促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加一定濃度的EGCG進(jìn)行成熟培養(yǎng)。研究表明，成熟22～24h后，卵母細(xì)胞第一極體排出率為59.31％；成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精處理后，囊胚發(fā)育率高達(dá)24.68％；成熟卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活處理后，囊胚發(fā)育率高達(dá)31.69％?？梢?，水牛體外成熟培養(yǎng)液中添加EGCG有利于卵母細(xì)胞體外成熟和成熟后早期胚胎發(fā)育，本發(fā)明可以顯著提高卵母細(xì)胞的體外成熟率和囊胚發(fā)育率。因此，應(yīng)用本發(fā)明能顯著促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，提高卵母細(xì)胞成熟率和成熟質(zhì)量，從而能提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率。
【專利說明】促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水牛繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)是綠茶主要的活性和水溶性成分，是茶多酚的主要功能物質(zhì)，因為具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有非常強的抗氧化性和清除自由基的功能。目前，EGCG在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用主要是抗癌防癌。有學(xué)者研究證明，EGCG能抑制癌細(xì)胞生存需要的信號傳遞，與其他抗氧化劑相互作用降低某些致癌物質(zhì)的活性，清除有害自由基；有利于維持線粒體膜電位的穩(wěn)定、保護線粒體基因和功能的完整性，還能夠發(fā)揮抗腫瘤、降血脂、抗炎、抗衰老、防輻射等一系列生物活性。細(xì)胞的新陳代謝和培養(yǎng)環(huán)境中產(chǎn)生一系列活性氧基團(reactive oxygen species, ROS),如 02_、H202 及 Η02_、_0Η 等，它們會造成 DNA和細(xì)胞膜損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使早期胚胎發(fā)育停滯。在細(xì)胞培養(yǎng)中，EGCG能增強谷胱甘肽、過氧化物酶、過氧化氫酶、酯還原酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性。在卵母細(xì)胞中，谷胱甘肽(GSH)的功能主要是參與抗氧化作用并保護細(xì)胞免受活性氧(ROS)的毒性。細(xì)胞中GSH的含量通常作為評估卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。GSH在細(xì)胞發(fā)育中的主要功能是參與抗活性氧族毒害作用保護卵母細(xì)胞。它能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、受精過程雄原核的產(chǎn)生和早期胚胎發(fā)育?，F(xiàn)有的研究表明，EGCG促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，以及對早期胚胎發(fā)育所起的促進(jìn)作用，可能與提高卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度有關(guān)。
[0003]近年來，哺乳動物卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)取得了巨大進(jìn)展，形成了一套較成熟的卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)體系，但與體內(nèi)成熟相比，仍有許多差距，特別是囊胚率和囊胚質(zhì)量較低。其可能原因之一就是卵母細(xì)胞在體外成熟過程中較體內(nèi)成熟產(chǎn)生更多的R0S，并且細(xì)胞或胚胎離開供體后得不到母體抗氧化劑的保護，過高的ROS破壞細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的平衡。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，以提高卵母細(xì)胞的體外成熟率和囊胚發(fā)育率。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加EGCG。
[0006]EGCG在成熟培養(yǎng)液中的濃度為10 μ mol/L。
[0007]成熟培養(yǎng)液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發(fā)情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
[0008]上述促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，包括以下步驟:
[0009](I)卵母細(xì)胞的收集
