一種基于mmLDL上調(diào)腦基底動(dòng)脈的ETB受體的方法
【專利摘要】一種基于mmLDL上調(diào)腦基底動(dòng)脈的ETB受體的方法。將大鼠腦基底動(dòng)脈與mmLDL共培養(yǎng)24小時(shí)，考察信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)，加入相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑。使用肌張力描記儀測(cè)定微血管張力，使用real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果，新鮮腦基底動(dòng)脈環(huán)ETB受體基本不介導(dǎo)收縮，器官培養(yǎng)顯著增加ETB受體介導(dǎo)的收縮，收縮量效曲線左移，同時(shí)Emax達(dá)到88±6％，與10μg/ml mmLDL共培養(yǎng)，引起收縮量效曲線進(jìn)一步左移，Emax達(dá)到116±12％。mmLDL可以通過激活PKC，MAPK和NF-кB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)腦基底動(dòng)脈ETB受體。
【專利說(shuō)明】-種基于mmLDL上調(diào)腦基底動(dòng)脈的ETB受體的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種基于mmLDL上調(diào)腦基底動(dòng)脈的ETB受體 的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 弱氧化低密度脂蛋白（Minimally modified low density lipoprotein，mmLDL)是 腦血管疾病的危險(xiǎn)因子。氧化型低密度脂蛋白（Fully oxidized LDL，oxLDL)是mmLDL進(jìn) 一步氧化的產(chǎn)物。mmLDL和oxLDL誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，促進(jìn)炎癥分子和生 長(zhǎng)因子的表達(dá)。mmLDL可以和細(xì)胞膜上的LDL受體結(jié)合。有研究顯示mmLDL發(fā)揮生物效應(yīng) 與激活受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
[0003] 腦血管內(nèi)皮分泌內(nèi)皮素 (endothelin-1，ET-1)通過激活內(nèi)皮素 A(endothelin type A，ETa)受體和內(nèi)皮素 B(endothelin type B，ETb)受體介導(dǎo)腦血管收縮和增殖。內(nèi)皮 細(xì)胞上ETb受體介導(dǎo)舒張功能。ET b受體可塑性強(qiáng)，在試驗(yàn)性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，?dòng)脈粥樣硬 化病變部位，充血性心衰動(dòng)物模型，蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ?，在器官培養(yǎng)血管發(fā)現(xiàn)激活轉(zhuǎn) 錄，使血管平滑肌上出現(xiàn)了介導(dǎo)血管收縮的ET b受體。
[0004] 蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)家族是包含絲氨酸/蘇氨酸的激酶，參與激 素、神經(jīng)遞質(zhì)及生長(zhǎng)因子刺激誘發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族是另一類含有絲氨酸/蘇氨酸的激酶的家族，在平滑肌 細(xì)胞信號(hào)瀑布級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)時(shí)，位于PKC的下游。MAPK分為3型，ERK1/2 (extracellular signal related kinases I and 2, ERK1/2)型，JNK(C_jun terminal kinase, JNK)型， 及p38 MAPK。MPK將細(xì)胞外信號(hào)傳達(dá)入細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。核轉(zhuǎn)錄因 子-K B(Transcription factor nuclear factor_kappaB，NF-K：B)是下游的轉(zhuǎn)錄因子參與 炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)和表達(dá)。
