力單位。1個(gè)葡萄糖氧化酶活力（IU)定義為：在30°C、pH6. 0的條件 下，Imin將1 μ mol的β -D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量為一個(gè)葡萄糖氧 化酶酶活力單位。
[0021] 實(shí)施例1重組菌的構(gòu)建及鑒定
[0022] 將核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的基因片段連接到pPIC9K構(gòu)成重組質(zhì)粒，以 該重組質(zhì)粒為模板，定點(diǎn)突變獲得含有序列如SEQ ID NO. 4所示的GOD基因的重組載體 PPIC9K-G0D。所用定點(diǎn)突變引物為M556L-F(序列如SEQ ID NO. 5所示）、M556L-R(序列如 SEQ ID NO. 6 所示）：
[0023] M556L-F :5'CCTCCTACGCAACTGTCGTCCCATG3' ；
[0024] M556L-R :5'GTACCCTGCTGTCAACGCATCCTCC3' ；
[0025] PCR反應(yīng)體系：0. 2mLPCR管中按順序加入以下試劑：5XFD PCR buffer 5μ I ; DNTP Mixture 2 μ I ;模板DNA 1 μ I ;上游引物各1 μ I ;phusion酶0· 5 μ I ;加雙蒸水至終 體積為 25μ 1。5XFD PCR buffer 5μ I ;DNTP Mixture 2μ 1 ;模板 DNA 1μ 1 ;下游引物各 1μ I ;phusion酶0. 5μ I ;DMS0 1.5μ 1加雙蒸水至終體積為25μ 1。反應(yīng)5個(gè)循環(huán)后，將對(duì) 應(yīng)PCR反應(yīng)液混合，繼續(xù)反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增條件：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性15s ; 53°C退火30s ;72°C延伸I Imin (5個(gè)循環(huán)）；72°C延伸IOmin?；旌虾髷U(kuò)增條件：98°C變預(yù)變 性 3min ;98°C變性 15s ;53°C退火 30s ;72°C延伸 llmin(25 個(gè)循環(huán)）；72°C延伸 lOmin。
[0026] 限制性?xún)?nèi)切酶DpnI消化后，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌JM109,轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有 氨芐青霉素的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。最終獲得分別含有突變氨基酸GOD基因的載體 PPIC9K-G0D。
[0027] 或者直接采用化學(xué)合成的方法獲得序列如SEQ ID NO. 4所示的基因片段，并連接 表達(dá)載體PPIC9K形成重組質(zhì)粒pPIC9K-G0D。
[0028] 重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)入Pichia pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)化方法為： 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)法：P. Pastoris GSl 15于50mL YPD中培養(yǎng)至OD6tltl = L 2-1. 5離 心收集細(xì)胞；依次用400mL冰冷的無(wú)菌水洗兩次細(xì)胞，再用40mL冰冷的lmol/L的山梨醇洗 一次細(xì)胞，重懸細(xì)胞于ImL lmol/L的山梨醇中。100 μ L原生質(zhì)體與5-10 μ g線性化質(zhì)粒 DNA (MSSI切）混合轉(zhuǎn)入冰冷的lmol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養(yǎng)基。30°C培養(yǎng) 4-6天后挑取單克隆。篩選正確的轉(zhuǎn)化子即為重組基因工程菌。
[0029] 實(shí)施例2高表達(dá)菌株的篩選
[0030] 分別制備含 0mg/mL、lmg/mL、I. 5mg/mL、2mg/mL、2. 5mg/mL 遺傳霉素的 YPD 平板，將 MD培養(yǎng)基上的單克隆依次點(diǎn)板到不同濃度的Yro平板上培養(yǎng)48小時(shí)后，挑取形態(tài)較大的菌 落進(jìn)行下一步的發(fā)酵培養(yǎng)。
[0031] 實(shí)施例3重組菌產(chǎn)葡萄糖氧化酶的純化和蛋白電泳鑒定
[0032] 采用實(shí)施例2中獲得的酵母工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后將在30°C、200rpm條件下 在YPD生長(zhǎng)培養(yǎng)基（裝液量50mL)培養(yǎng)到0D_ = L 6-1. 7的種子以10% (v/v)的接種量 轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量50mL)，于3(TC、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)。在基本發(fā)酵培養(yǎng) 基中培養(yǎng)至OD 6tltl = 1. 2-1. 5時(shí)，離心收集全部菌體，生理鹽水洗滌2次，將菌體全部轉(zhuǎn)入 50mL(500mL三角瓶）液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，置于30°C、200r/min搖床培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加 發(fā)酵液體積1%的甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。以表達(dá)野生型（即，未經(jīng)突變的出發(fā)G0D)葡萄糖氧化酶 的P. pastoris GS115為對(duì)照菌株（即保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的編號(hào)為CCTCCN0 : M2012266 的菌株）。
[0033] 培養(yǎng)基：
[0034] 種子和斜面培養(yǎng)基為Yro培養(yǎng)基（IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖 2〇g ;斜面培養(yǎng)基添加瓊脂20g。
