一種四環(huán)素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種四環(huán)素的制備方法，具體為將金色鏈霉菌菌種制備后先進(jìn)行種子搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至20～26小時(shí)，轉(zhuǎn)為發(fā)酵培養(yǎng)。待pH值達(dá)5.6～7.6，總效價(jià)≥8000U/mL，總糖含量≤2.0％，氨基氮>50mg/100mL，濾速≥5mL/5min時(shí)，發(fā)酵結(jié)束并放罐。最后進(jìn)行板框過(guò)濾，離子交換樹脂脫色，結(jié)晶，氣流干燥，制得四環(huán)素。本發(fā)明所述方法發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，能有效提高發(fā)酵單位，提高收率，降低生產(chǎn)成本，同時(shí)避免了化學(xué)有機(jī)溶劑的使用。
【專利說(shuō)明】-種四環(huán)素的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種抗生素的制備方法，具體涉及一種四環(huán)素的 制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 四環(huán)素是從放線菌、金色鏈霉菌等的培養(yǎng)液分離出來(lái)的抗菌物質(zhì)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性 菌、陰性菌、立克次體、濾過(guò)性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，其主要作 用機(jī)理為破壞細(xì)菌聚核糖體形成，干擾蛋白質(zhì)合成，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，屬于一種廣譜抗菌 素。隨著生物制藥領(lǐng)域?qū)λ沫h(huán)類抗生素研究的深入，以鹽酸四環(huán)素為核心的四環(huán)類抗生素 種類日益增多，作為大宗基礎(chǔ)原料藥，鹽酸四環(huán)素的研究日益深入，在市場(chǎng)激烈的競(jìng)爭(zhēng)下， 提高發(fā)酵水平，提高精制收率成為研究核心。然而現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于四環(huán)素的制備方法存在下 述缺點(diǎn)：使用到易燃易爆且存儲(chǔ)成本較高的有機(jī)試劑；設(shè)備投入大，生產(chǎn)成本高，收率低， 經(jīng)濟(jì)效益低；制備過(guò)程中反復(fù)加水稀釋、酸化，導(dǎo)致酸化時(shí)間長(zhǎng)，易產(chǎn)生差向異構(gòu)體，從而嚴(yán) 重影響產(chǎn)品質(zhì)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種四環(huán)素的制備方法該方法能有效提高發(fā)酵單位，降低 生產(chǎn)成本。
[0004] 本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下：
[0005] -種四環(huán)素的制備方法，包括以下步驟：
[0006] a?種子培養(yǎng)
[0007] 1)菌種制備
[0008] 將金色鏈霉菌孢子接種到含有孢子培養(yǎng)基的母斜面上并在34±0.5°C下培養(yǎng) 3. 5?5天；然后再接種到含有孢子培養(yǎng)基的子斜面上，在34±0. 5°C下培養(yǎng)3?5天，至孢 子成熟；
[0009] 所述孢子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：麩皮3.0?3. 4%， MgS040 . 00 5 ±0. 001 %，（NH4)2HP040 . 0 1 5 ±0. 005 %，KH2P040. 01±0. 002 %，瓊脂粉 1. 8 ? 2. 2%，余量為水；
[0010] 2)種子罐培養(yǎng)
[0011] 將制備的孢子轉(zhuǎn)至種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30?33°C，通氣量為1:1. 5?2. 0v/ v/min，罐壓為0. 03?0. 05MPa，攪拌速度為150?230rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間為20?26小時(shí)；
[0012] 所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉3. 0? 5. 0 %，花生餅粉0?4 %，黃豆餅粉0?4 %，酵母粉0?2 %，玉米漿0?0. 8 %，碳酸鈣 0? 2?0? 6 %，硫酸銨0? 2?0? 6 %，溴化鈉0?0? 3 %，硫酸鎂0? 02?0? 04 %，磷酸二氫鉀 0. 01?0. 06%，淀粉酶0?0. 05%，植物油或豆油0?0. 6%，消泡劑0?0. 6%，余量為 水；
[0013] b?發(fā)酵培養(yǎng)
[0014] 種子罐培養(yǎng)完畢后轉(zhuǎn)為發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：罐內(nèi)溫度28?33°C，通氣量 1: 0? 8 ?1:1.Ov/v/min，罐壓 0? 02 ?0? 05MPa，攪拌速度 120 ?180rpm/min，pH值 5. 6 ? 6. 2,發(fā)酵時(shí)間> 80小時(shí)；發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百分濃度〈3. 5%時(shí)，加入補(bǔ)料培養(yǎng) 基；發(fā)酵結(jié)束前，依據(jù)發(fā)酵液總糖濃度確定添加補(bǔ)料量，確保發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百 分濃度不高于2% ;