[0005] 對(duì)腦血管環(huán)的器官培養(yǎng)是一種體外模型，實(shí)驗(yàn)證明器官培養(yǎng)能很好模擬腦血管疾 病時(shí)G-蛋白偶聯(lián)受體的變化，并且器官培養(yǎng)方法利于進(jìn)一步研究受體改變的分子機(jī)制。現(xiàn) 有技術(shù)中對(duì)于mmLDL對(duì)腦基底動(dòng)脈ET b受體的影響機(jī)制尚不清晰，因此，急需一種實(shí)驗(yàn)方 法，來(lái)研究mmLDL是否改變ETb受體介導(dǎo)的收縮功能及受體表達(dá)，同時(shí)觀察涉及的細(xì)胞內(nèi)信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種基于mmLDL上調(diào)腦 基底動(dòng)脈的ETB受體的方法。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0008] -種基于mmLDL上調(diào)腦基底動(dòng)脈的ETB受體的方法。其具體步驟為：
[0009] 步驟一、動(dòng)脈環(huán)的制備及器官培養(yǎng)
[0010] SD大鼠用CO2麻醉，斷頭處死，迅速取出大腦放入冷的碳酸氫鹽緩沖液，取出腦基 底動(dòng)脈，顯微鏡下剝離血管周圍組織，血管內(nèi)插入一根細(xì)線機(jī)械旋轉(zhuǎn)去除內(nèi)皮，將處理好的 血管切成Imm長(zhǎng)的圓環(huán)，當(dāng)乙酰膽堿引起的舒張率< 10%，認(rèn)為內(nèi)皮已被去除，
[0011] 血管環(huán)在24孔板進(jìn)行器官培養(yǎng)，每孔2個(gè)血管環(huán)，每孔加入含100 μ g/ml鏈霉素、 lOOU/ml青霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在37°C，含5% CO2和95% O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，由于器官 培養(yǎng)本身可以在腦基底動(dòng)脈誘發(fā)ETb受體上調(diào)，在考察mmLDL對(duì)ETb受體的作用時(shí)將器官培 養(yǎng)組設(shè)為一個(gè)對(duì)照組，LDL組為另一個(gè)對(duì)照組，預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)X基底動(dòng)脈環(huán)分別與5,10和20 μ g/ mL的mmLDL共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為6,12, 24和48h，預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示1 μ L的DMSO加入ImL的 DMEM不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了考察mmLDL對(duì)ETb受體的作應(yīng)機(jī)制，使用了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異 性拮抗劑，
[0012] PKC 通路拮抗劑選用 0· lyMstaurosporine，ERK1/2 通路拮抗劑為 10yMU0126 和 10 μ MSB386023, U0126 拮抗 MAP 激酶 /ERK 激酶 1/2,即拮抗 MAPKK ;SB386023 拮抗上游 的MAPKKK，特異性的JNK通路拮抗劑為10 μ MSP600125, p38 MPK通路拮抗劑為10 μ M的 SB203580，NF-κ B通路詰抗劑為10 μ M的wedelolactone，每一個(gè)詰抗劑均與mmLDL同時(shí) 加入并共培養(yǎng)24h，然后，血管環(huán)置入浴槽做血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)，如果做RT-PCR或者western blot實(shí)驗(yàn)，血管環(huán)放入液氮冷凍3小時(shí)然后存儲(chǔ)于-80°C冰箱；
[0013] 步驟二、動(dòng)脈環(huán)肌張力實(shí)驗(yàn)
[0014] 將腦基底動(dòng)脈環(huán)套在兩個(gè)L型的金屬針上，其中一個(gè)連接張力換能器，另一個(gè)連 微調(diào)裝置，通過軟件Chart5. 0以及硬件PowerLab 8通道橋式放大器，將血管所負(fù)荷張力 顯示于屏幕，將安裝好的動(dòng)脈環(huán)置入含有5ml Krebs液的37°C Myograph恒溫浴槽，持續(xù)通 入含95 % O2和5 % CO2的混合氣體，pH保持7. 4,實(shí)驗(yàn)前，腦基底動(dòng)脈環(huán)靜息負(fù)荷I. 5mN，每 20min換液一次，穩(wěn)定lh，以含K+63. 5mM的K+-Krebs液檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮性，兩次收縮高度大 于ImN且收縮幅度相差< 10%者用于實(shí)驗(yàn)，
[0015] 在浴槽中濃度累加法加入KTkiM-KT7M的S6c，選擇性激動(dòng)ET b受體，可以得到ETb 受體介導(dǎo)的量效曲線；
[0016] 步驟三、實(shí)時(shí)定量PCR
[0017] 總的RNA提取使用RNAfast200試劑盒，按照使用說(shuō)明書提取，提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄 成cDNA使用GeneAmp RNA PCR試劑盒，按照說(shuō)明書在Perkin-Elmer公司的DNA熱循環(huán)儀 完成，RT-PCR在GeneAmp5700擴(kuò)增儀中進(jìn)行，使用基因擴(kuò)增的SYBR Green試劑盒，以cDNA 為模版，設(shè)立對(duì)照組，除不加 cDNA外，余平行操作，
