登革出血熱病毒ii型核酸分子特征標準樣品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品的制備方法，通過序列的合成、克隆載體、目的片段和載體的連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以及重組質(zhì)粒的提取、凍干保存等步驟制得登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品，本發(fā)明制備出一種包含病毒特征序列信息、適于分析樣品中該病毒及含量水平的標準樣品；本發(fā)明提供的標準樣品均勻性好、穩(wěn)定性強、可長期保存、純度好，并且制備方法過程簡單，可以為登革出血熱病毒II型檢測研究、醫(yī)用研究等提供標準樣品，以實現(xiàn)不同實驗室結(jié)果比對，從而保證實驗室的質(zhì)量控制；同時也為檢驗檢疫機構(gòu)、進出口貿(mào)易等企業(yè)實現(xiàn)對登革出血熱病毒II型的快速準確檢測提供了標準樣品。
【專利說明】登革出血熱病毒丨丨型核酸分子特征標準樣品及其制備方 法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品及其制備方法，屬 于分子生物學領域。

【背景技術】
[0002] 登革熱廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種分布廣、發(fā)病多、危害較大的人類傳 染病。在亞洲，太平洋群島及中、南美洲等許多國家均已造成嚴重的威脅。第二次世界大戰(zhàn) 后，在日本也曾有過流行。近年，在亞洲、非洲和南美洲的熱帶以及亞熱帶地區(qū)登革病毒感 染的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。我國于1978年在廣東佛山首次發(fā)現(xiàn)本病，以后在海南島及廣 西等地均有發(fā)現(xiàn)。
[0003] 目前，登革出血熱病毒II型的診斷方法主要由病毒分離、瓊脂糖免疫擴散技術、 分子生物學等診斷技術。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，實時熒光PCR技術以其快 速、敏感、特異性好的優(yōu)點占很大優(yōu)勢，引起了眾多研究者的關注，但現(xiàn)有分子生物學檢測 試劑盒多為公司根據(jù)文獻設計陽性對照，沒有統(tǒng)一的標準。隨著進出口貿(mào)易的增大，檢驗流 程時限縮短，難以保證實驗室的質(zhì)量控制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明研制一種登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品，可 用于特征序列檢測時的陽性對照，以保證檢測結(jié)果的可溯源性。具體技術方案如下。
[0005] 本發(fā)明所述登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品的制備方法，主要包括 如下步驟： 1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：并在每段序列前增加一個T7啟動 子； 2) 將合成序列平端克隆入質(zhì)粒并通過酶切鑒定及膠純化； 3) 目的片段和載體的連接反應； 4) 通過感受態(tài)細菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒； 5) 重組質(zhì)粒提?。?6) 采用分光光度計法對重組質(zhì)粒進行質(zhì)量檢測； 7) 選取純度和完整性均合格的重組質(zhì)粒，將溶液混合在一起，并再次測定濃度和純度， 然后進行分裝凍干，將制備好的標準樣品置于_80°C冰箱保存。
[0006] 上述登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品的制備方法所述步驟中還包括 重組質(zhì)粒的鑒定：即從步驟4)得到的菌液中取1-3個菌落，接種于含氨芐的LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，提取質(zhì)粒，然后進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性克隆。
[0007] 上述登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品的制備方法所述步驟中還包括 核酸序列測定及序列對比分析：即將經(jīng)PCR鑒定為陽性重組質(zhì)粒的細菌測序并進行同源性 分析。
[0008] 本發(fā)明所獲得的登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品，即為含有 Sequence NO. 1的核苷酸序列的重組載體。而且所述重組載體為質(zhì)粒。
[0009] 進一步地，上述步驟2)所述克隆和膠純化的具體步驟為：將序列平端克隆入 PUC19質(zhì)粒中；酶切鑒定選擇feoR 1和油<3 I作為質(zhì)粒載體的克隆位點進行酶切，37°C，反 應 l-2h，反應體系為 DNA 16 μ L，IOX buffer 2 μ L，feoRI 1 μ L，ZhI 1 μ L ;酶切產(chǎn)物經(jīng) I %瓊脂糖凝膠電泳，切取所需片段，膠回收純化。
[0010] 進一步地，上述步驟3)所述目的片段和載體的連接反應具體步驟為：條件為 16°C，反應16h，反應體系為：步驟2)得到的純化產(chǎn)物1 μ L，合成序列X μ L :其與載體的 摩爾比為 3?20 :1，T4 Ligase 1 μ L，IOX Ligase solution 1 μ L，加去離子水補齊至 10 μ L。
[0011] 進一步地,上述步驟4)所述感受態(tài)細菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的具體步驟為：將感受態(tài)細菌加 到預冷無菌的Eppendorf管內(nèi)，取步驟3)得到的連接反應液，加到含DH5 α感受態(tài)細菌的 管中，輕混勻，冰上靜置30min，42°C熱激90s，不要搖晃管，冰上靜置5min，加不含氨芐的LB 培養(yǎng)基，37 °C，225rpm，培養(yǎng)Ih得轉(zhuǎn)化液；取轉(zhuǎn)化液涂布于含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 °C 倒置培養(yǎng)16h。
[0012] 本發(fā)明是基于病毒的RNA序列與cDNA序列互補的原理基礎之上，利用DNA合成技 術合成病毒的特征核酸序列，將其克隆入質(zhì)粒載體中，制備出一種包含病毒特征序列信息、 適于分析樣品中該病毒及含量水平的標準樣品；本發(fā)明提供的標準樣品均勻性好、穩(wěn)定性 強、可長期保存、純度好，并且制備方法過程簡單，可以為登革出血熱病毒II型檢測研究、 醫(yī)用研究等提供標準樣品，以實現(xiàn)不同實驗室結(jié)果比對，從而保證實驗室的質(zhì)量控制；同時 也為檢驗檢疫機構(gòu)、進出口貿(mào)易等企業(yè)實現(xiàn)對登革出血熱病毒II型的快速準確檢測提供 了標準樣品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1質(zhì)粒酶切電泳圖，圖2重組質(zhì)粒測序圖，圖3序列比對報告。