[0015] 發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉0?8. 0%，花生餅粉 0?4. 0%，黃豆餅粉0?5. 0%，酵母粉0?2. 0%，玉米漿0?1. 8%，碳酸鈣0? 4?0? 7%， 硫酸銨0.5?1.0%，溴化鈉0? 1?0.4%，硫酸鎂0?0.03%，磷酸二氫鉀0?0.03%，淀 粉酶0?0. 08 %，植物油或豆油0?0. 3 %，消泡劑0?0. 6 %，余量為水；
[0016] 補(bǔ)料培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉0?50%，花生餅粉 0?1. 0%，黃豆餅粉0?1. 0%，酵母粉0?0. 5%，玉米漿0?4%，碳酸鈣0. 2?0. 6%， 硫酸銨0?〇? 7 %，溴化鈉0?0? 5 %，硫酸鎂0?0? 03 %，磷酸二氫鉀0?0? 02 %，淀粉酶 0?0? 1%，植物油或豆油0?0? 6%，消泡劑0? 02?0? 2%，余量為水；
[0017] c.發(fā)酵液的分離純化
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后板框過(guò)濾；過(guò)濾后的濾液用122離 子交換樹脂進(jìn)行脫色，直至濾液透光度> 90%后進(jìn)入結(jié)晶罐結(jié)晶；在結(jié)晶罐內(nèi)溫度為8? l〇°C條件下,用氨水將脫色后濾液pH值調(diào)至4. 4?4. 8,然后保溫50?60min,再進(jìn)行離 心分離，直至分離后濕晶體含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì)達(dá)20% ;將離心得到的濕晶體采用氣 流干燥方式進(jìn)行干燥，保持進(jìn)風(fēng)溫度為1〇〇?160°C，最后得到含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì) 彡10%的干粉。
[0019] 優(yōu)選的，所述孢子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：麩皮3.0%， MgS040. 005%，（NH4)2HP040.01%，KH2P040. 01%，瓊脂粉 2%，余量為水。
[0020] 優(yōu)選的，所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉 4 %，花生餅粉2 %，黃豆餅粉1 %，酵母粉1 %，玉米漿0. 5 %，碳酸鈣0. 4 %，硫酸銨0. 2 %， 溴化鈉0? 1 %，硫酸鎂0? 02 %，磷酸二氫鉀0? 01 %，淀粉酶0? 01 %，植物油0? 1 %，消泡劑 0. 2%，余量為水。
[0021] 優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉8%，花生 餅粉4 %，黃豆餅粉5 %，酵母粉2 %，玉米漿1. 5 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉 0. 4 %，硫酸鎂0. 03 %，磷酸二氫鉀0. 03 %，淀粉酶0. 06 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余 量為水。
[0022] 優(yōu)選的，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉40%，花 生餅粉1 %，黃豆餅粉1 %，酵母粉〇. 1 %，玉米漿2 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉 0. 4 %，硫酸鎂0. 03 %，磷酸二氫鉀0. 02 %，淀粉酶0. 1 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余量 為水。
[0023] 優(yōu)選的，包括如下步驟：
[0024] a?種子培養(yǎng)
[0025] 1)菌種制備
[0026]將金色鏈霉菌孢子接種到含有孢子培養(yǎng)基的母斜面上并在34°C下培養(yǎng)4天；然后 再接種到含有孢子培養(yǎng)基的子斜面上，在34°C下培養(yǎng)5天，至孢子成熟；
[0027] 所述孢子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：麩皮3. 0%，MgS040. 005%， (NH4) 2HP040. 01 %，KH2P040. 01 %，瓊脂粉 2 %，余量為水；
[0028] 2)種子罐培養(yǎng)
[0029] 將制備的孢子轉(zhuǎn)至種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為32°C，通氣量為1:2.Ov/v/min，罐壓 為0. 03MPa，攪拌速度為200rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間為25小時(shí)；
[0030] 所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉4%，花 生餅粉2 %，黃豆餅粉1 %，酵母粉1 %，玉米漿0. 5 %，碳酸鈣0. 4 %，硫酸銨0. 2 %，溴化鈉 0. 1 %，硫酸鎂0. 02 %，磷酸二氫鉀0. 01 %，淀粉酶0. 01 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余 量為水；