[0018] 受體的特異性引物根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用引物表達(dá)-2軟件設(shè)計(jì)，大鼠 ETb受體特異 性引物，基因庫(kù)編號(hào)NM_〇17333,設(shè)計(jì)如下：
[0019] 前引物：5' -TGACGCCACCCACTAAGACC-3'
[0020] 后引物：5，-GGCACGGAGGAGGGAAGG-3，
[0021] Beta-actin mRNA為官家基因，引物設(shè)計(jì)如下：
[0022] 前引物：5，-ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3，
[0023] 后引物：5' -CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-S'
[0024] 步驟四、Western blotting
[0025] 實(shí)驗(yàn)時(shí)取出存于_80°C冰箱的腦基底動(dòng)脈，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞提取變 性緩沖液RIPA裂解液，勻漿，使用BCA蛋白分析試劑盒蛋白定量，使用SDS-PAGE凝膠分離， 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗為I : 100稀釋的兔抗大鼠 ETb受體抗體， 和1 : 500稀釋的小鼠抗大鼠 β-actin抗體，稀釋液為含2%牛血清白蛋白的PBS ;二抗為 辣根過氧化物酶標(biāo)記的1 : 2000稀釋的抗兔IgG和1 : 2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記 的抗小鼠 IgG,圖像經(jīng)Image Gauge Ver. 4. 0,對(duì)光密度進(jìn)行分析。
[0026] 進(jìn)一步的，所述步驟二中，K+-Krebs 液組成為 mM :NaCl 60、NaHCO3 15、KCl 63. 5、 MgCl2 1. 2、NaH2PO4 1. 2、CaCl2L 5 和葡萄糖 5. 5 ;
[0027] 進(jìn)一步的，所述步驟三中，PCR反應(yīng)體系為：25yL，開始在95°C lmin，95°C反應(yīng) 15s，60°C反應(yīng)15秒，72°C反應(yīng)45s，完成40個(gè)PCR循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后采用分離曲線分析法以 確定PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性；
[0028] 進(jìn)一步的，所述步驟四中，所述細(xì)胞提取變性緩沖液RIPA裂解液包括0. 5M Tris-HCl，pH 7.4,1.5M NaCl，2.5% deoxycholic acid，10% NP-40, IOmM EDTA。
[0029] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明公開了一種基于弱氧化低密度脂 蛋白上調(diào)腦基底動(dòng)脈的ET b受體的方法。將大鼠腦基底動(dòng)脈與mmLDL共培養(yǎng)24小時(shí)，考察 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)，加入相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑。使用肌張力描記儀測(cè)定微血管張力，使 用real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果顯示，新鮮腦基 底動(dòng)脈環(huán)ETb受體基本不介導(dǎo)收縮，器官培養(yǎng)顯著增加 ETb受體介導(dǎo)的收縮，收縮量效曲線 左移，同時(shí)Emax達(dá)到88 ±6 %，與10 μ g/ml mmLDL共培養(yǎng)，引起收縮量效曲線進(jìn)一步左移，同 時(shí)Emax顯著增高，達(dá)到116 ±12 %。器官培養(yǎng)也顯著增加了基底動(dòng)脈ETb受體mRNA水平和蛋 白表達(dá)水平，與mmLDL共培養(yǎng)，ET b受體mRNA水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加。PKC通路拮 抗劑，ERK 1/2通路拮抗劑及NF- κ B通路拮抗劑基本上完全抑制了器官培養(yǎng)及由mmLDL培 養(yǎng)引起的ETb受體介導(dǎo)的收縮功能增強(qiáng)，受體表達(dá)增高。JNK通路拮抗劑及p38通路拮抗劑 部分抑制了器官培及由mmLDL培養(yǎng)引起的ET b受體上調(diào)，同時(shí)抑制mmLDL誘導(dǎo)的ETb受體上 調(diào)更為明顯。mmLDL可以通過激活PKC，MAPK和NF- κ B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)腦基底動(dòng)脈ETb 受體。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖I. mmLDL共培養(yǎng)增強(qiáng)S6c在去內(nèi)皮腦基底動(dòng)脈環(huán)誘導(dǎo)的收縮功能。其中
