一種高通量環(huán)狀rna測序的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高通量環(huán)狀RNA測序的方法，屬于分子生物學領(lǐng)域。該方法包括：人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA；對外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行質(zhì)量控制；將外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，得到混合外源RNA；向待測序樣本的總RNA中加入混合外源RNA，得到第一混合物；去除第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物；對第二混合物進行3’末端生物素標記，并去除標記上生物素的套索RNA及線性RNA，得到第三混合物；去除第三混合物中的線性RNA，得到第四混合物；對第四混合物進行標準的高通量轉(zhuǎn)錄組測序并對測序數(shù)據(jù)進行生物學分析。本發(fā)明能夠準確反映出生物體內(nèi)的基因在特定條件下的表達情況，降低了的成本。
【專利說明】-種高通量環(huán)狀RNA測序的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，特別涉及一種高通量環(huán)狀RNA測序的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物體內(nèi)大部分的RNA為線性，但有少部分RNA首尾連接形成環(huán)狀，被稱為環(huán)狀 RNA。早在1980年，環(huán)狀RNA就首次被發(fā)現(xiàn)，但是30年來，由于研究方法的限制，人們對于環(huán) 狀RNA的了解知之甚少，直至近年來，隨著高通量測序技術(shù)的高速發(fā)展，并結(jié)合生物信息學 的方法，大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)被深入挖掘，研究者們從中發(fā)現(xiàn)了大量的環(huán)狀RNA信息，從而 使得環(huán)狀RNA迅速成為RNA世界研究的新熱點，繼而衍生出了有針對性的環(huán)狀RNA測序，這 也極大地加快了對環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)及對環(huán)狀RNA功能的分析。在現(xiàn)有的高通量轉(zhuǎn)錄組測序 中，通過在樣本中混入外源轉(zhuǎn)錄本作為參考，可以直接評估差異表達基因的檢測的靈敏度、 高通量測序文庫的質(zhì)量及基因表達倍數(shù)變化。
[0003] 研究環(huán)狀RNA的前提是將環(huán)狀RNA從生物體內(nèi)分離出來，目前還沒有直接從生物 體內(nèi)獲取環(huán)狀RNA的方法，只能從總RNA中去除線性RNA，間接達到富集環(huán)狀RNA的目的。 在現(xiàn)有的研究方法下，雖然能夠?qū)€性RNA分子進行消化，但是效果并不明顯，從環(huán)狀RNA 的測序數(shù)據(jù)中可見，僅僅只有不到1 %是環(huán)狀RNA分子的序列，而其余的99 %都是無用的數(shù) 據(jù)。要獲取足夠分析環(huán)狀RNA的有效數(shù)據(jù)量，單個樣本的測序數(shù)據(jù)量需要達到100M，這對于 高通量測序而言，仍然是個非常龐大的數(shù)字，這也意味著巨額的人力物力財力的投入。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中總RNA中的環(huán)狀RNA無法準確測序的問題，本發(fā)明實施例提 供了一種高通量環(huán)狀RNA測序的方法。所述技術(shù)方案如下 ：
[0005] 本發(fā)明實施例提供了一種高通量環(huán)狀RNA測序的方法，所述方法包括：
[0006] 人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA ;
[0007] 對所述外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA進行質(zhì)量控制；
[0008] 將所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混 合，得到混合外源RNA ;
[0009] 向待測序樣本的總RNA中加入所述混合外源RNA，所述總RNA與所述混合外源RNA 的質(zhì)量比為2000:1，得到第一混合物；
[0010] 去除所述第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物；
[0011] 對所述第二混合物進行3'末端生物素標記，并去除被標記上生物素的套索RNA及 線性RNA，所述線性RNA包括所述總RNA中的內(nèi)源線性RNA和所述外源線性ERCC-0004-RNA， 得到第三混合物；
[0012] 去除所述第三混合物中殘留的所述線性RNA，得到第四混合物；
[0013] 對所述第四混合物進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序并對測序數(shù)據(jù)進行生物學分析。
[0014] 具體地，所述人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，包 括：
[0015] 選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序 列表中SEQ ID NO: 1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO:2所示；
[0016] 將所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達載體 中，分別獲得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；
[0017] 將獲得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因進行 體外轉(zhuǎn)錄，分別合成所述外源線性ERCC-0004-RNA和外源線性ERCC-0013-RNA ;
[0018] 去除所述外源線性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并將所述外源線性 ERCC-0013-RNA的5'端修飾羥基；
[0019] 對5'端修飾羥基的所述外源線性ERCC-0013-RNA進行磷酸化修飾，合成5'端經(jīng) 磷酸化修飾的所述外源線性ERCC-0013-RNA ;
[0020] 將所述5'端經(jīng)磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端連接；
[0021] 去除未環(huán)化成功的所述外源線性ERCC-0013-RNA，得到所述外源環(huán)狀 ERCC-OO13-RNA。
[0022] 進一步地，所述待測序樣本的基因中不存在與所述外源ERCC-0004基因和所述外 源ERCC-0013基因相同或同源性高的基因。
[0023] 進一步地，對所述外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA進行質(zhì)量控制，包括：
[0024] 利用隨機引物對所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源 ERCC-OO13-cDNA，所述外源ERCC-OO13-cDNA包括外源線性ERCC-OO13-cDNA和外源環(huán)狀 ERCC-OO13-cDNA ；