[0031]b?發(fā)酵培養(yǎng)
[0032] 種子罐培養(yǎng)完畢后轉(zhuǎn)為發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：罐內(nèi)溫度33°C，通氣量 1:1.Ov/v/min,罐壓0. 03MPa，攪拌速度180rpm/min，pH值6. 0,發(fā)酵時(shí)間110小時(shí)；發(fā)酵過(guò) 程中當(dāng)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百分濃度〈3. 5%時(shí)，加入補(bǔ)料培養(yǎng)基；發(fā)酵結(jié)束前，依據(jù)發(fā)酵液總 糖濃度確定添加補(bǔ)料量，確保發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百分濃度不高于2%;
[0033] 發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉8%，花生餅粉4%，黃 豆餅粉5 %，酵母粉2 %，玉米漿1. 5 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂 0. 03 %，磷酸二氫鉀0. 03 %，淀粉酶0. 06 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余量為水；
[0034] 補(bǔ)料培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉40%，花生餅粉1%，黃 豆餅粉1 %，酵母粉〇. 1 %，玉米漿2 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂 0.03%，磷酸二氫鉀0.02%，淀粉酶0. 1%，植物油0. 1%，消泡劑0.2%，余量為水；
[0035]c?發(fā)酵液的分離純化
[0036] 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后板框過(guò)濾；過(guò)濾后的濾液用122離子 交換樹脂進(jìn)行脫色，直至濾液透光度達(dá)96%后進(jìn)入結(jié)晶罐結(jié)晶；在結(jié)晶罐內(nèi)溫度為9°C條 件下，用氨水將脫色后濾液pH值調(diào)至4. 6,然后保溫60min，再進(jìn)行離心分離，直至分離后濕 晶體含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì)達(dá)20%;將離心得到的濕晶體采用氣流干燥方式進(jìn)行干燥， 保持進(jìn)風(fēng)溫度為158°C，最后得到含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì)為7%的干粉。
[0037] 優(yōu)選的，所述步驟c中所述發(fā)酵液預(yù)處理包括：首先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，然后用草 酸進(jìn)行酸化，酸化后pH值為1. 90?2. 00,然后按重量體積比向發(fā)酵液中加入發(fā)酵液體積 3. 0±0. 3%。的黃血鹽鈉，20分鐘后按重量體積比加入發(fā)酵液體積2. 0%。的硫酸鋅。
[0038] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，能有效提高發(fā)酵單位，提高收率， 降低生產(chǎn)成本，同時(shí)避免了化學(xué)有機(jī)溶劑的使用，防止有機(jī)溶劑對(duì)四環(huán)素造成污染，避免了 對(duì)動(dòng)物的危害；并且采用本發(fā)明所述培養(yǎng)基利于四環(huán)素特殊結(jié)構(gòu)的合成，從而提高四環(huán)素 收率，還能有利于后續(xù)對(duì)四環(huán)素的分離純化；另外，由于氣流干燥以蒸汽為熱源，采用氣流 干燥方式對(duì)四環(huán)素進(jìn)行干燥，大大提高了生產(chǎn)效率，降低了工作量。

【具體實(shí)施方式】
[0039]下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 四環(huán)素的制備方法如下：
[0042]a?種子培養(yǎng)
[0043] 1)菌種制備
[0044] 將金色鏈霉菌孢子接種到含有孢子培養(yǎng)基（母斜面）的瓊脂斜面中并在34°C下培 養(yǎng)4天。然后再轉(zhuǎn)接種到子斜面上，在34°C下培養(yǎng)5天直到孢子成熟；
[0045] 所述孢子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：麩皮3. 0%，MgS040. 005%， (NH4)2HP040. 01%，KH2P040. 01%，瓊脂粉2%，余量為水。子斜面培養(yǎng)基成分同母斜面培養(yǎng) 基成分；
[0046] 2)種子罐培養(yǎng)
[0047] 將菌種接種至滅菌后的種子罐中，在培養(yǎng)溫度32°C、罐壓0.03MPa、通氣量 1:2.Ov/v/min、攪拌速度200rpm下培養(yǎng)25小時(shí)，取樣檢測(cè)；
[0048] 檢測(cè)結(jié)果：種子液為淺黃色、稠，菌絲濃度為20%，pH值為5. 8,總糖2. 5%，氨基氮 78mg/100mL，效價(jià)150U/mL，鏡檢結(jié)果顯示菌絲呈密網(wǎng)狀分節(jié)菌絲粗壯，無(wú)雜菌，達(dá)到種子培 養(yǎng)液質(zhì)控指標(biāo)；