[0031] A :不同濃度的mmLDL共培養(yǎng)24h時(shí)引起S6c在誘導(dǎo)的收縮量效曲線圖；
[0032] B :濃度為10μ g/mL的mmLDL共培養(yǎng)不同時(shí)間引起S6c在誘導(dǎo)的收縮量效曲線圖；
[0033] C :mmLDL和LDL分別與去內(nèi)皮腦基底動(dòng)脈環(huán)共培養(yǎng)對(duì)S6c誘導(dǎo)收縮功能的影響。 數(shù)據(jù)表示為 mean土SEM，n = 8, *P < 0· 05,林P < 0· 01 與 mmLDL (10 μ g/mL)共培養(yǎng) 24h 比 較，#P < 0. 05, ##P < 0. 01與單純器官培養(yǎng)24h比較。
[0034] 圖2. ERK1/2通路拮抗劑（A，B)、JNK通路拮抗劑（C)、p38通路拮抗劑（D)、PKC通 路拮抗劑（E)和NF-κ B通路拮抗劑（F)抑制mmLDL引起S6c在腦基底動(dòng)脈環(huán)收縮功能增 強(qiáng)作用。數(shù)值表示為mean土SEM，n = 8 ;*P < 0· 05，#P < 0· 01與mmLDL共培養(yǎng)24h比較， #P < 0. 05, ##P < 0. 01 與 24h 共培養(yǎng)比較。
[0035] 圖 3. ERK1/2 通路拮抗劑 SB386023，U0126 JNK 通路拮抗劑 SP600125 ;p38 通路拮 抗劑SB203580 ;PKC通路拮抗劑staurosporine和NF- κ B通路拮抗劑wedelolactone抑制 mmLDL引起ETB受體在腦基底動(dòng)脈mRNA水平增高作用示圖。數(shù)值通過RT-PCR獲得，表示 為 mean土SEM，n = 5-6 ;*P < 0· 05,林P < 0· Ol 與 mmLDL 共培養(yǎng) 24h 比較，#P < 0· 05，##P <0.01與24h共培養(yǎng)比較。
[0036] 圖4A使用Western blot方法檢測(cè)腦基底動(dòng)脈ETb受體在單純器官培養(yǎng)組，mmLDL 共培養(yǎng)組，及加拮抗劑組的蛋白水平凝膠電泳圖。
[0037] 圖 4B. ERK1/2 通路拮抗劑 SB386023, U0126 JNK 通路拮抗劑 SP600125 ;p38 通路 拮抗劑SB203580 ;PKC通路拮抗劑staurosporine和NF- κ B通路拮抗劑wedelolactone抑 制mmLDL引起ETB受體在腦基底動(dòng)脈蛋白表達(dá)增高作用示圖。數(shù)值通過western blot獲 得，表示為 mean土SEM，n = 3-4 ;林P < 0· 01 與 mmLDL 共培養(yǎng) 24h 比較，##P < 0· 01 與 24h 共培養(yǎng)比較。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述，
[0039] 試驗(yàn)例：
[0040] 材料和方法
[0041] 動(dòng)脈環(huán)的制備及器官培養(yǎng)
[0042] SD大鼠，體重300_350g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。大鼠用CO2麻醉，斷 頭處死。迅速取出大腦放入冷的碳酸氫鹽緩沖液，取出腦基底動(dòng)脈，顯微鏡下剝離血管周圍 組織，血管內(nèi)插入一根細(xì)線機(jī)械旋轉(zhuǎn)去除內(nèi)皮，將處理好的血管切成Imm長(zhǎng)的圓環(huán)，當(dāng)乙酰 膽堿（acetylcholine, ACh)引起的舒張率< 10%，認(rèn)為內(nèi)皮已被去除。
[0043] 血管環(huán)在24孔板進(jìn)行器官培養(yǎng)，每孔2個(gè)血管環(huán)，每孔加入培養(yǎng)液（含100 μ g/ ml鏈霉素、100U/ml青霉素）培養(yǎng)24h，在37°C，含5% CO2和95% O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。由 于器官培養(yǎng)本身可以在腦基底動(dòng)脈誘發(fā)ETb受體上調(diào)，在考察mmLDL對(duì)ET b受體的作用時(shí)將 器官培養(yǎng)組設(shè)為一個(gè)對(duì)照組。LDL組為另一個(gè)對(duì)照組。預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)X基底動(dòng)脈環(huán)分別與5,10和 20 μ g/mL的mmLDL共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為6,12, 24和48h。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示1 μ L的DMSO加 入ImL的DMEM不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了考察mmLDL對(duì)ETB受體的作應(yīng)機(jī)制，使用了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路的特異性拮抗劑。