[0025] 利用第一引物和第二引物分別對所述外源ERCC-0013-cDNA進行實時定量PCR擴 增，所述第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引 物和如序列表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于擴增所述外源線性 ERCC-0013-cDNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于擴增所述外源環(huán)狀 ERCC-OO 13-cDNA，通過所述第一引物擴增獲得CtI值，通過所述第二引物擴增獲得CT2值；
[0026] 通過CtI值和CT2值以及公式2 [CT2_CT1] X 100 %，計算合成的所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的環(huán)化比例，并選用環(huán)化比例超過90%的所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0027] 具體地，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的線性RNA。
[0028] 具體地，向所述待測序樣本的總RNA中，加入所述混合外源RNA，所述總RNA與所述 混合外源RNA的質(zhì)量比為2000:1。
[0029] 進一步的，采用RNA酶R去除未環(huán)化成功的所述外源線性ERCC-0013-RNA。
[0030] 具體地，采用鏈霉親和素磁珠去除被標記上所述生物素的套索RNA及所述線性 RNA。
[0031] 具體地，所述生物學分析包括：獲得所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán) 狀ERCC-0013-RNA的相對比例、以及以所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA為參考分析所述待測 序樣本中的環(huán)狀RNA基因表達變化。
[0032] 本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明實施例提供了一種高通 量環(huán)狀RNA測序的方法，模擬真核生物內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本的特征，用于評估RNA測序工具的系統(tǒng)性 能，及基因差異表達的檢測靈敏度，通過加入人工合成的外源線性RNA與環(huán)狀RNA，可以為 環(huán)狀RNA的表達量提供一個外源環(huán)狀RNA參考基因，通過外源環(huán)狀RNA的表達量，可以計算 樣本中內(nèi)源基因的表達量變化倍數(shù)，從而更準確的反映出生物體內(nèi)的基因在特定條件下的 表達情況；此外，通過對具有3'未端的RNA進行生物素標記，之后再利用鏈霉親和素磁珠捕 獲被標記上生物素的RNA的方法，進一步去除線性RNA和套索RNA，提高了樣品中環(huán)狀RNA 的富集度，減少單個樣本的環(huán)狀RNA測序數(shù)據(jù)量，比常用的環(huán)狀RNA高通量測序方法效率提 高了 14倍多，大幅的降低了高通量測序的成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合附圖對實施例描述中 所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施 例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲 得其他的附圖。
[0034] 圖1是本發(fā)明實施例提供的高通量環(huán)狀RNA測序的方法流程圖；
[0035] 圖2是本發(fā)明實施例提供的現(xiàn)有的環(huán)狀RNA測序的方法流程圖。

【具體實施方式】
[0036] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施方式作進一 步地詳細描述。本方案中未特別說明的試劑均為常用市售試劑，且不同市售試劑效果差異 不大。
[0037] 實施例
[0038] 本發(fā)明實施例提供了一種環(huán)狀RNA測序的新方法，本發(fā)明實施例提供的待測序 樣本為萊茵衣藻，且該萊茵衣藻的品系為CC503(購自于衣藻資源中心，網(wǎng)址為：http:// chlamycollection. org/)，如圖1所示，具體方法包括：
[0039] 步驟100 :人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。已有的 環(huán)狀RNA測序中是采用一個外源線性RNA作為參照（陰性參照）。本發(fā)明實施例中，人工合 成了外源環(huán)狀RNA與外源線性RNA，按比例加入總RNA后作為參照，以模擬體內(nèi)穩(wěn)定表達的 內(nèi)源環(huán)狀RNA與內(nèi)源線性RNA。本發(fā)明實施例提供的外源環(huán)狀RNA與外源線性RNA在待測序 樣本中沒有相同序列或同源性較高的序列，因為一旦加入總RNA中之后，是無法將外源RNA 與內(nèi)源RNA區(qū)分開的，若二者存在重疊，將導致結(jié)果不準確。此外，外源基因長度也不能過 長，否則影響環(huán)化效率。本發(fā)明實施例將RNA對應(yīng)的DNA序列轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中，通過質(zhì)粒增殖而 增加相應(yīng)的DNA的量,從而靈活獲得大量DNA序列，再通過體外轉(zhuǎn)錄,將質(zhì)粒上的DNA轉(zhuǎn)錄 為RNA。為此，在該DNA序列前端添加了體外轉(zhuǎn)錄啟動子序列。因轉(zhuǎn)錄成的RNA需要純化， 所以在DNA的末端設(shè)計了寡聚T，轉(zhuǎn)錄后形成寡聚A尾巴，寡聚A可用于純化RNA。合成的 外源RNA是線狀，需要環(huán)化后才能成為環(huán)狀RNA。由于合成時的RNA的5'端為三磷酸基團， 連接時需要單磷酸基團，為此，在去掉了外源RNA的三磷酸基團后，省去了加上單磷酸基團 這一步，從而合成能夠環(huán)化成環(huán)狀的前體RNA的狀態(tài)。具體操作步驟如下：
[0040] 1、選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，該外源ERCC-0004基因如序 列表中SEQ ID NO: 1所示，該外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
[0041] 上述SEQ ID NO: I、SEQ ID NO: 2及其互補鏈由生工生物工程（上海）股份有限公 司合成。
[0042] 通過NCBI的BLAST程序檢索，沒有發(fā)現(xiàn)生物中存在外源ERCC-0004基因和外源 ERCC-0013基因、以及與外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因的同源基因。選擇的 外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因的長度不超過lOOObp。分別在外源ERCC-0004 基因和外源ERCC-0013基因的5'端和3'端分別添加了 ctcgag和aagctt序列，該ctcgag 和aagctt序列分別為限制性內(nèi)切酶Xho I和Hind III的酶切位點，便于將外源ERCC-0004 基因和外源ERCC-0013基因克隆進入原核表達載體，外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013 基因的5'端的taatacgactcactata序列為T7轉(zhuǎn)錄酶的啟動子序列，其余序列為可轉(zhuǎn)錄的 序列。在taatacgactcactata序列之后連接有g(shù)gg序列，ggg序列能夠增加 T7轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn) 錄效率。
[0043] 2、將外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達載體中，獲 得克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因，包括 ：