【具體實施方式】
[0014] 實驗材料：pUC19質(zhì)粒、瓊脂糖、限制性內(nèi)切酶feoR I和油a I、T4 Ligase試劑 盒、膠純化試劑盒、DH5a菌株、LB培養(yǎng)基購于大連寶生物工程有限公司，Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System 購自 promega 公司。
[0015] 實施例1 :標準樣品的制備 1.合成序列：利用軟件Clone Manager 7.0從GenBank上下載公開發(fā)布的序列，進行 同源性分析和引物匹配，分析確定擬合成的病毒序列：ATG AAT AAC CAA CGA AAA AAG GCG AGA AGT ACG CCT TTC MT ATG CTG AM CGC GAG AGA AAC CGC GTG TCA ACT GTG CAA CAG CTG ACA AAG AGA TTC TCA CTT GGA ATG CTG CM GGA CGC GGA CCA TTA MA CTG TTC ATG GCC CTT GTG GCG TTC CTT CGT TTC CTA ACA ATC CCA CCA ACA GCA GGG ATA CTA MA AGA TGG GGA ACG ATC AAA AAA TCA AAA GCT ATC AAT GTC TTG AGA GGG TTC AGG AA，序列合 成委托公司完成；為便于將病毒核酸序列體外轉(zhuǎn)錄成RNA，在每段序列前增加一個T7啟動 子，序列 20bp : TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG ; 2. 將合成序列平端克隆入pUC19質(zhì)粒并通過酶切鑒定及膠純化：將序列克隆入pUC19 質(zhì)粒中，經(jīng)序列酶切位點分析,選擇AcoR I和油<3 I作為質(zhì)粒載體的克隆位點進行酶切，如 圖1所示，37°C，反應l_2h，反應體系如下：

【權利要求】
1. 登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： 1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO. 1所述：并在每段序列前增加一個17啟動 子； 2) 將合成序列平端克隆入質(zhì)粒并通過酶切鑒定及膠純化； 3) 目的片段和載體的連接反應； 4) 通過感受態(tài)細菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒； 5) 重組質(zhì)粒提取； 6) 采用分光光度計法對重組質(zhì)粒進行質(zhì)量檢測； 7) 選取純度和完整性均合格的重組質(zhì)粒，將溶液混合在一起，并再次測定濃度和純度， 然后進行分裝凍干，將制備好的標準樣品置于_80°C冰箱保存。
2. 根據(jù)權利要求1所述的登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品的制備方法，其 特征在于，所述步驟還包括重組質(zhì)粒的鑒定：從步驟4)得到的菌液中取1-3個菌落，接種于 含氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，篩選 陽性克隆。
3. 根據(jù)權利要求2所述的登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品的制備方法，其 特征在于，所述步驟還包括核酸序列測定及序列對比分析：將經(jīng)PCR鑒定為陽性重組質(zhì)粒 的細菌測序并進行同源性分析。
4. 由權利要求1所述方法制備的登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品，即含有 Sequence NO. 1的核苷酸序列的重組載體。
5. 根據(jù)權利要求4所述的登革出血熱病毒II型核酸分子特征標準樣品，其特征在于， 所述重組載體為質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權利要求1所述的標準樣品的制備方法，其特征在于，步驟2)所述克隆和純化 的具體步驟為：將序列平端克隆入PUC19質(zhì)粒中；酶切鑒定選擇feoR 1和油<3 I作為質(zhì)粒 載體的克隆位點進行酶切，37°C，反應l_2h，反應體系為DNA 16iiL，10X buffer 2iiL，feoR I I lyL;酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切取所需片段，膠回收純化。
7. 根據(jù)權利要求1所述的標準樣品的制備方法，其特征在于，步驟3)所述目的片段和 載體的連接反應具體步驟為：條件為16°C，反應16h，反應體系為：步驟2)得到的純化產(chǎn)物1 yL，合成序列 X iiL:其與載體的摩爾比為 3?20:1，T4 Ligase liiL，10X Ligase solution 1 U L，加去離子水補齊至10 ii L。
8. 根據(jù)權利要求1所述的標準樣品的制備方法，其特征在于，步驟4)所述感受態(tài)細菌 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的具體步驟為：將感受態(tài)細菌加到預冷無菌的Eppendorf管內(nèi)，取步驟3)得到的 連接反應液，加到含DH5 a感受態(tài)細菌的管中，輕混勻，冰上靜置30min，42°C熱激90s，不要 搖晃管，冰上靜置5min，加不含氨芐的LB培養(yǎng)基，37°C，225rpm，培養(yǎng)lh得轉(zhuǎn)化液；取轉(zhuǎn)化 液涂布于含氨節(jié)的LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)16h。
【文檔編號】C12R1/93GK104388585SQ201410597620
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權日:2014年10月30日
【發(fā)明者】李云峰, 薛芳, 龍川鳳, 李黎 申請人:薛芳