鑒別鼓槌石斛和球花石斛的分子特異性標(biāo)記引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒別鼓槌石斛和球花石斛的分子特異性標(biāo)記引物及方法。用于鑒別鼓槌石斛 D.chrysotoxum 和球花石斛 D.thyrsiflorum 的分子特異性標(biāo)記引物的上游引物GCF：如SEQIDNO.1所示；下游引物GCR：如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明利用分子特異性標(biāo)記引物GCF/GCR，通過常規(guī)PCR方法可對兩個相似物種鼓槌石斛 D.chrysotoxum 和球花石斛 D.thyrsiflorum 進(jìn)行快速的分子鑒定，方法簡單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，時間短，半日即可完成，是形態(tài)特征辨別鼓槌石斛 D.chrysotoxum 和球花石斛 D.thyrsiflorum 的有效輔助。
【專利說明】鑒別鼓槌石斛和球花石斛的分子特異性標(biāo)記引物及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒別鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum和球花石斛 D. thyrsifIorum的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該特異性引物對鼓槌石斛和球花石 斛標(biāo)本快速鑒別的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 鼓植石斛Dendrobium chrysotoxum和球花石斛D. thyrsif Iorum均隸屬于蘭科 (Orchidaceae)石斛屬 Dendrobium下的頂葉組（Sect. Chrysotoxae Kraenzl.)。二者是中 國傳統(tǒng)名貴藥材，具有滋陰養(yǎng)胃、潤肺止咳、清熱明目之功效，另外，還有增強人體免疫力， 消除腫瘤，抑制癌癥等作用。其中鼓槌石斛D. chrysotoxum被中華人民共和國藥典（2010 版）收錄，并列為重點保護(hù)的野生珍貴藥材品種。鼓槌石斛和球花石斛的莖、葉型、花型和 花色都非常相似，從形態(tài)學(xué)上很難將二者相似種輕易鑒別開。因而在過去的很多年里，將 鼓槌石斛D. chrysotoxum錯誤鑒定為球花石斛D. thyrsif Iorum的情況時有發(fā)生。事實上， D. chrysotoxum與D. thyrsif Iorum并非同種，這一結(jié)論已經(jīng)得到了分子數(shù)據(jù)的支持。
[0003] 對D. chrysotoxum和D. thyrsif Iorum這兩個相似種辨別的主要特征是宏觀上差 異并不是很顯著的莖的形狀。但是由于二者莖的形狀易受生境、氣候、生理狀況等的影響而 常常導(dǎo)致主觀辨別上的偏差，而對長期保存的標(biāo)本，特別是對古老標(biāo)本、模式標(biāo)本的重新鑒 另IJ，僅靠莖的形狀差異更是難以準(zhǔn)確鑒定。因此，在石斛分類研究上，分子標(biāo)記技術(shù)成為了 對石斛樣本輔助鑒別的重要手段。
[0004] 真核生物的核糖體基因 rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS)的保守性非常強。種內(nèi)ITS序列相對一致，而種間差異比較明顯，這一特點 使得ITS序列不僅適合于屬內(nèi)物種間的系統(tǒng)發(fā)育分析，而且非常適合于植物物種的分子鑒 定。對 D. chrysotoxum 和 D. thyrsif Iorum 的 ITS 區(qū)序列測序結(jié)果顯不，D. chrysotoxum 和 D. thyrsif Iorum的ITS (ITS1-5. 8S-ITS2)序列長度均為641bp。因此，很難利用通用ITS引 物（ITS4/ITS5)的PCR擴(kuò)增、普通電泳對兩個相似種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。通過對兩個相似種的 ITS序列比對分析發(fā)現(xiàn)二者的局部序列存在堿基差異，本研究根據(jù)這一特點，設(shè)計開發(fā)了用 于鑒定鼓槌石斛的ITS特異性引物。本發(fā)明為兩個相似種的分子輔助鑒別提供了可能性， 對有效的鑒別和保護(hù)兩種石斛種質(zhì)資源具有非常重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種可鑒別鼓槌石斛 D. chrysotoxum和球花石斛D. thyrsiflorum的分子特異性標(biāo)記引物。
[0006] 本發(fā)明一種鑒別鼓槌石斛D. chrysotoxum和球花石斛D. thyrsiflorum的分子特 異性標(biāo)記引物，其核苷酸序列如下：
[0007] 上游引物 GCF :5' -CAAGCAGGGGCTAATGCTGCTGC-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示；
[0008] 下游引物 GCR : 5 ' -ATGGATCGACGCATGGTTTGGGA-3 '，如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0009] 此對分子特異性引物是采用普通PCR技術(shù)，經(jīng)過對鼓槌石斛D. chrysotoxum標(biāo)本 和球花石斛D. thyrsif Iorum標(biāo)本的核糖體ITS區(qū)序列的克隆測序，然后對測序獲得的兩個 相似種ITS序列進(jìn)行堿基差異比對，并以此設(shè)計分子特異性引物（GCF/GCR)。上述引物對具 有極高的專一性，用此對引物對D. chrysotoxum和D. thyrsiflorum進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以從 D. chrysotoxum中獲得582bp大小的特異性片段。
[0010] 本發(fā)明還涉及上述開發(fā)的分子特異性引物（GCF/GCR)在鑒別鼓槌石斛 D. chrysotoxum標(biāo)本和球花石斛D. thyrsif Iorum標(biāo)本中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供利用上述分子特異性標(biāo)記引物對鼓槌石斛和球花石 斛進(jìn)行快速鑒別的方法。
