一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯(lián)用的固定化漆酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯(lián)用的固定化漆酶及其制備方法。該固定化漆酶的制備過(guò)程包括：首先利用酸酐對(duì)漆酶進(jìn)行修飾，然后用海藻酸對(duì)修飾化后的漆酶進(jìn)行包埋，得到固定化漆酶。本工藝所制備的固定化漆酶可對(duì)廢水中2，4-二氯苯酚進(jìn)行去除。本發(fā)明方法拓寬了漆酶的pH、溫度適用范圍，增加了重復(fù)使用次數(shù)。在廢水處理方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯(lián)用的固定化漆酶及其制備方 法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶固定化及環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域。具體涉及一種經(jīng)酸酐修飾和海藻酸包埋聯(lián) 用的固定化漆酶及制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 酶的固定化研究始于20世紀(jì)60年代，是指將水溶性的游離酶通過(guò)物理或者化學(xué) 方法將其連接在一定的固相載體上，使其成為固定化酶。固定化酶在一定程度上彌補(bǔ)了上 述游離酶不容易重復(fù)使用、成本高的不足，增加了酶的實(shí)際應(yīng)用性。酶的固定化方法主要 有：吸附法、包埋法、離子交換法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法等。遺憾的是，單一的固定化技術(shù)目前 在提高酶的耐用性方面仍然存在很多局限性。例如，包埋法操作簡(jiǎn)單、酶活性損失小、酶包 埋量大且固定化效率高，較適用于底物為小分子的酶的固定化。
[0003] 漆酶（Laccase)是一類(lèi)含多個(gè)銅離子的多酚氧化酶。在氧氣存在的條件下，漆酶 可以催化氧化多種底物，如酚類(lèi)、芳香胺類(lèi)、留體、金屬有機(jī)物等物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境 修復(fù)、造紙工業(yè)、能源領(lǐng)域、食品工業(yè)、生物檢測(cè)等方面。例如，氯酚類(lèi)物質(zhì)2,4_二氯苯酚 (DCP)是一種合成多種溶劑、醫(yī)藥和農(nóng)藥的中間體，難降解，易揮發(fā)，有較強(qiáng)的腐蝕性。目前 DCP的去除主要有光降解、吸附、氧化還原、生物降解等方法。使用漆酶催化的生物降解DCP 具有操作簡(jiǎn)單、條件溫和、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，受到了人們的重視。
[0004] 根據(jù)漆酶來(lái)源的不同以及底物的不同，漆酶活性的最適pH差異較大。另一方面， 不同來(lái)源的工業(yè)廢水PH差異也很大。由于目前工業(yè)上漆酶的主要來(lái)源為漆樹(shù)漆酶和真菌 漆酶兩大類(lèi)，這兩類(lèi)漆酶的最適PH多在3?5,工業(yè)廢水達(dá)標(biāo)排放標(biāo)準(zhǔn)pH值在6?9。這 些特性促使研究者開(kāi)發(fā)新技術(shù)以拓寬漆酶的PH適用范圍。文獻(xiàn)報(bào)道漆酶用丁二酸酐修飾 之后最適pH 向喊性偏移[Chinese Journal ofCatalysis 2011,32(10) :1584-1591];漆酶 經(jīng)鄰苯二甲酸酐修飾后，pH適用范圍得到拓寬[中國(guó)科技論文在線(xiàn)，2007,2:870-874]。然 而，僅通過(guò)酸酐化學(xué)修飾漆酶仍然存在難以回收利用、不利于節(jié)約成本等不足。
