鱘魚虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鱘魚虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒包括無菌雙蒸水、10×Taq反應(yīng)緩沖液、dNTPs、正向引物5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′、反向引物5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′、熒光探針5′-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-3′，熒光探針5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記ROX，5U/μL Taq DNA聚合酶，標(biāo)準(zhǔn)陽性模板pMCP。該試劑盒定量準(zhǔn)確，檢測速度快，僅1小時(shí)，加上DNA提取的制備，共僅需2-3小時(shí)；方法易行，操作簡便；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣品檢測，準(zhǔn)確率高達(dá)98％。
【專利說明】鱘魚虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于鱘魚病害檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種鱘魚虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒不僅可使用目前存在市場上的所有類型熒光定量PCR儀器，更重要的是能快速地對鱘魚虹彩病毒進(jìn)行定量檢測。同時(shí)還涉及一種鱘魚虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的用途。
技術(shù)背景
[0002]鱘魚隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)福鰭亞綱(Actinopterygii)軟骨硬鱗總目(Chon drostei)鱘形目(Acipenseriformes),是現(xiàn)存的古老生物種群,廣泛分布于北半球。全世界現(xiàn)有鱘魚2科6屬26種，我國分布有8種，主要分布于長江流域、黑龍江流域和新疆3個(gè)區(qū)域。隨著鱘魚野生資源的不斷減少，為了保護(hù)鱘魚資源，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖研究人員和養(yǎng)殖者積極開展鱘魚的人工繁殖和養(yǎng)殖工作，目前國內(nèi)已開展的養(yǎng)殖品種有中華鱘(Acipenser sinensis Gray)、施氏鱘(A.schrenckii Brandt)、達(dá)氏鱘(A.dabryanusDuneril)等，但是隨著鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鱘魚的疾病也日漸增多，主要是由細(xì)菌和寄生蟲引起[田甜，楊元金，王京樹，張旭.鱘魚病害研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012, 51 (3): 559-562.]。國外對鱘魚病毒性疾病的研究相對起步較早，已報(bào)道有四種可感染鱘魚并在魚體內(nèi)分離到的病毒，他們分別是高首鱘虹彩病毒(white sturgeon iridovirus, WSIV),高首鱘皰疫病毒-1, II (white st urgeon herpesviruses-1, II，WSHV-1, II)和伊鋳虹彩病毒(Shovenosesturgeon iridovirus, SSI V)[王獲，劉紅柏，盧影巖，華育平，孫大江.鱘魚病毒性疾病研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2008，21(2):84-89.]，其中WSIV引起的鱘魚病毒性疾病發(fā)病率和死亡率最高。隨著鱘魚的人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，引種雜交和高密度養(yǎng)殖可能導(dǎo)致國內(nèi)鱘魚病毒病的爆發(fā)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，有必要建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測方法對其進(jìn)行監(jiān)控，保證鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。近年來，實(shí)時(shí)突光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR)以其特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、微生物和動(dòng)植物疾病檢疫方面得到了廣泛應(yīng)用。筆者針對鱘魚危害最嚴(yán)重的高首鱘虹彩病毒病建立了檢測高首鱘虹彩病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，旨在對高首鱘虹彩病毒進(jìn)行快速定性和定量檢測。而傳統(tǒng)的PCR法約需7個(gè)小時(shí)左右才能完成。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是在于提供了一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒不僅可使用目前存在市場上的所有類型熒光定量PCR儀器，更重要的是能快速地對高首鱘虹彩病毒進(jìn)行定量檢測。一次可檢測32-384個(gè)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒在高首鱘虹彩病毒病原檢測中的應(yīng)用，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且，熒光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2-3個(gè)小時(shí)就能完成，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時(shí)間。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0006]一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括以下組分:
[0007]A).陽性模板 pMCP
[0008]為含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個(gè)核苷酸片段(SEQ ID N0.4所示)的pMD19-T載體，即質(zhì)粒pMCP。該載體可在大腸桿菌E.coli DH5 a中增殖。