[0012] 本發(fā)明采用上述分子特異性標(biāo)記引物（GCF/GCR)作為特異性擴(kuò)增引物，以待測石 斛標(biāo)本基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)582bp 的DNA帶譜，則待測石斛樣本為鼓槌石斛D. chrysotoxum ;若電泳結(jié)果未出現(xiàn)582bp的DNA 帶譜，則待測石斛樣本為球花石斛D. thyrsif lorum。
[0013] 上述方法中擴(kuò)增引物的選擇、基因組DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定，以 及電泳檢測，這些步驟均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。
[0014] 需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物和檢測方法僅適用于鼓槌石斛 D. chrysotoxum和球花石斛D. thyrsif Iorum的鑒別，即待測標(biāo)本是限定為鼓槌石斛 D. chrysotoxum標(biāo)本和球花石斛D. thyrsif Iorum標(biāo)本的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù) 兩個相似種的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步的判斷，再將判斷為D. chrysotoxum或D. thyrsiflorum 的石斛標(biāo)本運用發(fā)明方法進(jìn)行鑒別。
[0015] 鼓槌石斛D. chrysotoxum和球花石斛D. thyrsiflorum在莖、葉形態(tài)特征、花色上 的差異并不顯著，所以在過去的很多年里，將D. chrysotoxum錯誤鑒定為D. thyrsiflorum 的情況時有發(fā)生。對鼓槌石斛D. chrysotoxum和球花石斛D. thyrsiflorum的傳統(tǒng)鑒別方 法主要是通過二者莖性狀的細(xì)微差異，但是形態(tài)學(xué)差異的鑒別具有很強的主觀性，常常會 出現(xiàn)誤判，而且對于干標(biāo)本，特別是久遠(yuǎn)標(biāo)本很難僅僅通過莖的形狀來準(zhǔn)確鑒定。采用本發(fā) 明方法可對相似種鼓槌石斛D. chrysotoxum和球花石斛D. thyrsiflorum進(jìn)行快速的分子 鑒定，方法簡便、準(zhǔn)確、快速，是形態(tài)學(xué)鑒別方法的有效補充。
[0016] 具體的所述方法如下：
[0017] (1)取待測石斛標(biāo)本葉片200mg，加入液氮磨碎成粉末，利用植物基因組DNA提取 試劑盒提取待測石斛的基因組DNA ;
[0018] (2)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物（GCF/GCR) 作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0019] PCR反應(yīng)體系（總體積為25 μ 1)組成為：
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 鑒別鼓槌石斛和球花石斛的分子特異性標(biāo)記引物，其特征在于該引物核苷酸序列 如下： 上游引物 GCF :5' -CAAGCAGGGGCTAATGCTGCTGC-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示； 下游引物 GCR :5' -ATGGATCGACGCATGGITTGGGA-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物在鑒別鼓槌石斛A 和球花 石斛A 中的應(yīng)用。
3. -種利用如權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物進(jìn)行鑒別鼓槌石斛A 和球花石斛A級Frsi/yo/--的方法，其特征在于該方法是首先提取待測石 斛標(biāo)本基因組DNA作為模板，以分子特異性標(biāo)記引物GCF/GCR作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測：若電泳結(jié)果出現(xiàn)582 bp的DNA條帶，則 待測石斛樣本為鼓槌石斛A ;若電泳結(jié)果未出現(xiàn)582 bp的DNA條帶，則待測 石斛樣本為球花石斛及級
4. 如權(quán)利要求3所述的利用如權(quán)利要求1所述分子特異性標(biāo)記引物進(jìn)行鑒別鼓槌石斛 A 腫和球花石斛A級Frsi/yo/--的方法，其特征在于所述的分子特異性標(biāo)記 引物GCF/GCR，其核苷酸序列如下： 上游引物 GCF :5' -CAAGCAGGGGCTAATGCTGCTGC-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示； 下游引物 GCR :5' -ATGGATCGACGCATGGITTGGGA-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示如權(quán)利要求 3 所述的利用如權(quán)利要求1所述分子特異性標(biāo)記引物進(jìn)行鑒別鼓槌石斛A 和 球花石斛A 腫的方法，其特征在于該方法僅適用于待測標(biāo)本為鼓槌石斛A cA/yso 標(biāo)本和球花石斛A 標(biāo)本。
5. 如權(quán)利要求3所述的利用如權(quán)利要求1所述分子特異性標(biāo)記引物進(jìn)行鑒別鼓槌石斛 D. 腫和球花石斛A 的方法，其特征在于PCR反應(yīng)程序為：94°C 預(yù)變性5 min;94°C變性50 s，61°C退火50 s，72°C延伸1.5 min，35個循環(huán)；最后于72°C下 延伸10 min。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313162SQ201410593364
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】王慧中, 馮尚國, 史鈺軍, 何仁鋒, 陳喆 申請人:杭州師范大學(xué)