[0005] 此外，文獻(xiàn)報(bào)道了單一海藻酸包埋來(lái)源放線(xiàn)菌的漆酶可以用于苯酚的降解， 重復(fù)使用次數(shù)可以達(dá)到8次，主要用于造紙堿性廢水的處理[World J Microbiol. Biotechnol. 2008,24 :1215-1222]。然而，由于海藻酸微球本身在堿性溶液中極易解離溶 解，該方法為了克服這個(gè)問(wèn)題使用了銅離子交聯(lián)的海藻酸微球增強(qiáng)海藻酸微球的耐用性， 但也導(dǎo)致了銅的二次污染。因此，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性更高（pH和溫度適用范圍更寬）、便于重復(fù)利 用的漆酶固定化技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。將化學(xué)修飾與物理包埋聯(lián)用的固定化技術(shù)通過(guò) 多重技術(shù)的互補(bǔ)結(jié)合，有可能彌補(bǔ)單一固定化技術(shù)的不足，有效提高酶的穩(wěn)定性和循環(huán)使 用性能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種化學(xué)修飾與物理包埋聯(lián)用的固定化漆酶及其制備方法。 具體涉及一種經(jīng)酸酐修飾和海藻酸包埋聯(lián)用的固定化漆酶及制備方法。
[0007] 本發(fā)明中，漆酶可以為漆樹(shù)漆酶或平菇漆酶，酸酐可以為丁二酸酐、馬來(lái)酸酐或鄰 苯二甲酸酐。本發(fā)明制備固定化漆酶方法簡(jiǎn)單，只需兩步：（1)利用酸酐修飾漆酶，得到羧 基化漆酶；（2)將步驟（1)所得的羧基化漆酶溶液與海藻酸鈉溶液混合，滴入CaCl 2溶液中 進(jìn)行交聯(lián)，獲得固定化漆酶微球。
[0008] 上述方法的步驟（1)中，漆酶分子上的氨基與酸酐發(fā)生反應(yīng)，制得羧基化漆酶。控 制漆酶溶液濃度為〇. 5?50mg/mL，酸酐溶液濃度為5?500mM，反應(yīng)時(shí)間為IOmin?24h。 為了盡量減少反應(yīng)中的酶活損失，反應(yīng)體系采用冰?。粸榱思涌旆磻?yīng)速度，采用磁力攪拌； 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為lh。反應(yīng)結(jié)束后，利用pH為4. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液在4°C下對(duì)產(chǎn)物 進(jìn)行透析，除去未反應(yīng)的酸酐分子。
[0009] 所述步驟（2)中，用海藻酸對(duì)第一步制備的羧基化漆酶進(jìn)行包埋固定化。羧基化 漆酶與海藻酸鈉混合均勻，所使用海藻酸鈉濃度優(yōu)選為2. 5%，羧基化漆酶和海藻酸鈉的體 積比為1 : 2,混合液于4°C下靜置2?3h，待到混合液無(wú)氣泡后，用注射器將混合液滴入 CaCl2溶液中。所用CaCl2溶液的濃度優(yōu)選為3%。鈣離子與海藻酸分子上的羧基、漆酶分 子上修飾的羧基具有強(qiáng)的絡(luò)合作用，不僅能生成不溶于水的海藻酸鈣微球，還能更大程度 上有效包埋酶。研究發(fā)現(xiàn)，丁二酸酐修飾固定化漆酶微球的酶包埋率約為90%，未修飾微球 的包埋率約為85%。鈣離子交聯(lián)的海藻酸微球還能保證所制備的固定化漆酶微球有良好的 機(jī)械性能，不會(huì)出現(xiàn)酶泄露情況。在優(yōu)化條件下所制備的固定化漆酶微球直徑約為3mm。
[0010] 本發(fā)明固定化漆酶的制備原理滿(mǎn)足以下三點(diǎn)：第一，漆酶經(jīng)酸酐修飾后，漆酶分子 上帶有較多的羧基，由于羧基與鈣離子有較好的絡(luò)合作用，從而能夠有較多包埋在鈣離子 交聯(lián)的海藻酸微球中；第二，漆酶經(jīng)酸酐修飾后羧基含量的大大增加，保證漆酶的最適PH 值向堿性偏移；第三，由于鈣離子能夠同時(shí)絡(luò)合羧基化漆酶和海藻酸，提高了海藻酸在中性 PH下的穩(wěn)定性，從而固定化酶的耐用性和重復(fù)使用次數(shù)得到提高。
[0011] 從上述操作步驟可知，本發(fā)明技術(shù)條件溫和，不涉及苛刻的反應(yīng)條件如高溫高壓 等，有利于保持酶的構(gòu)象，不損失酶的活力。研究發(fā)現(xiàn)丁二酸酐修飾后漆酶酶活回收率約為 未修飾游離漆酶的1. 5倍，丁二酸酐修飾固定化漆酶的酶活回收率約為未修飾固定化漆酶 2?3倍。游離漆酶的pH和溫度適用范圍一般為pH 3?5, 30?40°C。利用本發(fā)明制備 的固定化漆酶有較寬的pH和溫度適用范圍，在pH 3?7、20?60°C范圍內(nèi)均有較高的活 性。
