可溶性i型鴨肝炎病毒3d蛋白的制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白的制備方法和應(yīng)用，制備方法如下：將SEQ ID NO.3所示序列的第9～1376位核苷酸連接于pET-32(a)+載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，然后以大腸桿菌Rosetta、BL21或BL21(DE3)PLYS為宿主菌，在Amp抗性的LB培養(yǎng)基中活化后，加入IPTG至終濃度為0.2～1.0mmol/L，在溫度為20～39℃誘導(dǎo)表達(dá)4～12h；制得的I型鴨肝炎病毒3D蛋白為可溶性，并且有免疫原性，能夠刺激鴨體產(chǎn)生抗I型鴨肝炎病毒3D蛋白的抗體，能夠用作檢測(cè)I型鴨病毒性肝炎的血清樣本或含抗I型鴨肝炎病毒3D蛋白抗體的試劑，對(duì)I型鴨病毒性肝炎的診斷和疫苗的研究具有重要意義。
【專利說(shuō)明】可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白的制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白的制備方法， 還涉及該蛋白的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界上養(yǎng)鴨數(shù)量最多的國(guó)家，鴨的飼養(yǎng)量約占世界的70%，養(yǎng)鴨業(yè)在我 國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。因此對(duì)鴨源微生物進(jìn)行研究具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。 鴨肝炎病毒（Duck H印atitis Virus，DHV)可引起雛鴨的鴨病毒性肝炎（Duck Viral H印atitis，DVH)。DVH是一種高度致死性傳染病，以發(fā)病急、病程短、發(fā)病率和死亡率高為 特點(diǎn)。DHV分為3個(gè)各自獨(dú)立的沒(méi)有血清學(xué)關(guān)系的血清型：1型、II型和III型。其中，血 清I型鴨肝炎病毒（DHV-I)又稱鴨甲型肝炎病毒（Duck h印atitis A virus，DHAV)，是目 前我國(guó)流行的主要鴨肝炎病毒，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，威脅著養(yǎng)鴨業(yè)的健 康發(fā)展。并且三種血清型均屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬，病毒粒子呈球形或類(lèi)球形，核衣 殼呈20面體對(duì)稱，直徑為20-40nm，無(wú)囊膜，胞漿內(nèi)繁殖，基因組核酸為不分節(jié)段的單股正 鏈RNA，長(zhǎng)7000-8500nt，5'非翻譯區(qū)（5, UTR)末端共價(jià)結(jié)合VPg，3'非翻譯區(qū)（3, UTR)末 端含polyA尾，兩非翻譯區(qū)之間是唯一開(kāi)放閱讀框（ORF)，當(dāng)ORF在宿主細(xì)胞中表達(dá)出多聚 蛋白后，被病毒自身編碼的蛋白酶切割為成熟蛋白。多聚蛋白N段1/3編碼結(jié)構(gòu)蛋白P1， 組裝成病毒的衣殼；剩下的編碼P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與對(duì)病毒復(fù)制所需的相關(guān)蛋白 及宿主防御系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)，使病毒核酸和蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)完滿復(fù)制、翻譯。P3 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B、3C和3D，3D蛋白是鴨肝炎病毒重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒復(fù)制的關(guān) 鍵酶，因此，對(duì)I型鴨肝炎病毒的3D進(jìn)行研究具有重要理論和實(shí)際意義。
[0003] 對(duì)3D進(jìn)行研究及應(yīng)用的基礎(chǔ)首先要獲得3D蛋白。目標(biāo)蛋白的獲得可采用基因工 程體外表達(dá)的方法，目前表達(dá)外源基因常用真核和原核系統(tǒng)，真核系統(tǒng)常用昆蟲(chóng)、動(dòng)物、酵 母和哺乳類(lèi)細(xì)胞等，原核系統(tǒng)則主要利用大腸桿菌且目前廣泛使用，但并不是每一種基因 都能在其中進(jìn)行有效表達(dá)，并且大腸桿菌表達(dá)易形成不溶性的包涵體，包涵體由于雜蛋白 含量較低、可避免蛋白酶降解、難溶于水等特點(diǎn)而使其易于分離純化。包涵體的形成原因 多種多樣，其中最主要的原因可能是蛋白合成速度太快，沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行正確折疊；另 夕卜，當(dāng)重組蛋白缺乏翻譯后修飾時(shí)，也會(huì)使中間體大量積累而形成包涵體。包涵體中的目 標(biāo)蛋白雖然其肽鏈?zhǔn)峭暾?，但卻是非天然形式、無(wú)生物學(xué)活性的表達(dá)蛋白，包涵體的溶解 非常困難，需要用強(qiáng)變性劑高濃度尿素、SDS等來(lái)打斷分子內(nèi)和分子間的非共價(jià)鍵、離子鍵 等，為獲得有活性的蛋白，繼而需要進(jìn)行蛋白復(fù)性，而包涵體蛋白溶解后的復(fù)性不僅費(fèi)時(shí)、 費(fèi)力，且復(fù)性率低。因此，對(duì)3D基因進(jìn)行體外表達(dá)以獲得有活性的3D蛋白對(duì)I型鴨肝炎病 毒的診斷和基因工程疫苗的研究具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白的制備方 法；本發(fā)明的目的之二在于提供可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測(cè)I型鴨肝炎病毒 感染鴨血清或含I型鴨肝炎病毒3D抗體的ELISA試劑盒中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之三在于 提供可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備3D蛋白免疫血清中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之四 在于提供利用可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白制備的免疫血清在制備檢測(cè)I型鴨肝炎病毒 或I型鴨肝炎病毒3D蛋白的試劑中的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1、可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白的制備方法，包括如下步驟：將SEQ ID NO. 3所 示序列的第9?1376位核苷酸連接于pET-32 (a) +載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，然后以大腸 桿菌Rosetta、BL21或BL21 (DE3) PLYS為宿主菌，在Amp抗性的LB培養(yǎng)基中活化后，在IPTG 終濃度為〇. 2?I. Ommol/L、溫度為20?39°C條件下誘導(dǎo)表達(dá)4?12小時(shí)。