[0044] 所選用的克隆載體為pBluescript II SK(+)(該克隆載體從長沙贏潤生物技術(shù)有 限公司購買，貨號為VKS0288)，采用內(nèi)切酶Xho 1(購買自NEB公司，貨號為R0146)和內(nèi)切 酶Hind 111(購買自NEB公司，貨號為R0104)對pBluescript II SK(+)載體進行雙酶切。 具體地，在20 μ 1的反應(yīng)體系中，包含有10 μ g pBluescript II SK(+)載體、20U的內(nèi)切酶 Hind III、20U的內(nèi)切酶Xho I和2X的NEBuffer2. 1(由NEB公司提供）。將上述反應(yīng)體 系混合均勻，經(jīng)短暫離心，于37°C保溫1小時后，經(jīng)80°C，20分鐘將酶失活，純化獲得線性 pBluescript II SK(+)載體，該線性 pBluescript II SK(+)載體的濃度為 0.5 μ g/μ 1。
[0045] 將外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因用無菌水溶解后，分別配制成濃度 為0. 5 μ g/ μ 1的溶液，將外源ERCC-0004基因及其互補鏈按體積比I : 1混合均勻，于PCR 儀中依次經(jīng)歷94°C 10分鐘；65°C 10分鐘和37°C 10分鐘，形成外源ERCC-0004-雙鏈DNA 基因；將外源ERCC-0013基因及其互補鏈按相同的方法進行處理，獲得外源ERCC-0013-雙 鏈DNA基因。
[0046] 在20 μ 1的反應(yīng)體系中包括線性的pBluescript II SK(+)載體10 μ 1、外源 ERCC-0004-雙鏈DNA基因1 μ 1、T4DNA連接酶（購買自NEB公司，貨號為M0202)400U和 1XT4DNA連接酶緩沖液（隨T4DNA連接酶一起購買自NEB公司），16°C溫育過夜后，65°C 10 分鐘，使T4DNA連接酶熱失活，獲得含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒 載體。按同樣的方法，獲得含有外源ERCC-0013基因的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒載體。
[0047] 利用熱激法將含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化 進入大腸桿菌，具體方法如下：取50 μ 1感受態(tài)細胞（由北京全式金生物技術(shù)有限公司生 產(chǎn)，目錄號為CD501)在冰浴中緩慢解凍，加入含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒載體，輕輕混勻，在冰浴上孵育30分鐘，42°C熱激30秒，快速轉(zhuǎn)移至冰浴中冰浴 3分鐘，該過程中不要搖動離心管，然后加入300 μ 1不含抗生素的無菌LB液體培養(yǎng)基（LB 液體培養(yǎng)基成份：牛肉膏〇. 5g，蛋白胨I. 0g，氯化鈉0. 5g，蒸餾水lOOmL，ρΗ7. 2?7. 5)，于 37°C，200轉(zhuǎn)/分鐘，復蘇1小時，取復蘇后的菌液200 μ 1均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的 LB固體培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和瓊 脂粉15g/L)上，待菌液完全吸收后倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)過夜。挑取LB固體培 養(yǎng)基上長出來的單克隆至5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37°C，200轉(zhuǎn)/分鐘，搖 菌擴增繁殖6-8小時，獲得的菌液用于提取質(zhì)粒。
[0048] 利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的快速質(zhì)粒小提試劑盒（貨號為DP105) 從上述菌液中，提取并純化含有外源ERCC-0004基因的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒載體的 DNA，提取與純化的方法按照隨試劑盒提供的說明書進行。利用分光光度計（美國Quawell 公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中的雙鏈DNA程序，檢測純化后的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒的 質(zhì)量濃度。利用外源ERCC-0004基因的PCR引物從純化后的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒 上擴增外源ERCC-0004基因。具體地，20 μ 1的擴增體系包括：純化后的pBluescript II SK⑴質(zhì)粒50ng、10 μ I Q5高保真擴增混合物（購自于NEB公司，貨號為M0492)和10 μ M的 外源ERCC-0004基因的PCR引物（該PCR引物為正向引物與反向引物的混合物）。擴增程 序如下：98°C，30秒；（98°C，8秒；56°C，20秒；72°C，20秒）X 30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物利用乙 醇沉淀進行純化，純化產(chǎn)物溶解于10 μ 1無核酸酶的水中，獲得外源線性ERCC-0004基因的 PCR產(chǎn)物，利用Q5000 (美國Quawel 1公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中的雙鏈DNA定量程序?qū)CR 產(chǎn)物進行定量檢測，檢測結(jié)果表明：本次擴增獲得的外源線性ERCC-0004基因的PCR產(chǎn)物濃 度為610ng/μ 1。擴增產(chǎn)物送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序，確認克隆的ERCC-0004的 正確性，從而獲得含有正確克隆外源ERCC-0004基因的Bluescript II SK(+)質(zhì)粒與外源 線性ERCC-0004基因的PCR產(chǎn)物。按同樣的方法，獲得含有正確克隆外源ERCC-0013基因 的Bluescript II SK(+)質(zhì)粒與外源線性ERCC-0013基因的PCR產(chǎn)物。
[0049] 其中，外源ERCC-0004基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQ ID N0:7所示， 外源ERCC-0004基因的PCR引物的反向引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；外源ERCC-0013 基因的PCR引物的正向引物如序列表中SEQ ID N0:7所示，外源ERCC-0013基因的PCR引 物的反向引物如序列表中SEQ ID N0:9所示。其中，SEQ ID N0:7與SEQ ID N0:9中的多 聚T序列是為了在轉(zhuǎn)錄時獲得多聚A，用于模擬生物RNA的多聚A尾巴，多聚A尾巴可用于 RNA的逆轉(zhuǎn)錄和純化。
[0050] 3、將克隆的外源ERCC-0004基因和ERCC-0013基因通過體外轉(zhuǎn)錄，合成外源線性 ERCC-0004-RNA 和外源線性 ERCC-0013-RNA，包括：
