一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應(yīng)用。該棲木槿假單胞菌DT1保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO.M2014244。該棲木槿假單胞菌DT1在含有四環(huán)素的環(huán)境中具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力和良好的降解四環(huán)素的能力，該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)有效去除廢水中的四環(huán)素，去除效率達(dá)到83.21wt%。本發(fā)明為降解四環(huán)素類(lèi)有機(jī)污染物提供了有用的菌源，拓寬了對(duì)棲木槿假單胞菌功能方面的應(yīng)用，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。CCTCC NO：M 201424420140604
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]四環(huán)素類(lèi)抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類(lèi)廣譜抗生素，其結(jié)構(gòu)均含有并四苯基本骨架。四環(huán)素類(lèi)抗生素是目前世界上使用最廣泛、用量最大的抗生素種類(lèi)之一，近些年來(lái)，四環(huán)素類(lèi)抗生素在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中作為獸藥和飼料添加劑被大量使用，然而這些抗生素未被完全吸收，大部分通過(guò)原藥和代謝產(chǎn)物的形式排除，其中80%的糞便未經(jīng)綜合處理施用于農(nóng)田，造成土壤污染。四環(huán)素類(lèi)抗生素進(jìn)入土壤環(huán)境后，通過(guò)吸附和分配作用長(zhǎng)期存在于土壤環(huán)境中?？股卦诃h(huán)境中持續(xù)暴露對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng):抑制微生物的生長(zhǎng)代謝，誘發(fā)微生物抗性基因污染，破壞土壤中土著微生物群落結(jié)構(gòu)及功能，抑制植物葉綠體活性和根系生長(zhǎng)等。四環(huán)素對(duì)生態(tài)和人類(lèi)健康的危害成為人們普遍關(guān)注的對(duì)象和研究的熱點(diǎn)，其相關(guān)研究也得到越來(lái)越多的重視。
[0003]四環(huán)素的降解途徑主要包括水解、光解和生物降解，其中，微生物降解是四環(huán)素的主要降解途徑，也是重要的驅(qū)動(dòng)力之一。在微生物與污染物交互作用中，生物酶是污染物降解過(guò)程的直接參與者。微生物通過(guò)各類(lèi)生物酶的作用將抗生素降解轉(zhuǎn)化為能源物質(zhì)或者對(duì)自身無(wú)毒害作用的其他代謝產(chǎn)物。因此，篩選到合適的高效的降解菌株顯得尤為重要。利用微生物酶的催化作用來(lái)處理有機(jī)污染物能有效的降低有毒有機(jī)污染物的含量，同時(shí)還能降低其毒性，因此，微生物降解是一種很有潛力的處理有機(jī)污染物的方法，在工業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)方面具有很高的推廣價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌及其應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種水體四環(huán)素污染物降解菌，經(jīng)鑒定命名為棲木槿假單胞菌DT1，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014年6月4，保藏號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2014244。
[0007]該菌株的菌落形態(tài)特征以及生理生化特性為:菌落呈黃色、不透明、圓形、表面光滑，中間隆起、邊緣整齊；需氧，革蘭氏陰性菌，硝酸鹽可以還原成亞硝酸鹽；接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，脲酶陽(yáng)性；MR陽(yáng)性，VP陰性；不產(chǎn)硫化氫，不能淀粉水解；能利用葡萄糖等碳源；最適生長(zhǎng)pH值:6.5?9,最適生長(zhǎng)溫度:25?35°C。
[0008]上述棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物中的應(yīng)用。
[0009]按上述方案，所述棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物的應(yīng)用方法為:(I)挑取棲木槿假單胞菌DTl單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取棲木槿假單胞菌DTl菌液，將菌液以體積百分比為0.5%?2%的比例接種于含四環(huán)素污染物的廢水中，pH值調(diào)節(jié)為6?9，置于30?35°C的條件下恒溫培養(yǎng)48?72小時(shí)。
[0010]本發(fā)明的有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述棲木槿假單胞菌DTl在含有四環(huán)素污染物的環(huán)境中具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力和良好的降解四環(huán)素的能力，該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)有效降解廢水中的四環(huán)素有機(jī)污染物，降解率達(dá)到83.21wt%。本發(fā)明為降解四環(huán)素有機(jī)污染物提供了有用的菌源，同時(shí)拓寬了對(duì)棲木槿假單胞菌功能方面的應(yīng)用，因此具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為棲木槿假單胞菌DTl的16S rDNA分子鑒定過(guò)程中PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(左為Marker ;右為擴(kuò)增產(chǎn)物)。