[0012] 氯酚類(lèi)物質(zhì)是廢水中一類(lèi)難降解的污染物。利用本發(fā)明的固定化漆酶微球?qū)CP 進(jìn)行降解，降解性能主要體現(xiàn)在PH近中性條件下具有較好的循環(huán)使用性能。由于pH過(guò)高 會(huì)使微球溶解，使用此固定化漆酶時(shí)將pH控制在6左右。從圖3可以看出，丁二酸酐修飾 的固定化漆酶微球在PH 6進(jìn)行DCP降解，循環(huán)使用12次之后，降解率仍達(dá)到30%以上，去 除DCP性能優(yōu)于其它對(duì)照體系。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1)制備工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，不引入二次污染；2)所制備的固 定化漆酶最適pH由酸性向堿性方向偏移，pH適用范圍拓寬；3)所制備的固定化漆酶溫度適 用范圍拓寬；4)在pH 6下用于去除DCP，滿(mǎn)足較理想的重復(fù)使用次數(shù)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為實(shí)施例1中pH對(duì)游離漆樹(shù)漆酶、丁二酸酐修飾漆酶、固定化漆酶活性的影 響
[0015] 圖2為實(shí)施例1溫度對(duì)游離漆樹(shù)漆酶、丁二酸酐修飾漆酶、固定化漆酶活性的影響
[0016] 圖3為實(shí)施例3中游離平菇漆酶和修飾平菇漆酶經(jīng)固定化后DCP降解實(shí)驗(yàn)

【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0018] 本發(fā)明中所用漆樹(shù)漆酶（來(lái)源Rhus vernicifera)購(gòu)自Sigma-Aldrich ;
[0019] 平燕漆酶（來(lái)源 Pleurotus ostreatus)購(gòu)自 Sigma-Aldrich ;
[0020] 測(cè)定漆酶酶活的方法為2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2， 2' -Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6_sulphonate), ABTS)法。
[0021] 下述實(shí)施案例中，未修飾漆酶、被丁二酸酐（馬來(lái)酸酐或鄰苯二甲酸酐）修飾 的漆酶、未修飾的固定化漆酶、被修飾的固定化漆酶以下分別用Lac、Lac-SA(Lac-MA或 Lac-PA)、LacOALG、Lac-SAOALG (Lac-MAOALG 或 Lac-PAOALG)表示。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] DLac-SA的制備：取0. Olg漆樹(shù)漆酶于IOmL pH 7. 4磷酸鹽緩沖溶液中，4°C下溶 解Ih后，在4°C、9000rpm下離心5min，得到漆酶溶液。取0. Olg 丁二酸酐（SA)溶于50mLpH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，得到2mM SA溶液。將漆酶溶液置于冰浴中，磁力攪拌下緩慢加入 IOmL SA溶液，反應(yīng)lh。將反應(yīng)后的溶液裝于透析袋（截留分子量為3500)中，4°C下于醋 酸緩沖溶液中透析過(guò)夜，得到Lac-SA溶液。修飾率約為50%。
[0024] 2) Lac-SAOALG的制備：稱(chēng)取3g CaCl2溶于IOOmL水中，得到3% CaCl2溶液。稱(chēng)取 1.58海藻酸鈉溶于6〇1^蒸餾水中，得到2.5%海藻酸鈉。將1〇1^1^^4與2〇11^2.5%海 藻酸鈉混合均勻，置于4°C冰箱中，當(dāng)混合液中無(wú)氣泡時(shí)方可進(jìn)行下一步包埋。將Lac-SA與 海藻酸鈉的混合液用注射器滴入3% CaCl2溶液中，4°C下交聯(lián)2h，得到Lac-SAOALG微球。
[0025] 3) LacOALG的制備：與Lac-SAOALG的制備方法相同，僅將Lac-SA溶液換為L(zhǎng)ac溶 液。