[0007] 優(yōu)選的，所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)PLYS。
[0008] 優(yōu)選的，在IPTG終濃度為0. 8mmol/L、溫度為25°C條件下誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。
[0009] 優(yōu)選的，所述活化的具體步驟為：將表達(dá)菌株接種于Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，在 37°C、120r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與Amp抗性的LB培養(yǎng)基按體積比為I :100 擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6c?為0. 6即可。
[0010] 更優(yōu)選的，誘導(dǎo)表達(dá)后還包括純化步驟，具體如下：收集菌液，在12000r/min條件 下離心IOmin后收集菌體，收集的菌體用20mmol/L、pH為8. 0的Tris-HCl懸浮，然后在冰浴 下超聲，將破碎后的菌體在4°C、12000r/min條件下離心lOmin，收集上清，上清用Ni 2+-NTA 瓊脂糖凝膠柱純化，透析，用〇. 45 μ m的濾膜超濾得純化的可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白。
[0011] 最優(yōu)選的，所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎6次，30sec/次，每次之間間 隔 30sec。
[0012] 2、所述方法制得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測(cè)I型鴨肝炎病毒感染 鴨血清或含I型鴨肝炎病毒3D抗體的ELISA試劑中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選的，所述可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在作為I型鴨病毒性肝炎抗體或I型 鴨肝炎病毒3D蛋白抗體的捕獲劑中的應(yīng)用。
[0014] 3、所述方法制得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備I型鴨肝炎病毒3D蛋白免 疫血清中的應(yīng)用。
[0015] 4、利用可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白制備的I型鴨肝炎病毒3D蛋白免疫血清在 制備檢測(cè)I型鴨肝炎病毒或I型鴨肝炎病毒3D蛋白的試劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開(kāi)了可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白的制備方 法，該方法獲得的3D蛋白為可溶性的，克服了現(xiàn)有技術(shù)容易形成包涵體的缺陷，因此獲得 的蛋白是天然的，不需要使用變性劑進(jìn)行變性、復(fù)性獲得有活性的蛋白。并且將制得的可溶 性I型鴨肝炎病毒3D蛋白免疫兔后能夠獲得高免血清，表明該重組蛋白具有免疫原性，能 夠刺激兔產(chǎn)生抗3D蛋白的多克隆抗體；此外利用獲得的3D蛋白作為抗原包被劑后能夠捕 獲I型鴨肝炎病毒3D蛋白抗體，因此能夠作為診斷I型鴨病毒性肝炎的ELISA試劑，對(duì)I 型鴨病毒性肝炎的診斷和基因工程疫苗的研究具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0018] 圖1為I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（M :DL 2000Marker，I :3D 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物）。
[0019] 圖2為I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因載體構(gòu)建過(guò)程中PCR鑒定和酶切 鑒定結(jié)果（A :pJET-l. 2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒 PCR 鑒定，M :DL2000Marker，I :PCR 產(chǎn)物；B : pJET-1. 2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒酶切鑒定，M :DL15000Marker，I :Kpn I /Xho I 雙酶切條帶，2 : Xho I 單酶切條帶；C :pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的 PCR 鑒定，M :DL2000Marker，I :PCR產(chǎn) 物；D :pET32a+/DHAV-H-3D質(zhì)粒的酶切鑒定，I :Kpn I /Xho I雙酶切結(jié)果，2 :Xho I單酶 切條帶）。
[0020] 圖3為可溶性3D蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化（M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；A :表達(dá)菌 的篩選，1為pET-32 (a) +空載體表達(dá)產(chǎn)物，2-4分別為pET-32 (a) +/DHAV-H-3D重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化Rosetta、BL21和BL21 (DE3) PLYS三種不同表達(dá)宿主菌的表達(dá)產(chǎn)物；B :誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的 優(yōu)化，1-5依次為誘導(dǎo)12h、10h、8h、6h和4h的BL21 (DE3)PLYS宿主菌表達(dá)產(chǎn)物；C :誘導(dǎo)表 達(dá)溫度的優(yōu)化，1-6 分別為 39°C、37°C、35°C、30°C、25°C和 20°C 的 BL21 (DE3)PLYS 宿主菌 表達(dá)產(chǎn)物；D :IPTG 濃度優(yōu)化，1-5 分別為 0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L 和 I. Ommol/L的IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物。
