一種凝血酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種凝血酶的制備方法，其包括：過(guò)濾除去豬血漿中的雜質(zhì)；加入病毒滅活試劑進(jìn)行病毒滅活處理；加入吸附劑吸附凝血酶原；洗滌和浸泡吸附凝血酶原的吸附劑，再進(jìn)行透析；激活經(jīng)透析的溶液中的凝血酶原；將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.2-5.6，靜置后離心，將上清液的pH調(diào)節(jié)至6.0-6.5，靜置；通過(guò)膜吸附器后，洗脫得到洗脫液；經(jīng)超濾膜過(guò)濾；經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，再經(jīng)孔徑為20nm的過(guò)濾器過(guò)濾除去病毒；制成制劑。該制備方法在進(jìn)一步穩(wěn)定凝血酶產(chǎn)品的效價(jià)的基礎(chǔ)上，更有效地減少了凝血酶產(chǎn)品中的雜質(zhì)及降低雜蛋白濃度，并使病毒充分滅活后被除去。
【專利說(shuō)明】一種凝血酶的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化制藥領(lǐng)域，涉及一種凝血酶的制備方法，具體涉及一種有效降低 雜質(zhì)和去除/滅活病毒、效價(jià)穩(wěn)定的凝血酶的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶是一種廣泛存在于人體和動(dòng)物血液中的絲氨酸蛋白酶，它是血液凝血級(jí)聯(lián) 反應(yīng)中的主要效應(yīng)蛋白酶，顯現(xiàn)出促凝和抗凝的特性。當(dāng)循環(huán)凝血因子在暴露的血管外組 織與組織因子相接觸時(shí)，凝血酶會(huì)在組織上聚集。凝血酶通過(guò)激活血小板催化纖維蛋白原 轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，促進(jìn)血塊穩(wěn)定，從而在血栓性疾病的引發(fā)和發(fā)展中發(fā)揮核心作用。由于凝 血酶能直接作用于血液中的纖維蛋白原，促使其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白、加速血液的凝固而止血， 因此臨床上將其用于外傷、手術(shù)、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、婦產(chǎn)科、消化道出血的止血，特別是 用于手術(shù)中不易結(jié)扎的小血管止血、消化道出血及外傷出血等。
[0003] 目前，臨床上應(yīng)用的凝血酶主要是由人血以及豬、牛等動(dòng)物血分離提取的。其中， 由于豬血來(lái)源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶產(chǎn)品都是由豬血制備的，少量的是 由人血及牛血等血液制備的。但是，不論是從動(dòng)物血還是從人血制備的凝血酶產(chǎn)品，現(xiàn)有的 制備方法都會(huì)存在以下幾個(gè)問(wèn)題：（1)凝血酶產(chǎn)品效價(jià)不穩(wěn)定；（2)產(chǎn)品雜質(zhì)及雜蛋白濃度 偏高；(3)存在引入各種病毒的風(fēng)險(xiǎn)，這些都會(huì)限制凝血酶產(chǎn)品的臨床應(yīng)用，并造成安全隱 患。
[0004] 中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN1031160486(以下簡(jiǎn)稱在先專利）公開了一種豬凝血酶的 制備方法，該方法包括以下步驟：一、分離豬血漿；二、化學(xué)法病毒滅活；三、吸附凝血酶原； 四、收集凝血酶原；五、納米過(guò)濾；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的凍干保存。該專利申請(qǐng) 并未公開用于病毒滅活的試劑和納米膜的種類，而且所述方法得到的產(chǎn)品雜質(zhì)含量偏高， 其廣品的效價(jià)也有待進(jìn)一步提_。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種凝血酶的制備方法， 該制備方法在進(jìn)一步提高凝血酶產(chǎn)品的效價(jià)的基礎(chǔ)上，更有效地去除了凝血酶產(chǎn)品中的雜 質(zhì)并使病毒充分滅活后被除去。
[0006] 用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0007] -種凝血酶的制備方法，該制備方法包括以下步驟：
[0008] (1)過(guò)濾除去豬血漿中的雜質(zhì)；
[0009] (2)向步驟（1)得到的過(guò)濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，進(jìn)行病毒滅活處理；