[0051] 采用T7RNA快速高效合成試劑盒（購自于NEB公司，貨號為E2050)轉(zhuǎn)錄合成外源 ERCC-0004-RNA。該試劑盒中的成份包括：無核酸酶的水、含有NTP的緩沖液混合物和T7RNA 聚合酶混合物。反應(yīng)體系中包括：1 μ g上述外源線性ERCC-0004基因的PCR產(chǎn)物、10 μ 1 含有NTP的緩沖液混合物和2 μ I T7RNA聚合酶混合物，加水補足20 μ 1混合均勻，并短暫 離心，經(jīng)37°C保溫2小時后，加入30μ1無酶水和2μ1 DNase 1(購自于NEB公司，貨號為 Μ0303)，混合均勻后，經(jīng)37°C保溫15分鐘，去除DNA模板。再利用Dynabeads mRNA純化試 劑盒（由Life technologies公司生產(chǎn)，貨號為61006)進行純化，并用50 μ 1無核酸酶的 水溶解純化產(chǎn)物，獲得純化的外源線性ERCC-0004-RNA。采用同樣的方法，獲得純化的外源 線性 ERCC-OO13-RNA。
[0052] 4、去除外源線性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并在外源線性 ERCC-0013-RNA的5'端修飾羥基。因體外合成的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端為三磷 酸結(jié)構(gòu)，使得外源線性ERCC-0013-RNA的5'端無法與3'端連接形成環(huán)狀，所以必須去除該 5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，再在5'端加上單磷酸結(jié)構(gòu)，這樣才能使得外源線性ERCC-0013-RNA的 首尾相連成環(huán)狀，具體步驟包括：
[0053] 采用小牛腸堿性磷酸酶（購自于NEB公司，貨號為M0290)去除外源線 性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)。反應(yīng)體系如下：20 μ g純化的外源線性 ERCC-0013-RNA和7U的小牛腸堿性磷酸酶，用水補足20 μ 1后混合均勻，經(jīng)短暫離心，于 37°C保溫1小時，獲得去除5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)的外源線性ERCC-0013-RNA。利用Dynabeads mRNA純化試劑盒（由Life technologies公司生產(chǎn)，貨號為61006)純化去除5'端的三磷 酸結(jié)構(gòu)的外源線性ERCC-0013-RNA，得到5'端為羥基的外源線性ERCC-0013-RNA。
[0054] 5、對5'端修飾羥基的外源線性ERCC-0013-RNA進行磷酸化修飾，合成5'端磷酸 化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA，包括：
[0055] 利用T4PNK激酶（由NEB公司，貨號為M0201)修飾該5'端為羥基的外源線性 ERCC-0013-RNA。隨酶一起提供的有10 X T4PNK激酶緩沖液。在50 μ 1的反應(yīng)體系中，包含如 下成份：1ΧΤ4ΡΝΚ激酶緩沖液、ImM ATP、10U Τ4ΡΝΚ激酶、以及上述獲得的5'端為羥基的外 源線性ERCC-0013-RNA，用水補足至50 μ 1并混合均勻，經(jīng)短暫離心，于37°C保溫30分鐘。 利用Dynabeads mRNA純化試劑盒（由Life technologies公司生產(chǎn)，貨號為61006)進行純 化，操作方法按該試劑盒的說明書進行，獲得5'端磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA。
[0056] 6、將5'端磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端連接，合成外源 環(huán)狀 ERCC-0013-RNA，包括：
[0057] 利用T4RNA連接酶I(NEB公司生產(chǎn)，貨號為M0204)對該5'端磷酸化修飾的外源線 性ERCC-0013-RNA的5'端與3'端進行連接。隨該T4RNA連接酶I 一起提供的成份還包括： 10XT4RNA連接酶反應(yīng)緩沖液、10mMATP、10U/μl的RNA酶抑制劑和PEG8000。在20μl的 反體系中包含如下成份：1XT4RNA連接酶反應(yīng)緩沖液、lOU/μ 1的T4RNA連接酶1μ IUOU/ μ 1的RNA酶抑制劑0. 5 μ 1、濃度為10%的PEG8000、20-50 μ M的ATP和上述獲得的5'端 磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA，用水補足20 μ 1并混合均勻，經(jīng)短暫離心，于PCR儀 中于16°C過夜，經(jīng)95°C 2分鐘終止反應(yīng)，得到外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0058] 純化外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，具體地，向得到的含有外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA 的混合物中加入以下成份：5M的醋酸銨（Life technologies公司生產(chǎn)，貨號為 AM9071) 10 μ 1、無水乙醇200 μ 1和水80 μ 1，混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于-80°C冰箱（海爾 公司生產(chǎn)，型號為DW-86L626)中放置30分鐘；取出后經(jīng)14000rpm，4°C，離心25分鐘，用移 液器的槍頭小心吸去上層清液，向沉淀中加入700 μ 1濃度為70 %的乙醇，用于清洗沉淀， 再經(jīng)14000rpm，4°C，離心5分鐘后吸去上層清液，于室溫下干燥10分鐘，用于去除殘留的乙 醇，再用1〇μ 1無核酸酶的水溶解沉淀，獲得純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0059] 7、采用RNA酶R切掉未環(huán)化成功的外源線性ERCC-0013-RNA。具體步驟包括：
[0060] 在獲得的純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA中，還有部分未環(huán)化成功的外源線性 ERCC-0013-RNA，采用RNA酶R(由Epicentre公司生產(chǎn)，貨號為RNR07250)消化未環(huán)化成功 的外源線性ERCC-0013-RNA。隨該RNA酶R -起提供的還有10 X RNA酶R反應(yīng)緩沖液，向獲 得的純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA中加入2μll0XRNA酶R反應(yīng)緩沖液、lμl20U/μl的 RNA酶R和7 μ 1無核酸酶的水，并混合均勻，經(jīng)短暫離心后于40°C保溫1小時，獲得去除了 外源線狀ERCC-0013-RNA的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
[0061] 8、純化去除了外源線狀ERCC-0013-RNA的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，包括：
[0062] 向獲得的去除了外源線狀ERCC-0013-RNA的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA中加入以下 成份：5M的醋酸銨（Life technologies公司生產(chǎn)，貨號為AM9071) 10 μ 1、無水乙醇200 μ 1 和水80μ 1并混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于-80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號為DW-86L626) 中放置30分鐘，取出后經(jīng)14000rpm，4°C，離心25分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液， 向沉淀中加入700 μ 1濃度為70 %的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng)14000rpm，4°C，離心5分鐘 后吸去上層清液，于室溫下干燥10分鐘，用于去除殘留的乙醇，用50 μ 1無核酸酶的水溶解 沉淀，獲得純化的外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA。