[0009]B).熒光定量反應(yīng)液:
[0010]1XTaq反應(yīng)緩沖液、dNTPs、正向引物和反向引物、熒光探針、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水。
[0011]正向引物為5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'；
[0012]反向引物為5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'；
[0013]熒光探針:5'-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
[0014]優(yōu)選的，突光定量反應(yīng)的體系為:
[0015]1XTaq 反應(yīng)緩沖液 2μ 1、2.5mmol/L dNTPs 0.4 μ 1、50 μ mol/L 正向引物和反向弓丨物各0.4μ l、25ymol/L的熒光探針0.4μ l、5U/y I Taq DNA聚合酶(λ 4 μ 1、無菌雙蒸水14 U I,待測樣品2 μ I。
[0016]優(yōu)選的，陽性模板pMCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ε.coli DH5 a增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測A26tl (所測樣品在吸收波長為260nm紫外線照射下的光密度)的定量并稀釋至I X 17Copies/ μ L，-20°C保存。
[0017]在本發(fā)明提供高首鱘虹彩病毒快速定量檢測高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR試劑盒中，有一條兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了兩基團(tuán)之間的FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對高首鱘虹彩病毒的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct, Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)圈數(shù)，Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。
[0018]一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒在制備高首鱘虹彩病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用，其步驟如下:
[0019]A)用標(biāo)準(zhǔn)陽性模板制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品，并用紫外分光光度計(jì)定量；
[0020]B)用DNA裂解液從待測標(biāo)本中提取DNA ；
[0021]C)分別取B)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的A)步中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品加入到含Taq D NA聚合酶和熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量檢測儀進(jìn)行PCR檢測；
[0022]D)通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
[0023]在本發(fā)明中提供的高首鱘虹彩病毒快速定量檢測高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR試劑盒可對高首鱘虹彩病毒進(jìn)行定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的PCR檢測方法。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0025]1、定量準(zhǔn)確；準(zhǔn)確性好，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1，變異系數(shù)為0.52% ;最低可檢測到10個(gè)病毒核酸分子拷貝數(shù)，特異性好。
[0026]2、檢測速度快，僅I小時(shí)，加上DNA提取的制備，共僅需2_3小時(shí)；
[0027]3、方法易行，操作簡便；
[0028]4、可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣品檢測，準(zhǔn)確率高達(dá)98%。
[0029]5.在本發(fā)明提供檢測高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR試劑盒中，針對高首鱘虹彩病毒檢測中的特殊性，對不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、退火溫度等的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)(熒光定量PCR技術(shù))和定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于高首鱘虹彩病毒定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了檢測高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR方法，并研制出檢測高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10拷貝數(shù)，完全可以滿足快速鑒別診斷高首鱘虹彩病毒的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為高首鱘虹彩病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0031]結(jié)果:拷貝數(shù)(X)與Ct的關(guān)系為:Ct = -3.2591gX+38.137 ;相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)到
0.9933，斜率為-3.259 ；
[0032]圖2為施氏鱘脾臟組織細(xì)胞出現(xiàn)病變的核酸提取物的擴(kuò)增曲線圖。
[0033]結(jié)果:為陽性；

【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
