一種固定化碳酸酐酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化碳酸酐酶及其制備方法，該固定化碳酸酐酶包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合。本發(fā)明采用共價(jià)鍵將磁性納米顆粒載體和生物酶結(jié)合，獲得的固定化碳酸酐酶，具有納米級粒徑，使得固定化酶在催化體系中的分散性優(yōu)于微米級以上的固定化酶；具有超順磁性，使得固定化酶的重復(fù)使用性、操作穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶；使得固定化碳酸酐酶物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)能大幅提高生產(chǎn)效率，同時(shí)降低生物酶的使用成本。
【專利說明】一種固定化碳酸酐酶及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于固相化酶【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種固定化碳酸酐酶及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]酶的固定化是指通過化學(xué)、物理、生物方法，利用載體將酶限制或束縛在特定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的一種酶工程技術(shù)。酶的固定化技術(shù)有利于酶回收及連續(xù)化運(yùn)作從而降低生產(chǎn)成本，因此成為近年來酶工程領(lǐng)域最為活躍的研究重點(diǎn)之一。
[0003]磁性納米顆粒是一種利于分離和再利用的固定化載體，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。目前磁性納米顆粒載體主要通過殼聚糖和瓊脂糖包裹磁性納米核達(dá)到改性修飾的目的。然而這種方法制備的磁性納米顆粒固定化載體，由于采用包埋作用將酶分子包埋于載體內(nèi)部，導(dǎo)致酶的催化活性結(jié)構(gòu)受到載體的阻礙，對酶活力會(huì)造成影響，和游離酶相比，活力大幅度降低。
[0004]碳酸酐酶，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種金屬蛋白，能夠高效催化二氧化碳水化和去水化反應(yīng)。固定化的碳酸酐酶在環(huán)境保護(hù)、生物質(zhì)能源、食品儲(chǔ)存工業(yè)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。目前碳酸酐酶的固定化，主要采用離子交換作用力、物理吸附力或包埋法等方法與微米級以上固相多孔性顆粒結(jié)合。其中，微米級以上固相多孔性顆粒尺寸過大，固定化酶分散性弱，影響外部傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致催化效率低；離子交換作用力，結(jié)合的碳酸酐酶過少；物理吸附力，作用力過弱，結(jié)合不牢固，導(dǎo)致多次使用后生物酶流失，批次使用效果不穩(wěn)定；包埋法，碳酸酐酶的活性位點(diǎn)受到載體的阻礙，影響內(nèi)部傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致催化效率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供了一種固定化碳酸酐酶，采用共價(jià)鍵將如碳酸酐酶的生物酶與磁性納米顆粒結(jié)合，形成固定化生物酶，具有酶催化效率高、生物酶不易脫落、操作穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述固定化碳酸酐酶的制備方法。
[0006]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種固定化碳酸酐酶，包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合；其中，磁性納米顆粒平均粒徑為5?30nm，富醛基殼的平均厚度為5?20nm。
[0007]所述磁性納米顆粒為納米鐵氧化物或納米鈦氧化物。
[0008]所述富醛基復(fù)合材料包括兩層，從內(nèi)到外依次為硅烷交聯(lián)劑層和多醛基化合物層。
[0009]所述碳酸酐酶為α型或β型碳酸酐酶。
[0010]所述固定化碳酸酐酶,每克固定化碳酸酐酶包含碳酸酐酶5(T300mg。
[0011]一種所述固定化碳酸酐酶的制備方法，包括以下步驟:
1)制備磁性納米顆粒； 2)取磁性納米顆粒和硅烷交聯(lián)劑均勻分散于有機(jī)溶劑中，低溫低速攪拌，獲得包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒；
3)取包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒，均勻分散于多醛基化合物的弱堿性緩沖液中，去除緩沖液，獲得醛基功能化的磁性納米顆粒；
4)取醛基功能化的磁性納米顆粒，加入待固定化的碳酸酐酶溶液，攪拌混合進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，即制得固定化碳酸酐酶。
[0012]步驟2)中，所述的硅烷交聯(lián)劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，所述有機(jī)溶劑為無水乙醇，將磁性納米顆粒與硅烷交聯(lián)劑超聲分散后，再將分散液加入到有機(jī)溶劑中，攪拌分散，從而使分散液與有機(jī)溶劑充分混勻，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
[0013]步驟3)中，所述的多醛基化合物為戊二醛、丁二醛或丙二醛，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
[0014]步驟4)中，所述醛基功能化的磁性納米顆粒與碳酸酐酶過共價(jià)鍵結(jié)合形成固定化碳酸酐酶；所述碳酸酐酶溶液濃度為f5mg/mL，碳酸酐酶與富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1:2?10。
[0015]步驟4)中，所述共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)條件為25?30°C，搖床混合2?5h，搖床轉(zhuǎn)速為120?200r/min。
[0016]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
I)本發(fā)明采用共價(jià)鍵將磁性納米顆粒載體和生物酶結(jié)合，獲得的固定化碳酸酐酶，具有納米級粒徑，使得固定化酶在催化體系中的分散性優(yōu)于微米級以上的固定化酶。
[0017]2)本發(fā)明提供的固定化碳酸酐酶，具有超順磁性，使得固定化酶的重復(fù)使用性、操作穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶。
[0018]3)本發(fā)明提供的固定化碳酸酐酶，采用醛基功能化修飾的磁性納米顆粒與碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合，使得固定化碳酸酐酶物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)能大幅提高生產(chǎn)效率，同時(shí)降低生物酶的使用成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是固定化碳酸酐酶的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是固定化碳酸酐酶存放于N-甲基二乙醇胺中的穩(wěn)定性測試結(jié)果圖。