[0063] 步驟200 :對外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行質(zhì)量控制。即使是采用了以上去 除線性ERCC-OO13-RNA的步驟，外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA中仍然可能混有外源線狀 ERCC-0013-RNA，因此需要對外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行質(zhì)量控制。具體步驟包括：
[0064] 1、利用隨機引物對合成的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源 ERCC-OO 13-cDNA，外源 ERCC-OO 13-cDNA 包括外源線性 ERCC-OO 13-cDNA 和外源環(huán)狀 ERCC-0013-cDNA，具體步驟如下：
[0065] 利用分光光度計（美國Quawell公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中RNA定量程序，測定 并獲得上述純化的外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA的質(zhì)量濃度，本發(fā)明實施例提供的外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNARNA 的質(zhì)量濃度為 8. 99ng/y 1。
[0066] 取純化的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA0. 1 μ g，與下列成分混合：5 μ 1濃度為1 μ M的 6堿基隨機逆轉(zhuǎn)錄引物（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、2 μ 1濃度為IOmM 的dNTP、20U的逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Life technologies公司生產(chǎn)，貨號為18064-014)、5 μ 1 濃度為IOOmM的DL-二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT，隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起由美國Life technologies公司提供）和10 μ 15X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液（隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起由美國Life technologies公司提供），用水補足至50 μ 1混勻后，經(jīng)42°C保溫2小時，75°C保溫15分 鐘，使酶失活，合成外源ERCC-OO 13-cDNA。
[0067] 2、利用第一引物和第二引物分別對外源ERCC-0013-cDNA進行實時定量PCR擴增， 第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所 示的第一反向引物，第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引物和如序列 表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，第一引物用于擴增外源線性ERCC-0013-cDNA和外 源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，第二引物用于擴增外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，通過第一引物擴增 獲得C tI值，通過第二引物擴增獲得CT2值。
[0068] 其中，第一引物的擴增產(chǎn)物不跨越外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的環(huán)化連接點，使得 該第一引物可擴增外源線性ERCC-0013-cDNA，又可擴增外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA ;第二引 物或其擴增產(chǎn)物跨越外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的環(huán)化連接點，使得該第二引物只能擴增外 源環(huán)狀 ERCC-OO 13-cDNA。
[0069] 其中，第一引物和第二引物分別在兩個反應(yīng)體系中平行進行，且反應(yīng)體系和反應(yīng) 條件均相同，僅引物不同。具體地，取2μ 1外源ERCC-0013-cDNA、3l·! 1濃度為IyM的第一 引物、10 μ 1定量PCR混合物（由Toyobo公司生產(chǎn)，貨號為QPS-201)和0.4 μ 150倍的ROX 熒光校正染料（由Toyobo公司隨QPS-201 -起提供）混合均勻后，經(jīng)短暫離心，在Life technologies StepOne實時定量PCR儀中按如下擴增程序進行實時定量PCR擴增：95°C 20 秒；95°C 3秒，60°C 20秒，共40個循環(huán)，在每一次循環(huán)的最后一步收集突光信號，該突光信 號的強弱用于衡量表達量的多少。
[0070] 3、通過CtI值和CT2值以及公式2|('「 2_心1] X 100%，計算合成的外源環(huán)狀 ERCC-OO13-RNA的環(huán)化比例，當環(huán)化比例超過90 %時，外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA可以使用。
[0071] 通過第一引物擴增獲得CtI值，該CtI值為21. 55;采用第二引物按同樣的方 法進行擴增，獲得CT2值，該CT2值為21. 45。將CtI值和CT2值代入公式計算外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA 的環(huán)化比例為 Q1ri2-cilI X 1〇〇% =2丨21.45-2155I X 100% =93.30%。若外 源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA的環(huán)化比例超過90%，該外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA可以使用，否則， 該外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA不能使用，需重新制備外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。其中，90%的 環(huán)化比例作為外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA合格的標準僅作為經(jīng)驗值，該比例可根據(jù)具體情況 作出調(diào)整。
[0072] 步驟300 :將外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按摩爾比1:1混 合，得到混合外源RNA。具體操作如下 ：