[0012]圖2為棲木槿假單胞菌DTl的發(fā)育樹(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0013]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)例。
[0014]實(shí)施例1棲木槿假單胞菌DTl的篩選:
[0015](一)、材料準(zhǔn)備:
[0016]1、實(shí)驗(yàn)土壤為模擬四環(huán)素污染的土壤，取自中國(guó)地質(zhì)大學(xué)。
[0017]2、培養(yǎng)基:
[0018]篩選培養(yǎng)基:10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，0.5g/L磷酸氫二鉀，1.5g/L瓊脂，pH值7。
[0019]液體富集培養(yǎng)基:10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，0.5g/L磷酸氫二鉀，pH值7。
[0020]LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,氯化鈉10.0g/L,蒸餾水100mL,ρΗ7.0。
[0021]LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,氯化鈉10.0g/L,蒸餾水100mL,瓊月旨 15g/L(固)，ρΗ7.0。
[0022]LB斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g/L,酵母提取物5.0g/L,氯化鈉10.0g/L,蒸餾水100mL,瓊脂 20g/L(固)，ρΗ7.0。
[0023]3、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備:
[0024]國(guó)華SHA-B恒溫振蕩器，
[0025]東器SPX生化培養(yǎng)箱，
[0026]立式壓力蒸汽滅菌器，
[0027]光學(xué)顯微鏡-----Olympus有限公司，
[0028]pH 計(jì)等-----sarporiusPD-10
[0029]超凈工作臺(tái)，
[0030]PTC200 型 PCR 儀，
[0031]電泳儀及電泳槽，
[0032]UVP凝膠紫外觀測(cè)儀。
[0033]( 二 )、菌株的篩選分離與純化:
[0034]1、稱取I克四環(huán)素污染土壤樣品，加入事先滅菌好的裝有10mL無(wú)菌水的250mL的三角瓶?jī)?nèi)，30°C、200rpm振蕩20min，備用；
[0035]2、配置濃度為1000mg/L的四環(huán)素母液，微濾除菌后，備用；
[0036]3、將10ul四環(huán)素母液加入20ml 50°C的篩選培養(yǎng)基中，搖勻并倒入無(wú)菌平板上，待培養(yǎng)基冷卻，即得到含50mg/L四環(huán)素的篩選培養(yǎng)基平板，將土壤水混合物樣品在含50mg/L四環(huán)素的篩選培養(yǎng)基平板上劃線分離，30°C恒溫培養(yǎng)幾天，直至有菌落出現(xiàn)；
[0037]4、將平板上的不同菌落分別在含50mg/L四環(huán)素的篩選培養(yǎng)基平板上劃線分純，30°C恒溫培養(yǎng)，反復(fù)劃線操作4-5次。
[0038]5、分別將不同平板上的單菌落挑入到液體富集培養(yǎng)基中，30°C恒溫震蕩培養(yǎng)2d，再以1%接種量加入含50mg/L四環(huán)素的液體富集培養(yǎng)基中(取2.5ml四環(huán)素母液加入到47.5ml液體富集培養(yǎng)基中得到含50mg/L四環(huán)素的液體富集培養(yǎng)基)，30°C避光震蕩培養(yǎng)3d，測(cè)定培養(yǎng)基中四環(huán)素含量，淘汰不能降解四環(huán)素的菌株，得到一株能高效降解四環(huán)素的菌株，將此菌株置于甘油管中_20°C條件下冷凍保藏。
[0039]二、菌株的16S rDNA分子鑒定:
[0040]16S rDNA分子鑒定主要按照以下步驟:
[0041](I)細(xì)菌核DNA的提取
[0042]使用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，
[0043](2) 16S rDNA 基因的 PCR 擴(kuò)增，
[0044]由上海桑尼生物工程有限公司合成細(xì)菌的通用引物
[0045]27F: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
[0046]1492R: 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
[0047]在50yL 反應(yīng)體積中，加入 IyL 模板 DNA(0.lyg)，L5yL 27F 和 1492R(終濃度為 10μΜ)，1μ? dNTP(lOmM)，I μ LTaq 聚合酶(5U/y L)和 5μ L 10XPCR 緩沖液，39 μ L ddH20。PCR 擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min ;在 95°C變性 30s，58。。退火 30s，72。。延伸lmin30s，循環(huán)35次；最后72°C終延伸1min0
[0048](3) PCR產(chǎn)物的回收
[0049]將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后(擴(kuò)增帶長(zhǎng)度為1412bp，如圖1所示)，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5mL離心管中加2倍體積TE，65°C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的lOmol/L乙酸銨和2倍體積無(wú)水乙醇沉淀，離心，用濃度為70%乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。(4)16S rDNA的序列的測(cè)定和分析