[0044] PKC 通路拮抗劑選用 staurosporine (0· 1 μ M) [2°'21]。ERK1/2 通路拮抗劑為 υ〇126(10μΜ)[18，Μ]和 SB386023(10yM)[18]，U0126 拮抗 MAP 激酶/ERK 激酶（ΜΕΚ)1/2,即 拮抗MAPKK ;SB386023拮抗上游的ΜΑΡΚΚΚ。特異性的JNK通路拮抗劑為SP600125 (10 μ Μ) [22'23]，p38 MAPK 通路拮抗劑為 SB203580(10yM)[24'25]。NF-κΒ 通路拮抗劑為 wedelolactone(10yM)[26'27]。每一個(gè)拮抗劑均與mmLDL同時(shí)加入并共培養(yǎng)24h。然后，血 管環(huán)置入浴槽做血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)，如果做RT-PCR或者western blot實(shí)驗(yàn)，血管環(huán)放入液氮 冷凍3小時(shí)然后存儲(chǔ)于-80°C冰箱。
[0045] 藥物和試劑
[0046] mmLDL購(gòu)自廣州奕源生物科技有限公司。Sarafotoxin 6c (S6c) (Auspep, Parkville，澳大利亞）溶解于含0. I %牛血清白蛋白的生理鹽水中。乙酰膽堿 (Acetylcholine, ACh)和 5_ 輕色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)(Sigma, St Louis, MI，美國(guó)）溶解于生理鹽水。SB386023, U0126, SP600125, SB203580, staurosporine 和 wedelolactone(Sigma，St Louis, MI，美國(guó)）均初溶于DMS0。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中使用分析純 化學(xué)試劑和雙蒸水。所有試劑在試驗(yàn)前再用緩沖液進(jìn)一步稀釋，濃度以浴槽中最終藥物的 濃度表示。
[0047] 動(dòng)脈環(huán)肌張力實(shí)驗(yàn)
[0048] 將腦基底動(dòng)脈環(huán)套在兩個(gè)L型的金屬針上，其中一個(gè)連接FT03C?張力換能 器（Grass Instrument Co. Quincy，Mass.，U. S. A)，另一個(gè)連微調(diào)裝置（可以調(diào)節(jié)負(fù)荷 張力），通過軟件Chart5.0以及硬件PowerLab 8通道橋式放大器（ADInstruments Co, Australia)，將血管所負(fù)荷張力顯示于屏幕。將安裝好的動(dòng)脈環(huán)置入含有5ml Krebs液的 37°C Myograph?恒溫浴槽（DMT，Denmark)，持續(xù)通入含95% O2和5% CO2的混合氣體，pH 保持7. 4。實(shí)驗(yàn)前，腦基底動(dòng)脈環(huán)靜息負(fù)荷I. 5mN，每20min換液一次，穩(wěn)定lh。以K+-Krebs 液（含K+63.5mM)檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮性，兩次收縮高度大于ImN且收縮幅度相差< 10%者用 于實(shí)驗(yàn)。K+-Krebs 液組成為（mM:NaCl 60、NaHCO3 15、KCl 63. 5、MgCl2 1.2、NaH2PO4 1.2、 CaCl2 1. 5 和葡萄糖 5. 5)。
[0049] 在浴槽中濃度累加法加入S6c (KTkiM-KT7M)，選擇性激動(dòng)ETb受體，可以得到ET b受 體介導(dǎo)的量效曲線。
[0050] 實(shí)時(shí)定量PCR
[0051] 總的RNA提取使用RNAfast200試劑盒（Fastgen，上海），按照使用說(shuō)明書提 取。提取的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 使用 GeneAmp RNA PCR 試劑盒（Perkin-Elmer Applied Biosystems)，按照說(shuō)明書在Perkin-Elmer公司的DNA熱循環(huán)儀完成。RT-PCR在GeneAmp 5700擴(kuò)增儀中進(jìn)行，使用基因擴(kuò)增的SYBR Green試劑盒（Toyobo Co.，LTD，Osaka，日本）， 以cDNA為模版。設(shè)立對(duì)照組，除不加 cDNA外，余平行操作。
[0052] 受體的特異性引物根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用引物表達(dá)-2軟件設(shè)計(jì)（PE Applied Biosystems)，引物由北京Sunbiotech Co. Ltd公司合成。大鼠 ETb受體特異性引物（基因 庫(kù)編號(hào)NM_017333)設(shè)計(jì)如下：