[0073] 利用Qubit RNA分析試劑盒（由Life technologies公司生產(chǎn)，貨號為Q32852) 測定外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA的質(zhì)量濃度，測定方法按該試 劑盒的說明書進行。在本發(fā)明實施例中，檢測獲得的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán) 狀ERCC-0013-RNA的質(zhì)量濃度分別為13393pg/l·! 1和5298pg/l·! 1。利用網(wǎng)站工具（網(wǎng) tit % ：http://www. basic, northwestern, edu/biotools/oli gocalc.html)計算夕卜源線 性 ERCC-0004-RNA 和外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA 的分子量分別為 168246. 6 和 262445. 9， 通過分子量分別計算外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的摩爾濃度分 別為79603. 39pM和20187. 02pM，由此計算，若要求外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，那么，二者混合的體積比應(yīng)該為I :3. 94。具體地，取外 源線性ERCC-0004-RNA10y 1與外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA39. 4μ 1混合均勻后，經(jīng)短暫離 心，獲得混合外源RNA。計算得到該混合外源RNA的摩爾濃度為32214. 62ρΜ，質(zhì)量濃度為 6936.66pg/μ 1。
[0074] 步驟400 :向待測序樣本（萊茵衣藻）的總RNA中加入該混合外源RNA，總RNA 與混合外源RNA的質(zhì)量比為2000:1，得到第一混合物。該第一混合物中既有外源環(huán)狀 ERCC-OO13-RNA，又有外源線性ERCC-0004-RNA，模擬了內(nèi)源環(huán)狀RNA與內(nèi)源線狀RNA。 1/2000的混合比例既保證了有足夠的外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA 可以檢測，又不至于添加過多外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，占用測 序通量，以至于浪費高通量測序的檢測成本。具體步驟包括：
[0075] 1、提取萊茵衣藻的總RNA :
[0076] 取正常生長和低溫脅迫條件下處于對數(shù)生長期的萊茵衣藻5ml，且所取的萊茵衣 藻的數(shù)目少于4000萬個，若超過4000萬個，則相應(yīng)減少取樣體積，反之增加。4000rpm常溫 離心1分鐘，倒去上層的培養(yǎng)液后，利用Trizol試劑（由Life technologies公司生產(chǎn)，貨 號為15596-018)提取萊茵衣藻的總RNA并溶解于50 μ 1無核酸酶的水中，總RNA的提取與 純化的方法按照Trizol試劑的操作手冊進行。
[0077] 利用分光光度計（分光光度計由美國Quawell公司生產(chǎn)，型號為Q5000)中RNA定 量程序，測定并獲得上述提取的萊茵衣藻的總RNA的質(zhì)量濃度。在本實施例中，獲得的正常 和脅迫的萊茵衣藻的總RNA的質(zhì)量濃度分別為I. 52 μ g/μ 1和0.98 μ g/μ 1。由此計算，提 取的萊茵衣藻的總RNA的量分別為76 μ g和49 μ g。
[0078] 2、向提取的萊茵衣藻總RNA中加入混合外源RNA，包括：
[0079] 總RNA與混合外源RNA的質(zhì)量比為2000:1，具體地，向正常的萊茵衣藻的總RNA中 加入38ng混合外源RNA，向脅迫的萊茵衣藻的總RNA中加入24. 5ng混合外源RNA，根據(jù)混合 外源RNA的質(zhì)量濃度（6936. 66pg/ μ 1)計算，應(yīng)加入的混合外源RNA的體積分別為5. 48 μ 1 和3. 53 μ 1，加入后混合均勻，經(jīng)短暫離心，得到第一混合物，分別記正常的樣本為Ν1，脅迫 處理的樣本為Tl。
[0080] 步驟500 :去除第一混合物（NI和Tl)中的核糖體RNA，得到第二混合物（N2和 T2)。總RNA中絕大部分都是核糖體RNA (>95 % )，該核糖體RNA不是環(huán)狀的RNA，因此，需要 消除。具體操作如下：
[0081] 利用植物核糖體RNA去除試劑盒（由Epicentre公司生產(chǎn)，貨號為MRZPL116-6) 去除第一混合物中的核糖體RNA。
[0082] 該試劑盒包括：RNA酶抑制劑（100U/ μ 1)、核糖體RNA去除液、反應(yīng)緩沖液、糖原 (10mg/ml)、醋酸鈉（3Μ)、無核酸酶的水、磁珠和磁珠懸浮液。
[0083] 磁珠預處理：取225 μ 1磁珠，置于磁架上，并在室溫下靜置1分鐘，用225 μ 1無核 酸酶的水清洗一次，用225 μ 1無核酸酶的水再清洗一次，將磁珠振蕩懸浮于60 μ 1磁珠磁 浮液中，再加入1 μ 1糖原，得到經(jīng)過預處理的磁珠。
[0084] 樣品預處理：在40 μ 1的反應(yīng)體系中，加入以下成分：5 μ g第一混合物、8-10 μ 1 核糖體RNA去除液和4 μ 1反應(yīng)緩沖液，用水補足40 μ 1，混勻后經(jīng)短暫離心，68°C保溫10分 鐘，取出后室溫放置5分鐘，得到經(jīng)過預處理的樣品混合物。
[0085] 去除核糖體RNA :向經(jīng)過預處理的磁珠中加入經(jīng)過預處理樣品混合物，用移液器 的槍頭吹打幾次混勻，經(jīng)短暫離心，于室溫下保溫5分鐘，進行渦旋震蕩，50°C保溫5分鐘， 置于磁架上，于室溫下靜置1分鐘，取上清液至另一離心管中，即為去除核糖體RNA的混合 物。
[0086] 純化樣品：將去除核糖體RNA的混合物的體積用無核酸酶的水補足至180 μ 1，并 加入以下成份：3Μ的醋酸銨10 μ 1、糖原2 μ 1，無水乙醇600 μ 1，混合均勻，經(jīng)短暫離心，置 于-80°c冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號為DW-86L626)中放置30分鐘，14000rpm，4°C，離心25 分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液，再加入700 μ 1濃度為70 %的乙醇，用于清洗沉 淀，再經(jīng)14000rpm，4°C，離心5分鐘后去除上層清液，于室溫下干燥10分鐘，用于去除殘留 的乙醇，用10 μ 1無酶水溶解沉淀，獲得純化的去除了核糖體RNA的第一混合物，即第二混 合物（Ν2和Τ2)。
[0087] 步驟600 :對第二混合物（Ν2和Τ2)進行3'末端生物素標記，并用鏈霉親和素磁 珠去除被標記上生物素的套索RNA及線性RNA，線性RNA包括總RNA中的內(nèi)源線性RNA和 外源線性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物（Ν3和Τ3)，同時，回收未被標記上生物素的環(huán)狀 RNA分子。在第二混合物中，混雜著各種類型的RNA，包括線性RNA、環(huán)狀RNA、套索RNA及其 它具有特殊結(jié)構(gòu)的RNA。套索RNA類似于環(huán)狀RNA而功能卻不同于環(huán)狀RNA的分子，它由基 因間的內(nèi)含子區(qū)形成，結(jié)構(gòu)類似于環(huán)狀，但是在其首尾相連的位置有一段裸露的3'端，形似 套索。在現(xiàn)有環(huán)狀RNA測序的方法中，總RNA經(jīng)核酸外切酶R消化之后，將套索RNA的3' 尾巴一并切除，形成一個完整的環(huán)，混入環(huán)狀RNA中，導致在測序之前無法將環(huán)狀RNA和套 索RNA分離，造成測序數(shù)據(jù)的浪費。這是現(xiàn)有環(huán)狀RNA測序方法的一個明顯的不足之處。
[0088] 針對環(huán)狀RNA與其它RNA在結(jié)構(gòu)上的差異，即環(huán)狀RNA為一個封閉的環(huán)狀，無裸露 的5'和3'末端，而線性RNA和套索RNA有裸露的3'末端。因此，通過將3'末端標記上生 物素，然后利用鏈霉親和素與生物素之間的高度親和力，通過鏈霉親和素磁珠進行捕獲，將 線性RNA和套索RNA從第二混合物中去除。具體包括：