[0049] 種子罐培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉4%，花生餅粉2%， 黃豆餅粉1 %，酵母粉1 %，玉米漿0. 5 %，碳酸鈣0. 4 %，硫酸銨0. 2 %，溴化鈉0. 1 %，硫 酸鎂0. 02 %，磷酸二氫鉀0. 01 %，淀粉酶0. 01 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余量為水； b.發(fā)酵培養(yǎng)
[0050] 將種子液移至發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度33°C、罐壓0. 03MPa、pH值為6. 0、通氣量 1:1.Ov/v/min、攪拌速度180rpm下培養(yǎng)110小時(shí)，取樣檢測(cè)；
[0051]檢測(cè)結(jié)果：總糖1. 5%，氨基氮78mg/100mL，效價(jià)18000U/mL，濾速12mL/min。發(fā)酵 罐培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉8 %，花生餅粉4%，黃豆餅粉5 %， 酵母粉2 %，玉米漿1. 5 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂0. 03 %，磷酸 二氫鉀0. 03 %，淀粉酶0. 06 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余量為水；
[0052] 發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百分濃度〈3. 5%時(shí)，加入補(bǔ)料培養(yǎng)基；發(fā)酵結(jié)束 前，依據(jù)發(fā)酵液總糖濃度確定添加補(bǔ)料量，確保發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百分濃度不高 于2%;補(bǔ)料罐培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉40%，花生餅粉1 %，黃 豆餅粉1 %，酵母粉〇. 1 %，玉米漿2 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂 0. 03 %，磷酸二氫鉀0. 02 %，淀粉酶0. 1 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余量為水；
[0053] c?發(fā)酵液的分離純化
[0054] 1)發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾
[0055] 發(fā)酵完畢，將10噸發(fā)酵液壓入酸化罐中，開啟攪拌并用自來(lái)水進(jìn)行稀釋，同時(shí)加 入草酸進(jìn)行酸化，調(diào)節(jié)pH值為1. 90。取酸化樣品測(cè)定效價(jià)為17000U/mL，濾速為14mL/min。 之后按重量體積比向發(fā)酵液中加入發(fā)酵液體積3%。的黃血鹽鈉，20分鐘后按重量體積比再 加入發(fā)酵液體積2%。的硫酸鋅，稀釋后板框過(guò)濾；
[0056]2)脫色
[0057] 過(guò)濾后的濾液通入122離子交換樹脂罐中進(jìn)行脫色，每隔3小時(shí)取樣測(cè)定效價(jià)和 透光度，測(cè)得透光度為96%，效價(jià)為2100U/mL，脫色液進(jìn)入連續(xù)結(jié)晶罐進(jìn)行結(jié)晶；
[0058] 3)結(jié)晶
[0059] 脫色液由泵輸送至結(jié)晶罐，罐內(nèi)溫度控制在9°C，加入15%氨水（w/w)調(diào)節(jié)pH值 至4. 6,然后保溫60min，再進(jìn)入離心機(jī)進(jìn)行分離；
[0060] 4)離心分離
[0061] 往離心機(jī)中加入結(jié)晶液（每臺(tái)離心機(jī)分離濕晶體60kg)離心分離，并水洗兩次，共 4分鐘，第一次洗去泡沫，第二洗至水清，最終得到的濕晶體含水量為20% (w/w);
[0062] 5)干燥與混粉
[0063] 濕晶體的干燥采用氣流干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為158°C，濕粉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后進(jìn)入管道， 物料隨熱空氣經(jīng)擴(kuò)大罐至旋風(fēng)干燥器，過(guò)篩后進(jìn)入混粉器，得到含水量7% (w/w)的干粉， 總收率為87.8%。
[0064] 其中，種子罐轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中的移種指標(biāo)如表1 :
[0065]表1種子罐轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中的移種指標(biāo)
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 一種四環(huán)素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： a. 種子培養(yǎng) 1) 囷種制備 將金色鏈霉菌孢子接種到含有孢子培養(yǎng)基的母斜面上并在34±0. 5°C下培養(yǎng)3. 5?5 天；然后再接種到含有孢子培養(yǎng)基的子斜面上，在34±0. 5°C下培養(yǎng)3?5天，至孢子成熟； 所述孢子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：麩皮3. 0?3. 4 %， MgS040 . 00 5 ±0. 001 %，（NH4)2HP040 . 0 1 5 ±0. 005 %，KH2P040. 01±0. 002 %，瓊脂粉 1. 8 ? 2. 