[0010]采集屠宰水牛后的廢棄卵巢,置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，溫度保持在35°C，并于6h內(nèi)送回實驗室；用手術(shù)剪將卵巢周圍的其它組織剪去，生理鹽水洗滌2?3遍，用18號針頭注射器抽取2?8_卵泡的卵母細(xì)胞卵泡液復(fù)合物，洗卵液中挑選胞質(zhì)均勻、周圍有3層以上顆粒細(xì)胞完全包裹的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)；
[0011]洗卵液的組成為TCM199+5mmol/L NaHC03+20mmol/L !fepes+600mg/L 青霉素和100mg/L鏈霉素；
[0012](2)卵母細(xì)胞的成熟
[0013]用預(yù)先平衡好的含lOymol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液做若干個培養(yǎng)滴，每個滴55 μ L，將收集到的卵母細(xì)胞用含10 μ mol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液中清洗2?3遍，后置于成熟培養(yǎng)液微滴中，每個滴放20個的卵母細(xì)胞,覆蓋礦物油置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39°C,5% CO2和100%濕度；成熟培養(yǎng)后檢查第一極體排出情況，統(tǒng)計成熟率；
[0014]成熟培養(yǎng)液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發(fā)情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
[0015]上述促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，還包括以下步驟:
[0016](3)成熟卵母細(xì)胞的體外受精
[0017]體外受精所用精液為冷凍精液，38.5°C水浴解凍，上游法收集活力高的精子；卵母細(xì)胞成熟22?24h(MII期)后，吹打去除COCs周圍的顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞用體外受精液洗滌兩次后置于約40 μ L的受精滴中，每滴約15?20個，每個受精滴注入12 μ L離心處理好的精液，使其濃度達(dá)到I?2 X 16個/mL，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行受精培養(yǎng)；受精后第二天將假定受精卵移入單層顆粒細(xì)胞中共培養(yǎng)，隔天更換一半胚胎培養(yǎng)液，受精后48h統(tǒng)計卵裂率，第6?9天統(tǒng)計囊胚率；
[0018]體外受精液的組成為Tyrode’ s 液 +20 μ g/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA,pH7.5 ?7.8。
[0019]上述促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，還包括以下步驟:
[0020](4)成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活
[0021]采用化學(xué)激活法，卵母細(xì)胞成熟22?24h (MII期)后，吹打去除COCs周圍的顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞用添加了 5 μ mol/L離子酶素的洗卵液中激活5min，后置于6-DMAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)6h，6-DMAP培養(yǎng)液為胚胎培養(yǎng)液中添加2mmol/L的6-DMAP ;用胚胎培養(yǎng)液洗滌2?3次，置于單層顆粒微滴中共培養(yǎng)，隔天更換一半胚胎培養(yǎng)液，激活48h后統(tǒng)計卵裂率，第6?9天統(tǒng)計囊胚率。
[0022]上述促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，還包括以下步驟:
[0023](5)胚胎培養(yǎng)
[0024]體外受精或孤雌激活后的卵母細(xì)胞用胚胎培養(yǎng)液洗滌2?3次后，移入顆粒細(xì)胞單層培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，體外培養(yǎng)時間為8天，共培養(yǎng)24h統(tǒng)計卵裂率，第8d統(tǒng)計囊胚率；
[0025]胚胎培養(yǎng)液的組成為54%體外受精液+36%成熟培養(yǎng)液+10%胎牛血清。