[0053] 前引物：5' -TGACGCCACCCACTAAGACC-3'
[0054] 后引物：5，-GGCACGGAGGAGGGAAGG-3，
[0055] Beta-actin ( β-actin，基因庫(kù)編碼NM_031144)mRNA為官家基因，引物設(shè)計(jì)如下：
[0056] 前引物：5，-ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3，
[0057] 后引物：5' -CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-S'
[0058] 反應(yīng)體系為25μ L，開始在95°C lmin，95°C反應(yīng)15s，60°C反應(yīng)15秒，72°C反應(yīng) 45s，完成40個(gè)PCR循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用分離曲線分析法以確定PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。
[0059] Western blotting
[0060] 實(shí)驗(yàn)時(shí)取出存于_80°C冰箱的腦基底動(dòng)脈，加入含有蛋白酶抑制劑（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN,美國(guó)）的細(xì)胞提取變性緩沖液RIPA裂解液 (0.5M Tris-HCl, pH 7. 4,1. 5M NaCl, 2. 5% deoxycholic acid, 10% NP-40, IOmM EDTA), 勻楽。使用BCA蛋白分析試劑盒（Pierce Biotechnology)蛋白定量。使用SDS-PAGE凝膠 分離，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶（T-TBS緩沖液配置）封閉。一抗為兔抗大鼠 ETb 受體抗體（I : 100 稀釋）（AB3284, Millipore，CA, USA)，和小鼠抗大鼠 β -actin 抗體 (1 : 500稀釋），稀釋液為含2%牛血清白蛋白的PBS ;二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔 IgG(l : 2000稀釋）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠 IgG(l : 2000稀釋）。圖像經(jīng)Image Gauge Ver. 4. 0(Fuji Photo Film Co. ,Ltd,日本），對(duì)光密度進(jìn)行分析。
[0061] 數(shù)理統(tǒng)計(jì)
[0062] 數(shù)據(jù)以X土SEM表示，收縮反應(yīng)以不同濃度激動(dòng)劑引起收縮效應(yīng)相對(duì)于63. 5mmol/ L鉀引起的收縮效應(yīng)百分?jǐn)?shù)表達(dá)，反應(yīng)特征表述為Emax (最大收縮百分率）和PEC5tl (產(chǎn)生一 半最大收縮時(shí)所需要受體激動(dòng)劑濃度的負(fù)對(duì)數(shù)）。收縮激動(dòng)劑的濃度-效應(yīng)曲線采用迭代 最小二乘法契合出的Hill方程（GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件）計(jì)算該激動(dòng)劑的Emax和pEC5(l 值。RT-PCR操作均采用復(fù)孔，取平均值。β-actin為管家基因。用下面的公式計(jì)算ETb受 體的量：X Q/RQ = 2etK-etx, X。=原始的ETb受體mRNA的量,Rtl =原始的β -actin mRNA的量， CtR = β-actin的Ct值，CtX = ETb受體的Ct值。目標(biāo)條帶和內(nèi)參蛋白相比，再與對(duì)照組 比較后的百分率表示。
[0063] Students' t檢驗(yàn)用來(lái)比較兩組間的數(shù)據(jù)，單因素雙向方差分析（ANOVA)或雙因 素 ANOVA和Dunnett' s后檢驗(yàn)（GraphPad Prism)用來(lái)比較兩組以上的數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)分析及 作圖使用Prism 5. 0軟件。當(dāng)P < 0. 05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0064] 結(jié)果
[0065] 分析mmLDL的氧化修飾
[0066] mmLDL在器官培養(yǎng)的過程中會(huì)有弱的氧化修飾作用。我們采用丙二醛試劑盒 檢測(cè)mmLDL的氧化程度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，器官培養(yǎng)前后mmLDL的丙二醛值 (malondialdehyde，MDA)分別為 10. 84±0· 79nmol MDA/mg LDL 和 12. 58±L 73nmol MDA/ mg LDL (P > 0· 05，η = 3)，差值沒有顯著性意義。
[0067] 收縮功能