2%，余量為水； 2) 種子罐培養(yǎng) 將制備的孢子轉(zhuǎn)至種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30?33°C，通氣量為1:1.5?2. Ov/v/ min，罐壓為0. 03?0. 05MPa，攪拌速度為150?230rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間為20?26小時(shí)； 所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉3. 0?5. 0 %， 花生餅粉0?4%，黃豆餅粉0?4%，酵母粉0?2%，玉米漿0?0.8%，碳酸鈣0.2? 〇? 6 %，硫酸銨0? 2?0? 6 %，溴化鈉0?0? 3 %，硫酸鎂0? 02?0? 04 %，磷酸二氫鉀0? 01? 0. 06 %，淀粉酶0?0. 05 %，植物油或豆油0?0. 6 %，消泡劑0?0. 6 %，余量為水； b. 發(fā)酵培養(yǎng) 種子罐培養(yǎng)完畢后轉(zhuǎn)為發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：罐內(nèi)溫度28?33 °C，通氣量 1: 0? 8 ?1:1. Ov/v/min，罐壓 0? 02 ?0? 05MPa，攪拌速度 120 ?180rpm/min，pH 值 5. 6 ? 6. 2,發(fā)酵時(shí)間> 80小時(shí)；發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百分濃度〈3. 5%時(shí)，加入補(bǔ)料培養(yǎng) 基；發(fā)酵結(jié)束前，依據(jù)發(fā)酵液總糖濃度確定添加補(bǔ)料量，確保發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百 分濃度不高于2% ; 發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉〇?8. 0 %，花生餅粉0? 4. 0%，黃豆餅粉0?5. 0%，酵母粉0?2. 0%，玉米漿0?1. 8%，碳酸鈣0. 4?0. 7%，硫 酸銨0.5?1.0%，溴化鈉0? 1?0.4%，硫酸鎂0?0.03%，磷酸二氫鉀0?0.03%，淀粉 酶0?0. 08 %，植物油或豆油0?0. 3 %，消泡劑0?0. 6 %，余量為水； 補(bǔ)料培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉〇?50%，花生餅粉0? 1. 0%，黃豆餅粉0?1. 0%，酵母粉0?0. 5%，玉米漿0?4%，碳酸鈣0. 2?0. 6%，硫酸 銨0?0? 7%，溴化鈉0?0? 5%，硫酸鎂0?0? 03%，磷酸二氫鉀0?0? 02%，淀粉酶0? 0. 1%，植物油或豆油0?0. 6%，消泡劑0. 02?0. 2%，余量為水； c?發(fā)酵液的分尚純化 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后板框過(guò)濾；過(guò)濾后的濾液用122離子交換 樹脂進(jìn)行脫色，直至濾液透光度> 90%后進(jìn)入結(jié)晶罐結(jié)晶；在結(jié)晶罐內(nèi)溫度為8?1(TC條 件下，用氨水將脫色后濾液pH值調(diào)至4. 4?4. 8,然后保溫50?60min，再進(jìn)行離心分離， 直至分離后濕晶體含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì)達(dá)20% ;將離心得到的濕晶體采用氣流干燥方 式進(jìn)行干燥，保持進(jìn)風(fēng)溫度為100?160°C，最后得到含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì)< 10%的干 粉。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四環(huán)素的制備方法，其特征在于，所述孢子培養(yǎng)基 按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：麩皮3. 0 %，MgS040. 005 %，（NH4) 2HP040. 01 %， KH2P040. 01 %，瓊脂粉2 %，余量為水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四環(huán)素的制備方法，其特征在于，所述種子罐培養(yǎng)的培 養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉4%，花生餅粉2 %，黃豆餅粉1 %，酵母 粉1 %，玉米漿0. 5 %，碳酸鈣0. 4 %，硫酸銨0. 2 %，溴化鈉0. 1 %，硫酸鎂0. 02 %，磷酸二氫 鉀0. 01 %，淀粉酶0. 01 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2%，余量為水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四環(huán)素的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì) 量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉8 %，花生餅粉4 %，黃豆餅粉5 %，酵母粉2 %， 玉米漿1. 5 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂0. 03 %，磷酸二氫鉀 0. 03 %，淀粉酶0. 