[0026]卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)是胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的關(guān)鍵，針對目前水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)囊胚率和囊胚質(zhì)量較低的問題，發(fā)明人建立了一種促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加一定濃度的EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)進(jìn)行成熟培養(yǎng)。研究表明，成熟22?24h后，卵母細(xì)胞第一極體排出率為59.31 %;成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精處理后，囊胚發(fā)育率高達(dá)24.68% ;成熟卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活處理后，囊胚發(fā)育率高達(dá)31.69%?？梢?，水牛體外成熟培養(yǎng)液中添加EGCG有利于卵母細(xì)胞體外成熟和成熟后早期胚胎發(fā)育，本發(fā)明可以顯著提高卵母細(xì)胞的體外成熟率和囊胚發(fā)育率。因此，應(yīng)用本發(fā)明能顯著促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，提高卵母細(xì)胞成熟率和成熟質(zhì)量，從而能提高水牛體外胚胎生產(chǎn)效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是應(yīng)用本發(fā)明水牛卵母細(xì)胞成熟22h后卵丘擴展樣圖。
[0028]圖2是應(yīng)用本發(fā)明水牛卵母細(xì)胞成熟22h后排出第一極體樣圖。
[0029]圖3是應(yīng)用本發(fā)明水牛孤雌激活48h后卵裂樣圖。
[0030]圖4是應(yīng)用本發(fā)明水牛體外受精后胚胎發(fā)育樣圖。

【具體實施方式】
[0031]實施例促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法
[0032](I)卵母細(xì)胞的收集
[0033]采集當(dāng)?shù)赝涝讏鐾涝姿：蟮膹U棄卵巢，置于含有雙抗(0.024g/L青霉素和
0.02g/L鏈霉素)的生理鹽水的保溫瓶中，溫度保持在35°C左右，并于6h內(nèi)送回實驗室；用手術(shù)剪將卵巢周圍的其它組織剪去，然后用35°C左右含有雙抗的生理鹽水洗滌2?3遍，備用；用18號針頭注射器抽取2?8mm卵泡的卵母細(xì)胞卵泡液復(fù)合物，洗卵液中挑選胞質(zhì)均勻、周圍有3層以上顆粒細(xì)胞完全包裹的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)；
[0034]其中，洗卵液的組成為TCM199+5mmol/L NaHC03+20mmol/L !fepes+600mg/L 青霉素和100mg/L鏈霉素，pH為7.2?7.4。
[0035](2)卵母細(xì)胞的成熟
[0036]用預(yù)先平衡好的含lOymol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液做若干個培養(yǎng)滴，每個滴55 μ L，將收集到的卵母細(xì)胞用含10 μ mol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液中清洗2?3遍，后置于成熟培養(yǎng)液微滴中，每個滴放20個左右的卵母細(xì)胞，覆蓋礦物油置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39°C，5% CO2和100%濕度；成熟培養(yǎng)后檢查第一極體排出情況，統(tǒng)計成熟率。
[0037]其中，成熟培養(yǎng)液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發(fā)情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
[0038](3)成熟卵母細(xì)胞的體外受精
[0039]體外受精所用精液為冷凍精液，38.5°C水浴解凍，上游法收集活力高的精子，用一支15mL的離心管預(yù)先平衡2mL受精液，將解凍好的精液注入離心管的底部，于培養(yǎng)箱中45°傾斜放置30min，收集上層lmL，1200 X g離心5min，棄掉上清液；卵母細(xì)胞成熟22?24h (Mil期)后，用移液器在成熟滴中輕輕吹打去除COCs周圍的顆粒細(xì)胞，將處理好的MII期卵母細(xì)胞用體外受精液洗漆兩次后置于約40 μ L的受精滴中，每滴約15?20個,每個受精滴注入12 μ L離心處理好的精液，使其濃度達(dá)到I?2 X 16個/mL，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行受精培養(yǎng)；受精后第二天將假定受精卵移入單層顆粒細(xì)胞中共培養(yǎng)，隔天更換一半胚胎培養(yǎng)液，受精后48h統(tǒng)計卵裂率，第6?9天統(tǒng)計囊胚率。
[0040]其中，體外受精液的組成為Tyrode’ s 液+20 μ g/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA,pH7.5 ?7.8。
[0041]體外受精22?24h后，在受精滴中輕輕吹打假定受精卵，以去除附著的精子。
[0042](4)成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活