[0068] 使用mmLDL器官培養(yǎng)前后，或者使用特異性通路抑制劑共培養(yǎng)后，血管環(huán)對(duì) 63. 5mM K+的收縮值在各組間沒有顯著差異（如：新鮮組2. 14±0. 16mN，器官培養(yǎng)組 2. 43±0· 20mN，與 mmT.PT,共培養(yǎng)組 2. 36±0. 21mN，P > 0· 05, η = 8)。用 20 μ M 的 5-HT 預(yù) 收縮血管環(huán)，再用IOmM ACh舒張，舒張率低于預(yù)收縮值的5%，表明內(nèi)皮去除完全。
[0069] S6c在新鮮腦基底動(dòng)脈引起微弱收縮，Emax值為2% ±1 %。培養(yǎng)24h后，S6c在腦 基底動(dòng)脈引起顯著的濃度依賴性的收縮，其Emax值為88% ±6%。分別與5,10或者20 μ g/ mL mmLDL共培養(yǎng)24h，S6c在腦基底動(dòng)脈環(huán)引起的收縮量效曲線出現(xiàn)濃度依賴性的左移（圖 1A)。在 mmLDL 劑量分別為 10 和 20 μ g/mL 時(shí)，其 Eniax 值分別為 116 % ±12% (P> 0.05) 和141 % ± 14% (P > 0. 01)。加入mmLDL 10 μ g/mL器官培養(yǎng)腦基底動(dòng)脈環(huán)6h，S6c引起 弱的收縮反應(yīng)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為12,24或者48h，S6c引起的收縮量效曲線曾時(shí)間依賴性的左 移（圖1B)。共培養(yǎng)24h的E max值為（116% ±12% )顯著高于共培養(yǎng)12h(56% ±7%，P < 0.01)，但是和共培養(yǎng)48h比，其Emax值沒有顯著性，48h的Emax值為141% ±14% (P > 0. 05)。在本研究中，選用mmLDL的劑量為10 μ g/mL，器官培養(yǎng)時(shí)間為24h。結(jié)果顯示器官 培養(yǎng)24h可以增加 S6c引起的腦基底動(dòng)脈環(huán)收縮反應(yīng)，10 μ g/mL mmLDL可以進(jìn)一步顯著增 強(qiáng)這種作用（圖1B)。然而，基底動(dòng)脈環(huán)與10 μ g/mL LDL共培養(yǎng)，對(duì)S6c引起的收縮量效曲 線沒有影響圖1C)。
[0070] 表I. S6c在去內(nèi)皮腦基底動(dòng)脈誘導(dǎo)的收縮作用
[0071]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于mmLDL上調(diào)腦基底動(dòng)脈的ETB受體的方法，其特征在于，具體步驟為：步驟一、動(dòng)脈環(huán)的制備及器官培養(yǎng) SD大鼠用C02麻醉，斷頭處死，迅速取出大腦放入冷的碳酸氫鹽緩沖液，取出腦基底動(dòng) 脈，顯微鏡下剝離血管周圍組織，血管內(nèi)插入一根細(xì)線機(jī)械旋轉(zhuǎn)去除內(nèi)皮，將處理好的血管 切成1mm長(zhǎng)的圓環(huán)，當(dāng)乙酰膽堿引起的舒張率< 10%，認(rèn)為內(nèi)皮已被去除， 血管環(huán)在24孔板進(jìn)行器官培養(yǎng)，每孔2個(gè)血管環(huán)，每孔加入含100 y g/ml鏈霉素、 100U/ml青霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在37°C，含5% C02和95% 02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，由于器官 培養(yǎng)本身可以在腦基底動(dòng)脈誘發(fā)ETB受體上調(diào)，在考察mmLDL對(duì)ETB受體的作用時(shí)將器官培 養(yǎng)組設(shè)為一個(gè)對(duì)照組，LDL組為另一個(gè)對(duì)照組，預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)X基底動(dòng)脈環(huán)分別與5,10和20 y g/ mL的mmLDL共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為6,12, 24和48h，預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示1 ii L的DMS0加入lmL的 DMEM不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了考察mmLDL對(duì)ETB受體的作應(yīng)機(jī)制，使用了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異 性拮抗劑， PKC通路拮抗劑選用0? liiMstaurosporine，ERK1/2通路拮抗劑為10iiMU0126和 10iiMSB386023, U0126 拮抗 MAP 激酶/ERK 激酶 1/2,即拮抗 MAPKK;SB386023 拮抗上游 的MAPKKK，特異性的JNK通路拮抗劑為10 ii MSP600125, p38MAPK通路拮抗劑為10 ii M的 SB203580，NF_ k B通路詰抗劑為10 u M的wedelolactone，每一個(gè)詰抗劑均與mmLDL同時(shí) 