[0020]圖3是固定化碳酸酐酶與傳統(tǒng)固定化碳酸酐酶的性能對比結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，一下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0022]一種固定化碳酸酐酶，結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶。其中，磁性納米顆粒，平均粒徑為5?30nm，可為納米鐵氧化物或納米鈦氧化物，例如:Fe304、Fe203、Ti02，優(yōu)選磁性和穩(wěn)定性良好且成本較低的Fe3O4 ;富醛基復(fù)合材料，是指含有豐富醛基的復(fù)合材料，包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，其平均厚度為5?20nm，富醛基復(fù)合材料包括兩層，從里到外依次為硅烷交聯(lián)劑和多醛基化合物，硅烷交聯(lián)劑，如氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，多醛基化合物，如戊二醛、丁二醛或丙二醛；富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，其表面醛基與待固定化的酶通過共價(jià)鍵結(jié)合。
[0023]實(shí)施例1
一種固定化碳酸酐酶制備方法，包括以下步驟:
I)制備磁性納米顆粒:采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe3O4納米顆粒，控制平均粒徑為10納米。
[0024]2)制備包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒:將5g磁性納米顆粒和5mL氨丙基三乙氧基硅烷加入到50mL無水乙醇中，220W超聲分散30min后，30°C，200r/min,攪拌40h，得到均勻分散體系。磁性分離并用大量乙醇和雙蒸水清洗顆粒，獲得純凈的包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒。
[0025]3)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性Fe3O4納米顆粒:取包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒5g，分散于150mL含有5%戊二醛弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH7.(Γ8.5)中，超聲分散30min后，25°C，150r/min，攪拌3h，使包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒與戊二醛發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，形成醛基功能化的磁性納米顆粒。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒。
[0026]4)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶:取富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒200mg，分散于1mL 2mg/mL的碳酸酐酶弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液中(50mmol/L pH 7.0?8.5)，pH為8.0，30°C，搖床混合4h，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。使富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒與待固定化的碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合，即形成富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。
[0027]將制備的固定化碳酸酐酶通過pH電極法測定催化活力，結(jié)果顯示:固定化酶每克蛋白的單位酶活力相對于游離酶每克蛋白的單位酶活力為65% ;每克固定化碳酸酐酶的載酶量為80mg。
[0028]實(shí)施例2
一種固定化碳酸酐酶的制備方法，包括以下步驟:
I)制備磁性納米顆粒:采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe3O4納米顆粒，控制平均粒徑為20納米。
[0029]2)制備包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒:將5g磁性納米顆粒和5mL 3_氨丙基三甲氧基硅烷加入到50mL無水乙醇中，220W超聲分散30min后，30°C，200r/min,攪拌24h，得到均勻分散體系。磁性分離并用大量乙醇和雙蒸水清洗顆粒，獲得純凈的包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒。
[0030]3)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性Fe3O4納米顆粒:取包覆有氨丙基三甲氧基硅烷的磁性納米顆粒5g，分散于150mL含有5%丙二醛弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH7.(Γ8.5)中，超聲分散30min后，25°C，150r/min，攪拌3h，使所述包覆有氨丙基三甲氧基硅烷的磁性納米顆粒與丙二醛發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，形成醛基功能化的磁性納米顆粒。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒。
[0031]4)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶:取富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒20mg,分散于10mL lmg/mL的碳酸酐酶弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH 7.(Γ8.5)中，pH為8.0，30°C，搖床混合2h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。使富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒與待固定化的碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合，即形成富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。
[0032]將制備的固定化碳酸酐酶通過pH電極法測定催化活力，結(jié)果顯示:固定化酶每克蛋白的單位酶活力相對于游離酶每克蛋白的單位酶活力為33% ;每克固定化碳酸酐酶的載酶量為90mg。
[0033]實(shí)施例3
一種固定化碳酸酐酶制備方法，包括以下步驟:
1)制備磁性納米顆粒:采用化學(xué)共沉淀法制備磁性Fe304納米顆粒，控制平均粒徑為30納米。
[0034]2)制備包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒:將5g磁性納米顆粒和5mL氨丙基三乙氧基硅烷加入到50mL無水乙醇中，220W超聲分散30min后，30°C，200r/min,攪拌40h，得到均勻分散體系。磁性分離并用大量乙醇和雙蒸水清洗顆粒，獲得純凈的包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒。