[0010] ⑶向步驟⑵得到的經(jīng)病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，吸附凝血酶原，抽 濾；
[0011] (4)以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到 的吸附凝血酶原的吸附劑；
[0012] (5)將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡于包含117克/升氯化鈉、3克 /升檸檬酸三鈉的水溶液中，抽濾；
[0013] (6)將步驟（5)得到的濾液置于2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進(jìn)行透析；
[0014] (7)將步驟（6)得到的經(jīng)透析的溶液加熱至33-36°C，加入體積比為7%的溶液A， 再加入體積比為7 %的溶液B和體積比為7 %的溶液C，攪拌后靜置；其中，所述溶液A為以 35克/升的濃度將氯化鈣溶于9克/升的NaCl水溶液并經(jīng)加熱攪拌后離心得到的上清液； 溶液B為向步驟（6)得到的經(jīng)透析的溶液加入體積比為7 %的溶液A并攪拌后，加入體積比 為7%的1摩爾/升的氯化鈣水溶液制得的溶液；溶液C為1摩爾/升的氯化鈣水溶液； [0015] (8)將步驟（7)得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至5. 2-5. 6,靜置后離心，將上清液的pH調(diào) 節(jié)至6. 0-6. 5,靜置；
[0016] (9)將步驟（8)得到的上清液通過(guò)膜吸附器后，洗脫得到洗脫液；
[0017] (10)將步驟（9)得到的洗脫液經(jīng)超濾膜過(guò)濾；
[0018] (11)將步驟（10)得到的濾液經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，再經(jīng)孔徑為20nm的過(guò)濾器過(guò)濾除 去病毒；
[0019] (12)將步驟（11)得到溶液制成制劑。
[0020] 在上述制備方法的步驟（1)中，所述豬血漿為經(jīng)過(guò)抗凝預(yù)處理的豬血漿；優(yōu)選地， 所述抗凝預(yù)處理包括以下步驟：向新鮮的豬血加入抗凝劑，靜置后離心，收集上層血漿；更 優(yōu)選地，所述抗凝預(yù)處理包括以下步驟：向新鮮的豬血加入體積比為1/9的抗凝劑，輕輕攪 勻，在0-10°C下靜置后，并于5-8小時(shí)內(nèi)離心，離心溫度為8-15°C，離心時(shí)間為15-20分鐘， 收集上層血漿；優(yōu)選地，所述抗凝劑為38克/升的檸檬酸三鈉水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述 經(jīng)過(guò)抗凝預(yù)處理的豬血漿在〇-l〇°C下保存0-6小時(shí)或者-18°C以下冰凍貯存二年以內(nèi)備 用；優(yōu)選地，所述過(guò)濾為分別經(jīng)70目、100目、200目濾網(wǎng)過(guò)濾。
[0021] 在上述制備方法的步驟（2)中，優(yōu)選地，所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0. 3% 的磷酸三丁酯和重量比濃度為1 %的吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3 %的磷酸三 丁酯和體積比濃度為1%的TritonX-100的水溶液。
[0022] 在上述制備方法的步驟（3)中，優(yōu)選地，所述吸附劑為DEAE-SephadexA-50型離子 交換樹脂；優(yōu)選地，所述吸附劑與血漿的質(zhì)量比為〇. 5?2. 5 :1000,優(yōu)選為1. 5 :1000。
[0023] 在上述制備方法的步驟（4)中，優(yōu)選地，所述洗滌用溶液與血漿的比為100毫升? 200毫升：1000克，更優(yōu)選為160毫升：1000克。
[0024] 在上述制備方法的步驟（5)中，優(yōu)選地，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫升? 60毫升：1000克，更優(yōu)選為35毫升：1000克。
[0025] 在上述制備方法的步驟（6)中，優(yōu)選地，所述透析用溶液與血漿的比為2500毫 升?3500毫升：1000克，更優(yōu)選為3000毫升：1000克。
[0026] 在上述制備方法的步驟（8)中，優(yōu)選地，采用1摩爾/升冰醋酸水溶液將pH調(diào)節(jié) 至5. 2-5. 6 ;優(yōu)選地，采用飽和碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至6. 0-6. 5。
[0027] 在上述制備方法的步驟（9)中，優(yōu)選地，所述膜吸附器為纖維素膜吸附器，例 如SartobindQSingleSep型囊式膜吸附器；優(yōu)選地，所述洗脫的洗脫劑為先用濃度為 0? 15mol/L的NaCl水溶液，再用濃度為0? 25mol/L的NaCl水溶液。