[0043]采用化學(xué)激活法，預(yù)先平衡好含5 μ mol/L離子酶素的洗卵液、含2mmol/L 6-DMAP的胚胎培養(yǎng)液以及胚胎培養(yǎng)液；用含5 μ mol/L離子酶素的洗卵液在一個培養(yǎng)皿中做若干個100 μ L工作滴，卵母細(xì)胞成熟22?24h(MII期)后，用移液器在成熟滴中輕輕吹打去除COCs周圍的顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞用添加了 5 μ mol/L離子酶素的洗卵液中激活5min ;再來一個培養(yǎng)皿做若干個2mmol/L的6-DMAP培養(yǎng)滴，每個滴30 μ L，覆蓋礦物油，激活后的卵母細(xì)胞用6-DMAP培養(yǎng)液洗滌兩次后移入6-DMAP培養(yǎng)滴中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h激活培養(yǎng)6h，培養(yǎng)條件為39°C ,5% CO2和100%濕度；用胚胎培養(yǎng)液洗滌2?3次，置于單層顆粒微滴中共培養(yǎng)，隔天更換一半胚胎培養(yǎng)液，激活48h后統(tǒng)計卵裂率，第6?9天統(tǒng)計囊胚率。
[0044](5)胚胎培養(yǎng)
[0045]假定受精卵和激活培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞均用平衡好的胚胎培養(yǎng)液洗滌2?3次后，移入20 μ L體系的顆粒細(xì)胞單層培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，每滴15?20枚，體外培養(yǎng)時間為8天，培養(yǎng)條件為39°C，5% CO2和100%濕度，隔天更換半量胚胎培養(yǎng)液，共培養(yǎng)24h統(tǒng)計卵裂率，第6?9d統(tǒng)計囊胚率。
[0046]其中，胚胎培養(yǎng)液成分:54%體外受精液+36%成熟培養(yǎng)液+10%胎牛血清。
[0047]上述各步驟中，成熟培養(yǎng)液、體外受精液、胚胎培養(yǎng)液均添加60mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素，所有試劑均用孔徑0.22 μ m的微孔濾器過濾，所用器皿均無菌處理。
[0048]結(jié)果:如圖1至4，在水牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中，成熟率為59.31%，體外受精后，囊胚率為24.68%，孤雌激活后，囊胚率為31.69%。
[0049]應(yīng)用例
[0050]2014年6月19日，從當(dāng)?shù)赝涝讏鍪占殉埠?，于盛裝有生理鹽水的保溫瓶中4h后運到實驗室，到達(dá)實驗室時溫度為30°C。按上述實施例的方法收集到200個卵母細(xì)胞，于含10 μ mol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，6月20日，卵母細(xì)胞成熟22h后，用移液器輕輕吹打去除大部分卵丘細(xì)胞。排出第一極體的卵母細(xì)胞有123個，成熟率為61.50%，對123個排出第一極體的MII期卵母細(xì)胞全部進(jìn)行體外受精。6月21日，將受精22h的假定受精卵經(jīng)胚胎培養(yǎng)液洗滌兩次后，移入移入20 μ L體系的顆粒細(xì)胞單層培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，隔天更換半量培養(yǎng)液，48h后檢查卵裂情況，共卵裂了 75個，卵裂率為60.98%。6月29日統(tǒng)計囊胚率，囊胚數(shù)為30個，囊胚率為24.39%。按此方法重復(fù)5次，最后成熟率、成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精處理后的囊胚發(fā)育率為這5次的平均數(shù)。
[0051]2014年7月15日，按實施例的方法收集了 168個卵母細(xì)胞置于含10 μ mol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，7月16日，體外成熟了 22h后,挑選排出第一極體的101卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，當(dāng)天下午將激活培養(yǎng)好的卵母細(xì)胞移入顆粒細(xì)胞單層培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，隔天更換半量培養(yǎng)液。7月18日統(tǒng)計卵裂率，卵裂細(xì)胞數(shù)為75個，卵裂率為74.26%。7月25日檢查囊胚發(fā)育情況，囊胚數(shù)為32個，囊胚率為31.68%。按此方法重復(fù)5次，成熟卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活處理后囊胚發(fā)育率為這5次的平均數(shù)。
[0052]上述試驗證明，水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加lOymol/LEGCG，成熟率約60%，體外受精后，囊胚率約25% ;孤雌激活后，囊胚率約32%。