[0026] 4)以ABTS為底物測(cè)定漆酶活性。以37°C下420nm處每分鐘生成1 μ mol底物作 為一個(gè)酶活力單位。
[0027] 效果評(píng)價(jià)：
[0028] I. pH值適用范圍
[0029] 不同pH下測(cè)得相對(duì)酶活見(jiàn)圖1，其中相對(duì)酶活是指不同pH條件下酶活，相對(duì)最適 pH下酶活的百分比。結(jié)果表明，游離Lac最適pH為4. 5,隨著pH的增加，活性迅速減小，當(dāng) pH增大到7時(shí)，相對(duì)酶活僅為10%左右；Lac-SA最適pH偏移到6,當(dāng)pH增大到7時(shí)，相對(duì) 酶活仍有80 %左右；LacOALG最適pH約為3. 5,隨著pH的增加相對(duì)酶活逐漸減小，當(dāng)pH增 加到7. 0時(shí)，相對(duì)酶活為60 %左右；Lac-SAOALG最適pH向堿性方向偏移到了 6. 4,當(dāng)pH為 7. 0時(shí)，相對(duì)酶活仍有約87 %。
[0030] 溫度適用范圍
[0031] 不同溫度下測(cè)得相對(duì)酶活見(jiàn)圖2,其中相對(duì)酶活是指以各自條件下的酶活與最適 溫度下酶活的百分比。結(jié)果表明，Lac、Lac-SA的最適溫度均為35°C，LacOALG、Lac-SAOALG 的最適溫度為45°C。Lac、Lac-SA隨著溫度的增加，酶活降低明顯，Lac@ALG、Lac-SA@ALG活 性隨溫度改變沒(méi)有太大變化。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 按照實(shí)施方案1的步驟，僅將原料中的丁二酸酐替換成馬來(lái)酸酐或鄰苯二甲酸 酐?；?qū)⑵針?shù)漆酶替換成平菇漆酶。以ABTS法對(duì)漆酶的催化活性進(jìn)行測(cè)定，效果評(píng)價(jià)總結(jié) 為表1。
[0034] 表1酸酐修飾與海藻酸包埋聯(lián)用固定化漆酶的性能結(jié)果
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種酸酐修飾與海藻酸包埋聯(lián)用的固定化漆酶及其制備方法，其特征在于化學(xué)修飾 與物理包埋的聯(lián)用，包括以下兩個(gè)步驟：（1)化學(xué)修飾是指酸酐與漆酶分子上的氨基在緩 沖溶液中反應(yīng)，制備羧基化漆酶；（2)物理包埋是將羧基化漆酶與海藻酸鈉溶液混合，然后 逐滴滴入CaC12溶液進(jìn)行交聯(lián)得到所述固定化漆酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中漆酶具體來(lái)自漆樹(shù)和 平菇，所述酸酐為丁二酸酐、馬來(lái)酸酐、鄰苯二甲酸酐中的至少一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述步驟（1)的方法，其特征在于：漆酶溶液濃度為0. 5?50mg/ mL，酸酐溶液濃度為5?500mM，反應(yīng)時(shí)間為IOmin?24h，反應(yīng)溫度為0?40°C ;所述緩沖 溶液的pH為3.0?8.0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于步驟（2)中所述物理包埋條件是羧基化 漆酶濃度為〇. 1?5. Omg/mL，海藻酸鈉的濃度為1 %?5 %，CaCl2的濃度為1 %?5 %。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化漆酶形態(tài)為水凝膠微球，微球直徑范圍為Imm? 10mnin
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，制備的固定化漆酶微球可直接用于廢水中2,4_二氯苯酚的降 解。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述，固定化漆酶微球?qū)?,4-二氯苯酚的降解在pH4?6溶液中進(jìn) 行。
【文檔編號(hào)】C12N9/96GK104313006SQ201410594454
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】李娟 , 劉芳, 劉又年, 陳倩, 孫曉毅 申請(qǐng)人:中南大學(xué)