[0035] 基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基（IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL， YNB 13. 4g，IOOmM ρΗ6· 0 的磷酸緩沖液。
[0036] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基（IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL， YNB13. 4g，IOOmM pH6. 0 的磷酸緩沖液。
[0037] 發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵上清，對(duì)酶進(jìn)行純化，純化方法是陰離子層 析，采用梯度洗脫的方法，最終獲得較純的葡萄糖氧化酶。
[0038] 突變前后的葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE圖如圖1所示，可看出得到一條分子量大小 約為68kDa的蛋白條帶，該條帶即為葡萄糖氧化酶。
[0039] 實(shí)施例4葡萄糖氧化酶的固定化方法
[0040] 采用無(wú)載體交聯(lián)技術(shù)（CLEAs)固定化原酶與突變酶。取100 μ L酶液，加入等體 積的lOU/mL通用過(guò)氧化物酶，接著，緩慢滴加聚乙二醇2000至終濃度為75% (w/v)，然后 加入交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛，至終濃度為70臟〇1*171。將混合物放入搖床，301： 交聯(lián)一段20h時(shí)間，取出混合物，用緩沖液（IOmM丙二酸鈉緩沖液pH5. 0)洗滌，離心后收 集上清，并重復(fù)上述操作，直到上清中無(wú)法檢測(cè)到酶活，將固定化酶放入緩沖液中（終體積 10mL)，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0041] 實(shí)施例5酶的耐氧化性測(cè)定
[0042] 用Brandford試劑盒將原酶和突變酶的酶液統(tǒng)一到同一蛋白濃度，采用無(wú)載體交 聯(lián)技術(shù)固定化原酶與突變酶。
[0043] 將固定化后的原酶和突變酶放在不同濃度H2O2 (10、20、50、100、500mM)處理，處理 溫度為35°C，處理時(shí)間為2h，緩沖液為丙二酸鈉緩沖液（pH5. 0, IOmM)。處理后，離心，倒掉 上清，并用緩沖液洗沉淀直到上清中無(wú)法檢測(cè)到H2O2以徹底除去H 2O2。將沉淀用等體積的 緩沖液溶解，離心并充分重懸后測(cè)定剩余酶活。相對(duì)酶活是經(jīng)H 2O2處理后的酶活與初始酶 活的比值，定義初始酶活力為100%。
[0044] 通過(guò)對(duì)不同濃度H2O2條件下葡萄糖氧化酶穩(wěn)定性變化研究分析發(fā)現(xiàn)，如圖2所 示，隨著H 2O2濃度逐漸升高，葡萄糖氧化酶酶活殘留逐漸降低。同時(shí)相比于對(duì)照酶，突變酶 M556L的耐氧化性在不同濃度的H2O2處理后剩余酶活均有不同程度的提高，在50mmol · Γ1 至500mmol .171的H2O2存在下，突變酶M556L的酶活約為對(duì)照酶酶活的2倍，且在 50mmol · L-1的H2O2下，突變酶M556L還能保持無(wú) H2O2存在下的78%的酶活，而對(duì)照酶酶活 顯著下降。突變酶相對(duì)于對(duì)照酶，耐氧化性顯著提高。
[0045] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，其特征在于，編碼所述葡萄糖氧化酶的氨基酸 序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，編碼所述葡萄糖氧化酶的核苷 酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶，其特征在于，所述氨基酸序列是將SEQ ID NO. 1所示的氨基酸的第556位的甲硫氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?br> 4. 一種含有權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶的表達(dá)載體。
5. -種表達(dá)權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌。
6. -種權(quán)利要求5所述基因工程菌的構(gòu)建方法，是將SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列 連接到表達(dá)載體PPIC9K上形成重組載體，在將重組載體轉(zhuǎn)化P. pastoris GS115,即獲得基 因工程菌。
7. -種利用權(quán)利要求5所示基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于， 包括：（1)將基因工程菌活化后培養(yǎng)至〇D_ = 1. 6-1. 7,作為種子液；（2)種子液接種于基 礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，于28°C -30°C培養(yǎng)至OD6tltl = 1. 2-1. 5 ; (3)收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng) 基培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基；所 述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基。
9. 權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶在食品、醫(yī)藥、生物領(lǐng)域的應(yīng)用。
10. -種測(cè)定權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶的耐氧化性的方法，其特征在于，是將葡萄 糖氧化酶采用無(wú)載體交聯(lián)固定化技術(shù)進(jìn)行固定化之后，將固定化酶于不同濃度的H 2O2中處 理，處理后離心、棄去上清，用緩沖液洗沉淀直到上清中無(wú)法檢測(cè)到H2O 2，計(jì)算經(jīng)H2O2處理與 不經(jīng)H2O2處理的固定化葡萄糖氧化酶的酶活比值。
【文檔編號(hào)】C12N9/04GK104312989SQ201410589628
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 聞一凡, 張娟, 堵國(guó)成, 顧磊 申請(qǐng)人:江南大學(xué)