06 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余量為水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四環(huán)素的制備方法，其特征在于，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基按 質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉40%，花生餅粉1%，黃豆餅粉1%，酵母粉 0. 1 %，玉米漿2 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂0. 03 %，磷酸二氫鉀 0.02%，淀粉酶0. 1%，植物油0. 1%，消泡劑0.2%，余量為水。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種四環(huán)素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a. 種子培養(yǎng) 1) 囷種制備 將金色鏈霉菌孢子接種到含有孢子培養(yǎng)基的母斜面上并在34°C下培養(yǎng)4天；然后再接 種到含有孢子培養(yǎng)基的子斜面上，在34°C下培養(yǎng)5天，至孢子成熟； 所述孢子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：麩皮3. 0 %，MgS040. 005%， (NH4) 2HP040. 01 %，KH2P040. 01 %，瓊脂粉 2 %，余量為水； 2) 種子罐培養(yǎng) 將制備的孢子轉(zhuǎn)至種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為32°C，通氣量為l:2.0v/v/min，罐壓為 0. 03MPa，攪拌速度為200rpm/min，培養(yǎng)時(shí)間為25小時(shí)； 所述種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉4%，花生 餅粉2 %，黃豆餅粉1 %，酵母粉1 %，玉米漿0. 5 %，碳酸鈣0. 4 %，硫酸銨0. 2 %，溴化鈉 0. 1 %，硫酸鎂0. 02 %，磷酸二氫鉀0. 01 %，淀粉酶0. 01 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余 量為水； b. 發(fā)酵培養(yǎng) 種子罐培養(yǎng)完畢后轉(zhuǎn)為發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：罐內(nèi)溫度33°C，通氣量1:1. Ov/v/ min,罐壓0. 03MPa，攪拌速度180rpm/min，pH值6. 0,發(fā)酵時(shí)間110小時(shí)；發(fā)酵過(guò)程中當(dāng)發(fā)酵 液總糖質(zhì)量百分濃度〈3. 5%時(shí)，加入補(bǔ)料培養(yǎng)基；發(fā)酵結(jié)束前，依據(jù)發(fā)酵液總糖濃度確定 添加補(bǔ)料量，確保發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液總糖質(zhì)量百分濃度不高于2% ; 發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉8 %，花生餅粉4 %，黃豆 餅粉5 %，酵母粉2 %，玉米漿1. 5 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂 0. 03 %，磷酸二氫鉀0. 03 %，淀粉酶0. 06 %，植物油0. 1 %，消泡劑0. 2 %，余量為水； 補(bǔ)料培養(yǎng)基按質(zhì)量百分濃度計(jì)由以下成分組成：玉米淀粉40 %，花生餅粉1 %，黃豆 餅粉1 %，酵母粉〇. 1 %，玉米漿2 %，碳酸鈣0. 5 %，硫酸銨0. 6 %，溴化鈉0. 4 %，硫酸鎂 0.03%，磷酸二氫鉀0.02%，淀粉酶0. 1%，植物油0. 1%，消泡劑0.2%，余量為水； c?發(fā)酵液的分尚純化 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后板框過(guò)濾；過(guò)濾后的濾液用122離子交換 樹脂進(jìn)行脫色，直至濾液透光度達(dá)96%后進(jìn)入結(jié)晶罐結(jié)晶；在結(jié)晶罐內(nèi)溫度為9°C條件下， 用氨水將脫色后濾液pH值調(diào)至4. 6,然后保溫60min，再進(jìn)行離心分離，直至分離后濕晶體 含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì)達(dá)20% ;將離心得到的濕晶體采用氣流干燥方式進(jìn)行干燥，保持 進(jìn)風(fēng)溫度為158°C，最后得到含水量按質(zhì)量百分濃度計(jì)為7%的干粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6任一項(xiàng)所述的一種四環(huán)素的制備方法，其特征在于，所述步驟 c中所述發(fā)酵液預(yù)處理包括：首先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，然后用草酸進(jìn)行酸化，酸化后pH值為 1. 90?2. 00,然后按重量體積比向發(fā)酵液中加入發(fā)酵液體積3. 0±0. 3%。的黃血鹽鈉，20分 鐘后按重量體積比加入發(fā)酵液體積2. 0%。的硫酸鋅。
【文檔編號(hào)】C12P29/00GK104342477SQ201410610074
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】謝昌賢, 鄧維康, 劉運(yùn)添, 王鵬飛 申請(qǐng)人:金河生物科技股份有限公司