[0028] 在上述制備方法的步驟（10)中，優(yōu)選地，所述超濾膜的截留分子量為10K-150K; 更優(yōu)選地，所述超濾膜過(guò)濾為先用截留分子量為150K的超濾膜過(guò)濾，再用截留分子量為 10K的超濾膜過(guò)濾；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述截留分子量為150K的超濾膜為截留分子量為150K 的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜，所述截留分子量為10K的超濾膜為截留分子量為10K的中 空纖維聚砜超濾膜。
[0029] 在上述制備方法的步驟（11)中，優(yōu)選地，所述過(guò)濾除菌的濾膜依次為0.8ym、 0. 45um和0. 22um的聚偏二氟乙烯膜。
[0030] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述凝血酶的制備方法包括以下步驟：
[0031] (1)在20±2°C下，分別經(jīng)70目、100目、200目濾網(wǎng)過(guò)濾除去經(jīng)過(guò)抗凝預(yù)處理豬血 漿中的雜質(zhì)；
[0032] (2)向步驟⑴得到的過(guò)濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，在24°C下進(jìn)行病毒滅活 處理4-6小時(shí)；所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和重量比濃度為1% 的吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和體積比濃度為1 %的Triton X-100的水溶液；
[0033] (3)在20±2°C下，向步驟⑵得到的經(jīng)病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，攪拌 45分鐘后靜置30分鐘以吸附凝血酶原，經(jīng)200目濾布過(guò)濾后抽濾；所述吸附劑與血漿的質(zhì) 量比為1. 5 :1000 ;
[0034] (4)以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到 的吸附凝血酶原的吸附劑；所述洗滌用溶液與血漿的比為160毫升：1000克；
[0035] (5)在室溫下，將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡于包含117克/升氯 化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中30分鐘，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫 升：1〇〇〇克；再將吸附劑浸泡于包含117克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中20 分鐘，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為15毫升：1000克，合并兩次的濾液；
[0036] (6)在0_4°C下，將步驟（5)得到的濾液置于2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進(jìn) 行透析5-5. 5小時(shí)；所述透析用溶液與血漿的比為3000毫升：1000克；
[0037] (7)將步驟（6)得到的經(jīng)透析的溶液加熱至33_36°C，加入體積比為7%的溶液A， 5分鐘后再加入體積比為7%的溶液B和體積比為7%的溶液C，攪拌15分鐘后4°C下靜置 1小時(shí)；其中，所述溶液A為以35克/升的濃度將氯化鈣溶于9克/升的NaCl水溶液，并經(jīng) 加熱攪拌后離心得到的上清液；溶液B為向步驟（6)得到經(jīng)透析的溶液加入體積比為7% 的溶液A并攪拌后，加入體積比為7%的1摩爾/升的氯化鈣水溶液制得的溶液；溶液C為 1摩爾/升的氯化鈣水溶液；
[0038] (8)采用1摩爾/升冰醋酸水溶液將步驟（7)得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至5. 2-5. 6， 在4°C下靜置30-45分鐘后以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-20分鐘，采用飽和碳酸氫鈉溶液將上 清液的pH調(diào)節(jié)至6. 0-6. 5,在4°C下靜置30-45分鐘后以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-20分鐘；
[0039] (9)將步驟⑶得到的上清液以0? 4Mpa的壓力、0? 03?20升/分鐘的流速通過(guò) 膜吸附器后，先用濃度為〇.15mol/LNaCl水溶液洗滌，再用濃度為0.25mol/LNaCl水溶液 洗脫得到洗脫液；