[0089] 利用3'末端生物素標記用試劑盒（貨號20160,購自美國Thermo公司），完成對第 二混合物的標記，具體方法如下：將第二混合物（N2和T2)真空濃縮至5 μ 1，向濃縮液中加 入濃縮體積的25 %的二甲基亞砜1. 25 μ 1，于85°C金屬浴上變性5分鐘，立即置冰上，同時， 在冰上配制混合物，該混合物包括：變性后的濃縮液，3 μ IlOX連接反應(yīng)緩沖液，1 μ 1核酸 酶抑制劑，1 μ 1磷酸二異辛酯，2 μ I T4RNA連接酶，15 μ 130%聚乙二醇，3 μ 1無核酸酶的 水，總體積30 μ 1，混合均勻后，16°C保溫過夜，得到過夜產(chǎn)物。
[0090] 向過夜產(chǎn)物中加入50μ 1結(jié)合緩沖液（該結(jié)合緩沖液包括：0. 5M NaCl、20mM Tris-HCl (PH7. 5)和ImM EDTA)，于65°C金屬浴上變性5分鐘，立即置冰上3分鐘，得到變 性后的過夜產(chǎn)物。取100 μ 1鏈霉親和素磁珠（貨號S1420,購自NEB公司）于I. 5ml離心 管中，加入100 μ 1結(jié)合緩沖液，混勻，將離心管置磁架上分離1分鐘，去除上清液，取下離心 管，加入100 μ 1結(jié)合緩沖液，混勻，將離心管置磁架上分離1分鐘，去除上清液，取下離心 管，將變性后的過夜產(chǎn)物加入到該離心管中，混勻，室溫孵育20分鐘，并不時混勻。將離心 管置磁架上分離1分鐘，收集上清液至另一新離心管中，約50 μ 1，即為去除被標記上生物 素的套索RNA及線性RNA，得到第三混合物。
[0091] 純化去除被標記上生物素的套索RNA及線性RNA，采用乙醇沉淀的方法進行純化， 具體方法如下：向上述去除被標記上生物素的套索RNA及線性RNA的第三混合物中加入以 下成份：130 μ 1無核酸酶的水，3Μ的醋酸銨18 μ l、10mg/ml的糖原2 μ 1，無水乙醇600 μ 1， 混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于_80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號為DW-86L626)中放置30分 鐘，14000rpm，4°C，離心25分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清液，加入700μ 1濃度為 70 %的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng)14000rpm，4°C，離心5分鐘后去除上層清液，于室溫下干 燥10分鐘，用于去除殘留的乙醇，用1〇μ 1無核酸酶的水溶解沉淀，獲得了純化的去除了被 標記上生物素的套索RNA及線性RNA的第三混合物。
[0092] 步驟700 :進一步去除第三混合物（Ν3和Τ3)中殘留的線性RNA，得到第四混合物 (Ν4和Τ4)。經(jīng)過3'末端標記及鏈霉親和素磁珠捕獲去除非環(huán)狀RNA之后的第三混合物中 仍然會殘留一部分線性的RNA，因此需要有針對性的處理線性的RNA分子，具體包括：
[0093] 利用核酸外切酶R(貨號為RNR07250,購自Epicentre公司）能夠酶切消化線性 RNA的特性，去除第三混合物中殘留的線性RNA。隨核酸外切酶R -起提供的還有10 X RNA 酶R反應(yīng)緩沖液。向純化后第三混合物中加入2 μ 110 X RNA酶R反應(yīng)緩沖液、1 μ 120U/μ 1 的RNA酶R和無核酸酶的水7 μ 1，混合均勻，經(jīng)短暫離心后40°C保溫1小時，得到了去除殘 留的線性RNA的第三混合物。
[0094] 純化去除殘留的線性RNA的第三混合物：將上述去除殘留的線性RNA的第三混 合物用無核酸酶的水補足至180 μ 1，并加入以下成份：3M的醋酸銨10 μ 1，10mg/ml的糖 原2μ 1，無水乙醇600μ 1，混合均勻，經(jīng)短暫離心，置于-80°C冰箱（海爾公司生產(chǎn)，型號為 DW-86L626)中放置30分鐘，14000rpm，4°C，離心25分鐘，用移液器的槍頭小心吸去上層清 液，加入700 μ 1濃度為70%的乙醇，用于清洗沉淀，再經(jīng)14000rpm，4°C，離心5分鐘后去除 上層清液，于室溫下干燥10分鐘，用于去除殘留的乙醇，用1〇μ 1無核酸酶的水溶解沉淀， 獲得了純化的去除了殘留的線性RNA的第三混合物，即第四混合物（M和Τ4)。
[0095] 步驟800 :對第四混合物進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序。如圖2所示，設(shè)置對照組，將萊 茵衣藻按現(xiàn)有的環(huán)狀RNA測序方法進行平行測序。該方法包括：
[0096] 步驟101 :提取萊茵衣藻總RNA ;步驟201 :向萊茵衣藻總RNA中按2000:1的質(zhì)量 比加入混合外源RNA，得到第一混合物；步驟301 :去除第一混合物中的核糖體RNA，得到第 二混合物；步驟401 :去除第二混合物中的線性RNA，該線性RNA包括總RNA中的內(nèi)源線性 RNA和外源線性ERCC-0004-RNA，得到混合物CKl ;該混合物CKl與本發(fā)明實施例提供的第 四混合物（M和Τ4)均按標準的高通量Proton轉(zhuǎn)錄組測序方法進行測序。本發(fā)明實施例 中每個樣本測序的總數(shù)據(jù)量均為IOM。
[0097] 對測序數(shù)據(jù)進行生物學分析，其中測序數(shù)據(jù)從以下幾個方面分析：通過分析第四 混合物M (脅迫處理的樣本）中外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA在測 序數(shù)據(jù)中的絕對量，評估文庫質(zhì)量。具體地，本發(fā)明實施例提供的第四混合物M中外源線 性 ERCC-0004-RNA 的 Reads 數(shù)分別為 506,外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA 的 Reads 數(shù)為 5672,而 外源混合RNA中外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA是按等摩爾比混合 的，由此可見，該文庫的制備方法能夠有效去除線性RNA分子。
[0098] 以外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA為參考，分析待測序樣本中的環(huán)狀RNA基因表達變化， 具體地，分析正常生長和低溫脅迫下的兩個樣本中的外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的表達變化 倍數(shù)，根據(jù)此變化倍數(shù)，計算內(nèi)源環(huán)狀RNA的表達差異。具體地，分析正常生長和低溫脅迫 下的兩個樣本中某個特定的環(huán)狀RNA基因相對外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的表達變化倍數(shù)， 分析低溫脅迫對基因表達水平的影響。在第四混合物M和T4的測序結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)了特定 的環(huán)狀RNA基因 circ_000026環(huán)狀RNA基因的表達。其中，在第四混合物M中外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA 的 Reads 數(shù)為 5672, circ_000026 的 Reads 數(shù)為 1146 ;在第四混合物 T4 中外 源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的Reads數(shù)為4218, circ_000026的Reads數(shù)為350 ;由此計算該環(huán) 狀RNA circ_000026在低溫脅迫條件下表達量相對正常生長下的變化倍數(shù)為（350/4218)/ (1146/5672) = 0. 41，即在低溫脅迫條件下環(huán)狀RNA基因 circ_000026表達下調(diào)了 1/0. 41 =2. 4倍。以此可以類推分析其它環(huán)狀RNA的表達變化倍數(shù)，從而可以進一步分析脅迫條 件下環(huán)狀RNA的調(diào)控機制。