[0021] 圖4為可溶性3D蛋白Western-blot檢測(cè)及純化蛋白電泳（A為3D蛋白的免疫印 跡檢測(cè)結(jié)果，M為蛋白質(zhì)Marker，1為3D蛋白印跡；B為SDS-PAGE檢測(cè)純化的3D蛋白，M為 低分子量蛋白質(zhì)Marker, 1為純化的3D蛋白）。
[0022] 圖5為兔抗可溶性3D蛋白高免血清瓊擴(kuò)效價(jià)檢測(cè)。
[0023] 圖6為兔抗3D蛋白高免血清的免疫組化法檢測(cè)DHAV及3D在免疫鴨肝臟中的分 布（A :免疫組化檢測(cè)可溶性3D蛋白免疫鴨3D蛋白在肝臟內(nèi)的分布；B :免疫組化檢測(cè)DHAV 弱毒苗與可溶性3D蛋白共同免疫鴨3D蛋白在肝臟內(nèi)的分布；C :免疫組化檢測(cè)DHAV弱毒苗 免疫鴨3D蛋白在肝臟內(nèi)的分布；D :免疫組化檢測(cè)對(duì)照鴨肝臟組織（10X60);箭頭示特異 性染色）。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 實(shí)施例1、克隆I型鴨肝炎病毒株DHAV-H的3D基因
[0026] I 型鴨肝炎病毒株 H(DHAV-H)(基因組序列見(jiàn) GenBank :JQ301467)、E. coli DH5 α 菌種和pET-32 (a) +載體均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病防治研究中心保存并提供。各種分子生物 學(xué)試劑購(gòu)于生物試劑公司。
[0027] 根據(jù)DHAV-H的基因組序列（GenBank JQ301467)設(shè)計(jì)擴(kuò)增3D基因的引物，具體引 物如下：
[0028] Pl :5' -ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3' (SEQ ID NO. 1)，下劃線表示 Kpn I酶切位點(diǎn)；
[0029] P2 :5' -acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3' (SEQ ID NO. 2)，下劃線表不 Xho I酶切位點(diǎn)；然后將設(shè)計(jì)的引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。
[0030] 取保存的DHAV-H病毒液以滅菌PBS作5倍稀釋，添加 1/100體積的雙抗（青霉 素、鏈霉素的終濃度分別為l〇〇IU/mL和100yg/mL)后于37°C溫育lh，然后接種9日齡發(fā) 育良好、無(wú)母源抗體的鴨胚,棄去24h內(nèi)死亡胚，收集24?72h死亡胚的尿囊液及胚體，按 照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。
[0031] 將提取的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以CDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄和 PCR擴(kuò)增體系如表1所示。
[0032] 表1反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)體系
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將SEQ ID NO. 3所示序列的第9?1376位核苷酸連接于pET-32 (a) +載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，然后 以大腸桿菌R〇setta、BL21或BL21 (DE3) PLYS為宿主菌，在Amp抗性的LB培養(yǎng)基中活化后， 在IPTG終濃度為0. 2?1. Ommol/L、溫度為20?39°C條件下誘導(dǎo)表達(dá)4?12小時(shí)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3) PLYS。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：在IPTG終濃度為0. 8mmol/L、溫度為 25°C條件下誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述活化的具體步驟為：將表達(dá)菌株 接種于Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，在37°C、120r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與Amp 抗性的LB培養(yǎng)基按體積比為1 :100擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_為0. 6即可。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，誘導(dǎo)表達(dá)后還包括純化 步驟，具體如下：收集菌液，在12000r/min條件下離心lOmin后收集菌體，收集的菌體用 20mmol/L、pH為8. 0的Tris-HCl懸浮，然后在冰浴下超聲，將破碎后的菌體在4°C、12000r/ min條件下離心lOmin,收集上清，上清用Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱純化，透析，用0. 45 μ m的 濾膜超濾得純化的可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破 碎6次，30sec/次，每次之間間隔30sec。
7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法制得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測(cè)I型 鴨肝炎病毒感染鴨血清或含I型鴨肝炎病毒3D抗體的ELISA試劑盒中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在作 為抗I型鴨肝炎病毒3D蛋白抗體或抗I型鴨病毒性肝炎抗體的捕獲劑中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法制得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備I型鴨肝 炎病毒3D蛋白免疫血清中的應(yīng)用。
10. 利用可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白制備的I型鴨肝炎病毒3D蛋白免疫血清在制 備檢測(cè)I型鴨肝炎病毒或I型鴨肝炎病毒3D蛋白的試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104293823SQ201410604051
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】程安春, 汪銘書(shū), 曹乾大, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)