[0040] (10)將步驟（9)得到的洗脫液pH控制為2-13,在5-45°C的溫度和不大于0. 3Mpa 壓力下先經(jīng)截留分子量為150K的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜過(guò)濾，再在5-45°C的溫度和 不大于0. 12Mpa壓力下經(jīng)截留分子量為10K的中空纖維聚砜超濾膜過(guò)濾，并濃縮濾液；
[0041] (11)將步驟（9)得到的濾液依次經(jīng)孔徑為0.8i! m、0.45i!m和0.22i!m的聚偏二 氟乙烯膜過(guò)濾除菌，然后經(jīng)孔徑為0. 1Um的濾膜預(yù)過(guò)濾，再以200 ±lOKPa的過(guò)濾壓力經(jīng)孔 徑為20nm的濾器過(guò)濾除病毒；
[0042] (12)將步驟（11)得到溶液與藥學(xué)上可接受的輔料混合，經(jīng)凍干制成凍干制劑。
[0043] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的制備方法在進(jìn)一步穩(wěn)定凝血酶產(chǎn)品的 效價(jià)的基礎(chǔ)上，更有效地減少了凝血酶產(chǎn)品中的雜質(zhì)，降低了雜蛋白濃度并使病毒充分滅 活后被除去，從而延長(zhǎng)了凝血酶產(chǎn)品的運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用周期，消除了安全隱患，更有利于 凝血酶產(chǎn)品在臨床上發(fā)揮療效，為廣大患者帶來(lái)益處。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044] 以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0045] 圖1為本發(fā)明的凝血酶的制備方法的工藝流程圖；其中，潔凈區(qū)：溫度18_26°C;相 對(duì)濕度45-65% ;保持一定的正壓，與室外的靜壓差彡10Pa;
[0046] 圖2顯示了電泳法檢測(cè)實(shí)施例1制備的凝血酶產(chǎn)品的雜質(zhì)含量的結(jié)果；
[0047] 圖3顯示了超濾前后的蛋白分子量分布的對(duì)比結(jié)果；其中，圖3A:超濾前；圖3B: 超濾后。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0049] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的原 料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。
[0050] 實(shí)施例1凝血酶的制備方法
[0051] 一、生產(chǎn)處方
[0052] 1、豬血預(yù)處理：
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種凝血酶的制備方法，該制備方法包括以下步驟： (1) 過(guò)濾除去豬血漿中的雜質(zhì)； (2) 向步驟（1)得到的過(guò)濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，進(jìn)行病毒滅活處理； (3) 向步驟（2)得到的經(jīng)病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，吸附凝血酶原，抽濾； (4) 以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到的吸 附凝血酶原的吸附劑； (5) 將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡于包含117克/升氯化鈉、3克/升 檸檬酸三鈉的水溶液中，抽濾； (6) 將步驟（5)得到的濾液置于2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進(jìn)行透析； (7) 將步驟（6)得到的經(jīng)透析的溶液加熱至33-36°C，加入體積比為7%的溶液A，再加 入體積比為7 %的溶液B和體積比為7 %的溶液C，攪拌后靜置；其中，所述溶液A為以35 克/升的濃度將氯化鈣溶于9克/升的NaCl水溶液并經(jīng)加熱攪拌后離心得到的上清液；溶 液B為向步驟（6)得到的經(jīng)透析的溶液加入體積比為7 %的溶液A并攪拌后，加入體積比為 7%的1摩爾/升的氯化鈣水溶液制得的溶液；溶液C為1摩爾/升的氯化鈣水溶液； (8) 將步驟（7)得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至5. 2-5. 6,靜置后離心，將上清液的pH調(diào)節(jié)至 6. 0-6. 5,靜置； (9) 將步驟（8)得到的上清液通過(guò)膜吸附器后，洗脫得到洗脫液。 (10) 將步驟（9)得到的洗脫液經(jīng)超濾膜過(guò)濾； (11) 將步驟（10)得到的濾液經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，再經(jīng)孔徑為20nm的過(guò)濾器過(guò)濾除去病 毒； (12) 將步驟（11)得到溶液制成制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備方法的步驟（1) 中，所述豬血漿為經(jīng)過(guò)抗凝預(yù)處理的豬血漿；優(yōu)選地，所述抗凝預(yù)處理包括以下步驟：向新 鮮的豬血加入抗凝劑，靜置后離心，收集上層血漿；更優(yōu)選地，所述抗凝預(yù)處理包括以下步 驟：向新鮮的豬血加入體積比為1/9的抗凝劑，輕輕攪勻，在0-KTC下靜置后，并于5-8小 時(shí)內(nèi)離心，離心溫度為8-15°C，離心時(shí)間為15-20分鐘，收集上層血漿；優(yōu)選地，所述抗凝劑 為38克/升的檸檬酸三鈉水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述經(jīng)過(guò)抗凝預(yù)處理的豬血漿在0-KTC 下保存0-6小時(shí)或者_(dá)18°C以下冰凍貯存二年以內(nèi)備用；優(yōu)選地，所述過(guò)濾為分別經(jīng)70目、 100目、200目濾網(wǎng)過(guò)濾。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備方法的步 驟（2)中，優(yōu)選地，所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0.3%的磷酸三丁酯和重量比濃度 為1%的吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和體積比濃度為1%的 Triton X-100的水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在上述制備方 法的步驟（3)中，優(yōu)選地，所述吸附劑為DEAE-Sephadex A-50型離子交換樹脂；優(yōu)選地，所 述吸附劑與血漿的質(zhì)量比為〇. 5?2. 5 :1000,優(yōu)選為1. 5 :1000。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備方 法的步驟（4)中，優(yōu)選地，所述洗滌用溶液與血漿的比為100毫升?200毫升：1000克，更 優(yōu)選為160毫升：1000克。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備方 法的步驟（5)中，優(yōu)選地，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫升?60毫升：1000克，更優(yōu) 選為35毫升：1000克。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備方 法的步驟（6)中，優(yōu)選地，所述透析用溶液與血漿的比為2500毫升?3500毫升：1000克， 更優(yōu)選為3000毫升：1000克。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備方 法的步驟（8)中，優(yōu)選地，采用1摩爾/升冰醋酸水溶液將pH調(diào)節(jié)至5. 2-5. 6 ;優(yōu)選地，采 用飽和碳酸氫鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至6. 0-6. 5。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備 方法的步驟（9)中，優(yōu)選地，所述膜吸附器為纖維素膜吸附器，例如Sartobind Q Singles印 型囊式膜吸附器；優(yōu)選地，所述洗脫的洗脫劑為先用濃度為〇. 15mol/L的NaCl水溶液，再用 濃度為〇? 25mol/L的NaCl水溶液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備 方法的步驟（10)中，所述超濾膜的截留分子量為10K-150K;優(yōu)選地，所述超濾膜過(guò)濾為先 用截留分子量為150K的超濾膜過(guò)濾，再用截留分子量為10K的超濾膜過(guò)濾；進(jìn)一步優(yōu)選地， 所述截留分子量為150K的超濾膜為截留分子量為150K的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜，所 述截留分子量為10K的超濾膜為截留分子量為10K的中空纖維聚砜超濾膜。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，在所述制備 方法的步驟（10)中，所述過(guò)濾除菌的濾膜依次為0. 8iim、0. 45iim和0. 22iim的聚偏二氟 乙火布月旲。