[0099] 此外，對比分析本發(fā)明實施例獲得的第四混合物M與現(xiàn)有方法獲得的混合物CKl 測序數(shù)據(jù)中環(huán)狀RNA的數(shù)據(jù)量。本發(fā)明實施例的測序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學分析之后的結(jié)果見 表1，混合物CKl測序的結(jié)果中，環(huán)狀RNA獲得的reads比例是0. 0056%，而第四混合物N4 獲得的reads比例是0.0787%，對比之下，本發(fā)明實施例提供的方法能夠?qū)颖局械姆黔h(huán) 狀RNA進一步去除，使得環(huán)狀RNA的有效測序數(shù)據(jù)量提高了 14倍，由此可證明本發(fā)明實施 例所用的方法能顯著的將樣本中的環(huán)狀RNA進一步富集，這將大幅度降低環(huán)狀RNA測序數(shù) 據(jù)量，降低成本，減少人力物力的浪費。
[0100] 表1.混合物CKl和第四混合物M的測序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學分析
[0101]

【權(quán)利要求】
1. 一種高通量環(huán)狀RNA測序的方法，其特征在于，所述方法包括： 人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA ; 對所述外源環(huán)狀ERCC-OO13-RNA進行質(zhì)量控制； 將所述外源線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，得 到混合外源RNA ; 向待測序樣本的總RNA中加入所述混合外源RNA，所述總RNA與所述混合外源RNA的質(zhì) 量比為2000:1，得到第一混合物； 去除所述第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物； 對所述第二混合物進行3'末端生物素標記，并去除被標記上生物素的套索RNA及線性 RNA，所述線性RNA包括所述總RNA中的內(nèi)源線性RNA和所述外源線性ERCC-0004-RNA，得到 第三混合物； 去除所述第三混合物中殘留的所述線性RNA，得到第四混合物； 對所述第四混合物進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序并對測序數(shù)據(jù)進行生物學分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和 外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA，包括： 選擇外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表 中SEQ ID NO: 1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO:2所示； 將所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分別克隆到原核表達載體中， 分別獲得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因； 將獲得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因進行體外 轉(zhuǎn)錄，分別合成所述外源線性ERCC-0004-RNA和外源線性ERCC-0013-RNA ; 去除所述外源線性ERCC-0013-RNA的5'端的三磷酸結(jié)構(gòu)，并將所述外源線性 ERCC-0013-RNA的5'端修飾羥基； 對5'端修飾羥基的所述外源線性ERCC-0013-RNA進行磷酸化修飾，合成5'端經(jīng)磷酸 化修飾的所述外源線性ERCC-0013-RNA ; 將所述5'端經(jīng)磷酸化修飾的外源線性ERCC-0013-RNA的5'端和3'端連接； 去除未環(huán)化成功的所述外源線性ERCC-0013-RNA，得到所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述待測序樣本的基因中不存在與所述 外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源性高的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，對所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行質(zhì)量 控制，包括： 利用隨機引物對所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成外源 ERCC-OO13-cDNA，所述外源ERCC-OO13-cDNA包括外源線性ERCC-OO13-cDNA和外源環(huán)狀 ERCC-OO13-cDNA ； 利用第一引物和第二引物分別對所述外源ERCC-OO13-cDNA進行實時定量PCR擴增， 所述第一引物包括如序列表中SEQ ID N0:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID N0:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ ID N0:5所示的第二正向引 物和如序列表中SEQ ID N0:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于擴增所述外源線性 ERCC-0013-cDNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于擴增所述外源環(huán)狀 ERCC-OO13-cDNA，通過所述第一引物擴增獲得CtI值，通過所述第二引物擴增獲得CT2值； 通過CtI值和CT2值以及公式2[Gt2_ &1] X 100%，計算合成的所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA的環(huán)化比例，并選用環(huán)化比例超過90%的所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的線 性 RNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，向所述待測序樣本的總RNA中，加入所述 混合外源RNA，所述總RNA與所述混合外源RNA的質(zhì)量比為2000:1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R去除未環(huán)化成功的所述外源 線性 ERCC-OO13-RNA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用鏈霉親和素磁珠去除被標記上所述 生物素的套索RNA及所述線性RNA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物學分析包括：獲得所述外源 線性ERCC-0004-RNA和所述外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA的相對比例、以及以所述外源環(huán)狀 ERCC-0013-RNA為參考分析所述待測序樣本中的環(huán)狀RNA基因表達變化。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388548SQ201410604748
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】周俊飛, 高利芬, 陳利紅, 李麗麗, 彭海, 張繼, 方治偉 申請人:江漢大學