[0035]3)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性Fe304納米顆粒:取包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒5g，分散于150mL含有5%丙二醛弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH7.(Γ8.5)中，超聲分散30min后，25°C，150r/min，攪拌3h，使包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性納米顆粒與戊二醛發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，形成醛基功能化的磁性納米顆粒。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒。
[0036]4)制備富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶:取富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒250mg,分散于10mL 5mg/mL的碳酸酐酶弱堿性磷酸鉀鹽緩沖溶液(50mmol/L pH 7.0?8.5)中，pH為8.0，28°C，搖床混合5h，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。使富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒與待固定化的碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合，即形成富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。磁性分離并清洗顆粒，獲得純凈的富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米固定化碳酸酐酶。
[0037]將制備的固定化碳酸酐酶通過pH電極法測定催化活力，結(jié)果顯示:固定化酶每克蛋白的單位酶活力相對于游離酶每克蛋白的單位酶活力為51% ;每克固定化碳酸酐酶的載酶量為76mg。
[0038]實(shí)施例4
將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備的固定化碳酸酐酶分別靜置于3mol/L的N-甲基二乙醇胺溶液中，放置(T24h，進(jìn)行穩(wěn)定性測試，結(jié)果見圖2。工業(yè)化應(yīng)用中，固定化碳酸酐酶的催化環(huán)境是在3mol/L的N-甲基二乙醇胺溶液中，所以固定化碳酸酐酶對于N-甲基二乙醇胺的耐受性是一個(gè)很重要的衡量因素，從圖2結(jié)果可知，所制備的固定化碳酸酐酶對于N-甲基二乙醇胺有很好的耐受性。
[0039]實(shí)施例5
將實(shí)施例1中制備的固定化碳酸酐酶通過pH電極法，進(jìn)行批次使用穩(wěn)定性測試，與參照文獻(xiàn)(Immobilizat1n of carbonic anhydrase on mesoporous aluminosilicate forcarbonat1n react1n, Snehal Wanjari, Microporous and Mesoporous Materials 160(2012) 151-158)報(bào)道的制備的介孔硅鋁酸鹽顆粒固定化碳酸酐酶的批次使用測試相比較，結(jié)果見圖3，可見實(shí)施例1所制備的固定化碳酸酐酶批次使用性能穩(wěn)定，在多次循環(huán)使用后，其相對酶活力仍保持較高水平。在工業(yè)化應(yīng)用中，可大幅度降低固定化酶的使用成本，具有良好的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種固定化碳酸酐酶，其特征在于:包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合；其中，磁性納米顆粒平均粒徑為5?30nm，富醛基殼的平均厚度為5?20nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述磁性納米顆粒為納米鐵氧化物或納米鈦氧化物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述富醛基復(fù)合材料包括兩層，從內(nèi)到外依次為硅烷交聯(lián)劑層和多醛基化合物層。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述碳酸酐酶為α型或β型碳酸酐酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述固定化碳酸酐酶，每克固定化碳酸酐酶包含碳酸酐酶5(T300mg。
6.一種權(quán)利要求f 5任意一項(xiàng)所述固定化碳酸酐酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: O制備磁性納米顆粒； 2)取磁性納米顆粒和硅烷交聯(lián)劑均勻分散于有機(jī)溶劑中，低溫低速攪拌，獲得包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒； 3)取包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒，均勻分散于多醛基化合物的弱堿性緩沖液中，去除緩沖液，獲得醛基功能化的磁性納米顆粒； 4)取醛基功能化的磁性納米顆粒，加入待固定化的碳酸酐酶溶液，攪拌混合進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，即制得固定化碳酸酐酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備固定化碳酸酐酶的方法，其特征在于:步驟2)中，所述的硅烷交聯(lián)劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，所述有機(jī)溶劑為無水乙醇，將磁性納米顆粒與硅烷交聯(lián)劑超聲分散后，再將分散液加入到有機(jī)溶劑中，攪拌分散，從而使分散液與有機(jī)溶劑充分混勻，米用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備固定化碳酸酐酶的方法，其特征在于:步驟3)中，所述的多醛基化合物為戊二醛、丁二醛或丙二醛，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備固定化碳酸酐酶的方法，其特征在于:步驟4)中，所述醛基功能化的磁性納米顆粒與碳酸酐酶過共價(jià)鍵結(jié)合形成固定化碳酸酐酶；所述碳酸酐酶溶液濃度為f5mg/mL，碳酸酐酶與富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1:2?10。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化碳酸酐酶制備方法，其特征在于:步驟4)中，所述共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)條件為25?30°C，搖床混合2?5h，搖床轉(zhuǎn)速為12(T200r/min。
【文檔編號(hào)】C12N11/08GK104404024SQ201410616704
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】?？? 余允東, 張敏, 陳亭亭, 龍輝, 汪浩, 周曉青, 張燕, 陳風(fēng)義 申請人:上海立足生物科技有限公司