[0050]取菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用測(cè)序儀ABI3730-XL進(jìn)行DNA測(cè)序，其序列見(jiàn)SEQID NO:1。測(cè)得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析，該菌株與棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)的同源性高達(dá)99.0%,最終從分子水平上確定該菌的種屬為棲木槿假單胞菌。
[0051]三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性:
[0052]棲木槿假單胞菌DTl的菌落形態(tài)為:菌落呈黃色、不透明、圓形、表面光滑，中間隆起、邊緣整齊；需氧，革蘭氏陰性菌；硝酸鹽可以還原成亞硝酸鹽；接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，脲酶陽(yáng)性；MR陽(yáng)性，VP陰性；不產(chǎn)硫化氫，不能淀粉水解；能利用葡萄糖等碳源；最適生長(zhǎng)pH值:6.5?9，最適生長(zhǎng)溫度:25?35°C。
[0053]綜合菌株的分子鑒定結(jié)果以及生理生化特性，確定該菌株為棲木槿假單胞菌，并命名為棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)DTl。棲木槿假單胞菌DTl的發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。從圖2可以看到，菌株DTl的16S rDNA序列和假單胞菌屬的細(xì)菌歸屬于同一簇群，同源性在99%以上，且菌株DTl與Pseudomonas hibiscicola聚在一起，證明DTl菌株為棲木槿假單胞菌。查閱有關(guān)資料，尚無(wú)此菌株有關(guān)降解四環(huán)素能力研究的報(bào)道。棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)DTl,已于2014年6月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱 CCTCC)，保藏號(hào):CCTCC N0:M 2014244。
[0054]本發(fā)明從模擬四環(huán)素長(zhǎng)期污染土壤中篩選分離出這一株細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解四環(huán)素的功能。這拓寬了人們對(duì)棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為環(huán)境中四環(huán)素污染的降解提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0055]四、棲木槿假單胞菌DTl的應(yīng)用:
[0056]挑取棲木樓假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola) DTl單菌落于LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，待平板菌落長(zhǎng)出后挑選單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，按體積分?jǐn)?shù)比為
0.5%-2%的接種量將棲木槿假單胞菌(Pseudomonas hibiscicola)的種子液接種至含有四環(huán)素類(lèi)污染物的模擬污水中，30?35°C恒溫培養(yǎng)，pH值為6.5?9，反應(yīng)48?72小時(shí)。
[0057]五、棲木槿假單胞菌DTl降解四環(huán)素污染物的能力驗(yàn)證:
[0058]分別挑取棲木槿假單胞菌DTl單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，取0.5mL菌液接種于裝有50mL四環(huán)素模擬污水中(其四環(huán)素含量為50mg/L)的三角瓶中，留一瓶作空白對(duì)比。置于30°C、150rpm振蕩培養(yǎng)3d，檢測(cè)四環(huán)素殘留量計(jì)算菌株對(duì)四環(huán)素去除情況。該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)有效去除四環(huán)素模擬污水中的四環(huán)素，其去除率為83.21wt%。
[0059]顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的實(shí)例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限制。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種降解水體四環(huán)素污染物的棲木槿假單胞菌DT1，其特征在于，保藏號(hào)為CCTCCNO: M 2014244。
2.權(quán)利要求1所述的棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述棲木槿假單胞菌DTl在降解水體四環(huán)素污染物中的應(yīng)用方法為:(I)挑取棲木槿假單胞菌DTl單菌落，于LB液體養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；(2)取棲木槿假單胞菌DTl菌液，將菌液以體積百分比為0.59Γ2%的比例接種于含四環(huán)素污染物的廢水中，pH值調(diào)節(jié)為6?9，置于3(T35°C的條件下恒溫培養(yǎng)48?72小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104403965SQ201410610014
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】冷一非, 鮑建國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（武漢）