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的凝血酶的制備方法，其特征在于，所述凝血酶 的制備方法包括以下步驟： (1) 在20〒2°C下，分別經(jīng)70目、100目、200目濾網(wǎng)過(guò)濾除去經(jīng)過(guò)抗凝預(yù)處理豬血漿 中的雜質(zhì)； (2) 向步驟（1)得到的過(guò)濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，在24°C下進(jìn)行病毒滅活處理 4-6小時(shí)；所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和重量比濃度為1%的 吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3 %的磷酸三丁酯和體積比濃度為1 %的Triton X-100的水溶液； (3) 在20±2°C下，向步驟（2)得到的經(jīng)病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，攪拌45分 鐘后靜置30分鐘以吸附凝血酶原，經(jīng)200目濾布過(guò)濾后抽濾；所述吸附劑與血漿的質(zhì)量比 為 1. 5 :1000， (4) 以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到的吸 附凝血酶原的吸附劑；所述洗滌用溶液與血漿的比為160毫升：1000克； (5) 在室溫下，將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡于包含117克/升氯化 鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中30分鐘，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫升： 1000克；再將吸附劑浸泡于包含117克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中20分 鐘，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為15毫升：1000克，合并兩次的濾液； (6) 在0-4°C下，將步驟（5)得到的濾液置于2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進(jìn)行透 析5-5. 5小時(shí)；所述透析用溶液與血漿的比為3000毫升：1000克； (7) 將步驟（6)得到的經(jīng)透析的溶液加熱至33-36°C，加入體積比為7%的溶液A，5分 鐘后再加入體積比為7 %的溶液B和體積比為7 %的溶液C，攪拌15分鐘后4°C下靜置1小 時(shí)；其中，所述溶液A為以35克/升的濃度將氯化鈣溶于9克/升的NaCl水溶液，并經(jīng)加 熱攪拌后離心得到的上清液；溶液B為向步驟（6)得到的經(jīng)透析溶液加入體積比為7%的 溶液A并攪拌后，加入體積比為7 %的1摩爾/升的氯化鈣水溶液制得的溶液；溶液C為1 摩爾/升的氯化鈣水溶液； (8) 采用1摩爾/升冰醋酸水溶液將步驟（7)得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至5. 2-5. 6,在4°C 下靜置30-45分鐘后以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-20分鐘，采用飽和碳酸氫鈉溶液將上清液的 pH調(diào)節(jié)至6. 0-6. 5,在4°C下靜置30-45分鐘后以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15-20分鐘； (9) 將步驟（8)得到的上清液以0. 4Mpa的壓力、0. 03?20升/分鐘的流速通過(guò)膜吸 附器后，先用濃度為〇? 15mol/L NaCl水溶液洗滌，再用濃度為0? 25mol/L NaCl水溶液洗脫 得到洗脫液； (10) 將步驟（9)得到的洗脫液pH控制為2-13,在5-45°C的溫度和不大于0. 3Mpa壓力 下先經(jīng)截留分子量為150K的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜過(guò)濾，再在5-45°C的溫度和不大 于0. 12Mpa壓力下經(jīng)截留分子量為10K的中空纖維聚砜超濾膜過(guò)濾，并濃縮濾液； (11) 將步驟（9)得到的濾液依次經(jīng)孔徑為0. 8 ii m、0. 45 ii m和0. 22 ii m的聚偏二氟乙 烯膜過(guò)濾除菌，然后經(jīng)孔徑為0. 1 U m的濾膜預(yù)過(guò)濾，再以200 ± lOKPa的過(guò)濾壓力經(jīng)孔徑為 20nm的濾器過(guò)濾除病毒； (12) 將步驟（11)得到溶液與藥學(xué)上可接受的輔料混合，經(jīng)凍干制成凍干制劑。
【文檔編號(hào)】C12N9/74GK104328101SQ201410591661
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】邵春杰 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春遠(yuǎn)大國(guó)奧制藥有限公司