加入并共培養(yǎng)24h，然后，血管環(huán)置入浴槽做血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)，如果做RT-PCR或者western blot實(shí)驗(yàn)，血管環(huán)放入液氮冷凍3小時(shí)然后存儲(chǔ)于-80°C冰箱； 步驟二、動(dòng)脈環(huán)肌張力實(shí)驗(yàn) 將腦基底動(dòng)脈環(huán)套在兩個(gè)L型的金屬針上，其中一個(gè)連接張力換能器，另一個(gè)連微調(diào) 裝置，通過軟件Chart5.0以及硬件PowerLab 8通道橋式放大器，將血管所負(fù)荷張力顯示 于屏幕，將安裝好的動(dòng)脈環(huán)置入含有5ml Krebs液的37°C Myograph恒溫浴槽，持續(xù)通入含 95 % 02和5 % C02的混合氣體，pH保持7. 4,實(shí)驗(yàn)前，腦基底動(dòng)脈環(huán)靜息負(fù)荷1. 5mN，每20min 換液一次，穩(wěn)定lh，以含K+63. 5mM的K+-Krebs液檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮性，兩次收縮高度大于lmN 且收縮幅度相差< 10%者用于實(shí)驗(yàn)， 在浴槽中濃度累加法加入lOiM-KTM的S6c，選擇性激動(dòng)ETB受體，可以得到ETB受體 介導(dǎo)的量效曲線； 步驟三、實(shí)時(shí)定量PCR 總的RNA提取使用RNAfast200試劑盒，按照使用說(shuō)明書提取，提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA使用GeneAmp RNA PCR試劑盒，按照說(shuō)明書在Perkin-Elmer公司的DNA熱循環(huán)儀完 成，RT-PCR在GeneAmp5700擴(kuò)增儀中進(jìn)行，使用基因擴(kuò)增的SYBR Green試劑盒，以cDNA為 模版，設(shè)立對(duì)照組，除不加cDNA外，余平行操作， 受體的特異性引物根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用引物表達(dá)-2軟件設(shè)計(jì)，大鼠ETB受體特異性引 物，基因庫(kù)編號(hào)NM_〇17333,設(shè)計(jì)如下： 前引物：5' -TGACGCCACCCACTAAGACC-3' 后引物：5, -GGCACGGAGGAGGGAAGG-3, Beta-actin mRNA為官家基因，引物設(shè)計(jì)如下： 前引物：5' -ACTATCGGCAATGAGCGGITCC-3' 后引物：5' -CTGTGITGGCATAGAGGTCTTTACG-3' 步驟四、Western blotting 實(shí)驗(yàn)時(shí)取出存于_80°C冰箱的腦基底動(dòng)脈，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞提取變性緩 沖液RIPA裂解液，勻漿，使用BCA蛋白分析試劑盒蛋白定量，使用SDS-PAGE凝膠分離，電轉(zhuǎn) 膜儀轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗為1 : 100稀釋的兔抗大鼠￡\受體抗體，和 1 : 500稀釋的小鼠抗大鼠P-actin抗體，稀釋液為含2%牛血清白蛋白的PBS;二抗為辣 根過氧化物酶標(biāo)記的1 : 2000稀釋的抗兔IgG和1 : 2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 抗小鼠IgG，圖像經(jīng)Image Gauge Ver. 4. 0,對(duì)光密度進(jìn)行分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，K+-KrebS液組成為mM :NaCl 60、NaHC0315、KCl 63.5、]\%(：121.2、似4?041.2、〇&(：121.5和葡萄糖5.5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟三中，PCR反應(yīng)體系為：25 y L，開 始在95°C lmin，95°C反應(yīng)15s，60°C反應(yīng)15秒，72°C反應(yīng)45s，完成40個(gè)PCR循環(huán)，反應(yīng)結(jié) 束后采用分離曲線分析法以確定PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟四中，所述細(xì)胞提取變性緩沖液 RIPA裂解液包括0.5M Tris-HCl，pH 7.4，1.5M NaCl，2.5%deoxycholic acid，10%NP-40， lOmM EDTA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK104388547SQ201410601564
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月2日
【發(fā)明者】李潔, 林杰, 王俊杰, 曹永孝, 陳碧 申請(qǐng)人:李潔, 林杰, 王俊杰