[0035]實(shí)施例1:
[0036]高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR試劑盒組成:
[0037]A).陽性模板 pMCP
[0038]為含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個(gè)核苷酸片段(SEQ ID N0.4所示)的pMD19-T載體。
[0039]B).熒光定量反應(yīng)液:
[0040]1XTaq反應(yīng)緩沖液、2.5mmol/L dNTPs、50 μ mol/L正向引物和反向引物、25 μ mol/L突光探針、5U/μ L Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水。
[0041]正向引物為5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'；
[0042]反向引物為5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'；
[0043]熒光探針:5'-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
[0044]自備試劑:20% PEG、蛋白酶K(5?lOmg/ml)、酚:氯仿(體積比1:1)、3mol/L醋酸鈉、70%乙醇、無水乙醇。
[0045]用于以下實(shí)施例。
[0046]實(shí)施例2:
[0047]高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。
[0048]A).模板制備:
[0049]將含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個(gè)核苷酸片段(SEQ ID N0.4所示)連接入PMD19-T載體，陽性質(zhì)粒pMCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測定陽性重組質(zhì)粒濃度為450 μ g/mL, A260/A280值為1.88。
[0050]并根據(jù)以下方法計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA拷貝數(shù)。
[0051]分子拷貝數(shù)(copies/μ L) = DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量，其中:DNA質(zhì)量濃度=260nm吸光度X稀釋倍數(shù)X 6.02 X 123 ；DNA分子量=DNA堿基數(shù)X 324.5。
[0052]B).標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
[0053]將陽性質(zhì)粒pMCP 進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，以 1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、I X 102、I X 1copies/ μ L作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0054]分別取不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒2 μ L，依次加入10 X Taq反應(yīng)緩沖液2 μ L、2.5mmol/LdNTPs 0.4 μ L、50 μ mol/L正向引物和反向引物各0.4 μ L、25 μ mol/L熒光探針引物0.4μ L、5U/y L Taq DNA聚合酶0.4 μ L，無菌雙蒸水14 μ 1，反應(yīng)總體系為20 μ I。將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù):95°C 1min ；95°C 10s，64°C 45s，共40個(gè)循環(huán)每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。
[0055]據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值的相關(guān)性，分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。橫坐標(biāo)代表質(zhì)粒模板拷貝數(shù)(X)，縱坐標(biāo)為Ct值，拷貝數(shù)(X)與Ct的關(guān)系為:Ct = -3.2591gX+38.137 ;相關(guān)系數(shù) R2 = 0.9933。
[0056]通過對重組質(zhì)粒各稀釋度核樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，本方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增最低可檢測到10個(gè)病毒核酸分子拷貝數(shù)。對同一陽性樣品在同一次試驗(yàn)間獲得的Ct值進(jìn)行分析，以檢驗(yàn)檢驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法穩(wěn)定性和重復(fù)性，結(jié)果表明，同一次試驗(yàn)內(nèi)72個(gè)平行樣的擴(kuò)增曲線在閾值線附近基本重合，Ct值讀數(shù)范圍為18.82?19.22，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1，變異系數(shù)為0.52% ;統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，本發(fā)明所建立的高首鱘虹彩病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法重復(fù)性好，可進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測。
[0057]實(shí)施例3:
[0058]特異性檢測:
[0059]以高首鱘虹彩病毒、高首鱘皰疹病毒-1，I1、鏟鱘虹彩病毒和施氏鱘脾臟組織細(xì)胞的基因組總DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測。
[0060]結(jié)果表明，高首鱘虹彩病毒總DNA模板有典型擴(kuò)增曲線，熒光信號值高，檢測結(jié)果為陽性。該樣品的對照組高首鱘皰疹病毒-1，I1、鏟鱘虹彩病毒和施氏鱘脾臟組織細(xì)胞的基因組總DNA無特異性擴(kuò)增信號。
[0061]實(shí)施例4:
[0062]一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒在制備高首鱘虹彩病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用，其步驟如下:
[0063]樣品:接種高首鱘虹彩病毒(WHITE STURGEON IRIDOVIRUS, WSIV)，出現(xiàn)病變的施氏鱘脾臟組織細(xì)胞。
[0064]1.高首鱘虹彩病毒熒光定量PCR試劑盒組成與配制，
[0065]試劑組成:
[0066]a).DNA 提取試劑:20% PEG、蛋白酶 K(5_10mg/ml)、酚:氯仿(體積比 1:l)、3mol/L醋酸鈉、70%乙醇、無水乙醇。
[0067]b).標(biāo)準(zhǔn)陽性模板pMCP，為含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個(gè)核苷酸片段(SEQID N0.4所示)的pMD19-T載體。
[0068]c).熒光定量反應(yīng)液體系:PCR 1Xbuffer 2 μ 1，正向引物和反向引物各
0.4μ l(50ym ol/L)，熒光探針 0.4μ I (25 μ mol/L)，dNTPs 0.4 μ I (lOmmol/L), Taq DNA 聚合酶0.4μ 1(5υ/μ 1)，無菌雙蒸水14μ I。
[0069]正向引物為5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'；
[0070]反向引物為5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'；
[0071]熒光探針:5'-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
[0072]2.用高首鱘虹彩病毒快速定量檢測的熒光定量PCR試劑盒檢測高首鱘虹彩病毒樣品
[0073]Α)取高首鱘虹彩病毒接種施氏鱘脾臟組織細(xì)胞出現(xiàn)病變以后于-80°C至室溫條件反復(fù)凍融三次，4000r離心30min,取上清轉(zhuǎn)移至35mL超速離心管中，20000r離心2h,用750 μ I水懸浮病毒沉淀，加入等體積預(yù)冷的20% PEG 8000，反復(fù)顛倒數(shù)次，室溫放置30min ;室溫12000r/min離心5min,棄去上清；加入100 μ I滅菌水，重懸病毒粒子，加入?ομ I蛋白酶K(5-10mg/ml)，50°C溫浴Ih ;加入等體積的酚:氯仿(I:1)抽提，室溫12000r/min離心5min,取上清至另一離心管；加入加1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，_20°C放置20min ；4°C 12000r/min離心15min，棄上清；加入500 μ I70%乙醇，12000r/min離心5min，棄掉上清，并揮發(fā)去乙醇，沉淀用20ul滅菌雙蒸水溶解備用。.
[0074]B)將陽性標(biāo)準(zhǔn)模板(試劑b)系列稀釋為1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、I X102、I XlOcopies/μ L，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0075]C)分別取熒光定量PCR反應(yīng)液(試劑c)各18 μ 1，取第Α)步所得DNA和第B)步稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)模板各2 μ 1，反應(yīng)總體系為20 μ 1，并設(shè)陰性對照，分別加入不同的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為:95°C預(yù)變1min ；94V 10s,64V 45s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。把熒光檢測的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測波長為530nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件，對樣本進(jìn)行分析，結(jié)果如下:
[0076]該樣品為陽性(圖2實(shí)驗(yàn)組)。Ct值為:22.46，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中病毒核酸量約為 14 81Copies/μ L DNA0
【權(quán)利要求】
1.一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，其特征在于: 正向引物為 5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'； 反向引物為 5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'； 熒光探針:5' -FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: A).陽性模板pMCP 為含有SEQ ID N0.4所示核苷酸的pMD19-T載體； B).熒光定量反應(yīng)液: 1 X Taq反應(yīng)緩沖液、dNTPs、正向引物和反向引物、熒光探針、Taq DNA聚合酶、無菌雙蒸水。 正向引物為 5' -TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3'； 反向引物為 5' -AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3'； 熒光探針:5' -FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-R0X-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:該試劑盒用于高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的體系如下: 1XTaq反應(yīng)緩沖液2μ L、2.5mmol/L dNTPs 0.4 μ L、50 μ mol/L正向引物和反向弓丨物各0.4 4 1^、25 4 11101/1的熒光探針0.4 4 1、5~4 1 Taq DNA聚合酶0.4 μ 1、無菌雙蒸水14 U I，待測樣品2 μ I。
4.權(quán)利要求1?3所述的任何一個(gè)試劑盒在在制備高首鱘虹彩病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/93GK104328219SQ201410617814
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】周勇, 曾令兵, 孫愛義, 解旭東, 范玉頂, 徐進(jìn), 馬杰 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 鎮(zhèn)江水中仙漁業(yè)發(fā)展有限公司