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，其特征在于在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加EGCG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，其特征在于:所述EGCG在成熟培養(yǎng)液中的濃度為lOymol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，其特征在于:所述成熟培養(yǎng)液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發(fā)情牛血清+3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)卵母細(xì)胞的收集 采集屠宰水牛后的廢棄卵巢，置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，溫度保持在35°C，并于6h內(nèi)送回實驗室；用手術(shù)剪將卵巢周圍的其它組織剪去，生理鹽水洗滌2?3遍，用18號針頭注射器抽取2?8_卵泡的卵母細(xì)胞卵泡液復(fù)合物，洗卵液中挑選胞質(zhì)均勻、周圍有3層以上顆粒細(xì)胞完全包裹的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體； 所述洗卵液的組成為 TCM199+5mmol/L NaHC03+20mmol/L Hepes+600mg/L 青霉素和100mg/L 鏈霉素，pH 為 7.2 ?7.4 ; (2)卵母細(xì)胞的成熟 用預(yù)先平衡好的含10 μ mol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液做若干個培養(yǎng)滴，每個滴55 μ L，將收集到的卵母細(xì)胞用含10 μ mol/L EGCG的成熟培養(yǎng)液中清洗2?3遍，后置于成熟培養(yǎng)液微滴中，每個滴放20個的卵母細(xì)胞，覆蓋礦物油置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39°C，5%CO2和100%濕度；成熟培養(yǎng)后檢查第一極體排出情況，統(tǒng)計成熟率； 所述成熟培養(yǎng)液的組成為TCM199+26.2mmol/L NaHC03+5mmol/L H印es+10%發(fā)情牛血清 +3%黃牛卵泡液 +0.5 μ g/mL FSH+5 μ g/mL LH+10 μ mol/L EGCG, pH 為 7.2 ?7.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，其特征在于還包括以下步驟: (3)成熟卵母細(xì)胞的體外受精 體外受精所用精液為冷凍精液，38.5°C水浴解凍，上游法收集活力高的精子；卵母細(xì)胞成熟22?24h后，吹打去除COCs周圍的顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞用體外受精液洗滌兩次后置于約40 μ L的受精滴中，每滴約15?20個，每個受精滴注入12 μ L離心處理好的精液，使其濃度達(dá)到I?2 X 16個/mL，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行受精培養(yǎng)；受精后第二天將假定受精卵移入單層顆粒細(xì)胞中共培養(yǎng)，隔天更換一半胚胎培養(yǎng)液，受精后48h統(tǒng)計卵裂率，第6?9天統(tǒng)計囊胚率； 所述體外受精液的組成為 Tyrode’ s 液 +20 μ g/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA,pH7.5 ?7.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，其特征在于還包括以下步驟: (4)成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活 采用化學(xué)激活法，卵母細(xì)胞成熟22?24h后，吹打去除COCs周圍的顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞用添加了 5 μ mol/L離子酶素的洗卵液中激活5min，后置于6-DMAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)6h，6-DMAP培養(yǎng)液為胚胎培養(yǎng)液中添加2mmol/L的6-DMAP ;用胚胎培養(yǎng)液洗滌2?3次，置于單層顆粒微滴中共培養(yǎng)，隔天更換一半胚胎培養(yǎng)液，激活48h后統(tǒng)計卵裂率，第6?9天統(tǒng)計囊胚率。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的方法，其特征在于還包括以下步驟: (5)胚胎培養(yǎng) 體外受精或孤雌激活后的卵母細(xì)胞用胚胎培養(yǎng)液洗滌2?3次后，移入顆粒細(xì)胞單層培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，體外培養(yǎng)時間為8天，共培養(yǎng)24h統(tǒng)計卵裂率，第8d統(tǒng)計囊胚率； 所述胚胎培養(yǎng)液的組成為54%體外受精液+36%成熟培養(yǎng)液+10%胎牛血清。
【文檔編號】C12N5/075GK104312971SQ201410614012
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】張明, 李敏玲, 陳富美 申請人:廣西大學(xué)