一種香蕉多酚氧化酶基因、重組蛋白及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種香蕉多酚氧化酶基因、重組蛋白及其制備方法，該制備方法按照以下步驟實(shí)施：提取香蕉果肉的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用電子克隆的方法得到香蕉PPO的編碼區(qū)序列，構(gòu)建含有PPO的重組質(zhì)粒pQE 80L-PPO，將獲得的重組質(zhì)粒pQE 80L-PPO加入到大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞中得到香蕉PPO表達(dá)菌pQE 80L-PPO/M15；培養(yǎng)并純化得到香蕉PPO重組蛋白；該方法具有技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低、操作快速、蛋白表達(dá)量高等特點(diǎn)，并且制備的重組蛋白易于純化和具有生物學(xué)活性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種香蕉多酚氧化酶基因、重組蛋白及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種香蕉多酚氧化酶基因，本發(fā)明還涉 及一種香蕉多酚氧化酶的重組蛋白，本發(fā)明還涉及一種香蕉多酚氧化酶的重組蛋白的制備 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 國(guó)內(nèi)外對(duì)香蕉多酚氧化酶（PPO)基因的研究非常有限。美國(guó)專(zhuān)利公布了一種分 離香蕉PPO的核酸及其片段和衍生物的方法（Robinson，1998)。威廉斯蕉四種不同的PPO cDNA 片段 BPOI (906bp)，BPOII (901bp)，BP034 (925bp)和 BP035 (960bp)被擴(kuò)增出來(lái)，并 且用特異性引物擴(kuò)增得到BP0I2078bp的全長(zhǎng)基因，該基因含有一個(gè)85bp的內(nèi)含子，富含 58% AT，但該P(yáng)PO序列卻未在NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中登陸。四種PPO cDNA在生長(zhǎng)期和成熟期不 同組織中的表達(dá)狀況表明，香蕉PPO在果實(shí)生長(zhǎng)早期合成，在成熟的過(guò)程中被釋放。Grand Nain香蕉PPO基因部分序列被擴(kuò)增得大，該基因編碼141個(gè)氨基酸。Gros Michel香蕉在 42 °C 15min處理后4°C儲(chǔ)存延緩了香蕉果皮褐變，分析PPO基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，這與熱處理 后編碼香蕉PPO mRNA的表達(dá)量減少，導(dǎo)致酶活性降低有關(guān)。AAA和AA基因型香蕉果肉和果 皮PPO的褐變速率高于AAB和ABB基因型的。
[0003] 傳統(tǒng)克隆新基因的方法是采用克隆原位雜交篩選cDNA文庫(kù)或是利用基因特異 性引物進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增，其特點(diǎn)是花費(fèi)高、耗時(shí)、成功率低。電子克?。╥n Silico cloning)是近幾年來(lái)伴隨著EST (Expressed sequence tags)計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的一種基于計(jì) 算機(jī)分析的克隆基因的新方法。1994年美國(guó)Boguski開(kāi)始利用電子克隆方法發(fā)現(xiàn)新基因， 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究陳潤(rùn)生課題組于1996年也開(kāi)始了對(duì)電子克隆的研究（陳潤(rùn)生， 1999)。
[0004] 1975年建立的細(xì)胞融合技術(shù)使得真核生物基因在原核生物中進(jìn)行表達(dá)成為可能， 從而可以獲得自然界無(wú)法大量獲得的多肽和蛋白質(zhì)。大腸桿菌是首個(gè)用于重組蛋白表達(dá)的 宿主菌，它具有遺傳背景清楚、生長(zhǎng)繁殖快、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、成本低廉和表達(dá)外源基因產(chǎn)物 的水平高等特點(diǎn)。因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。
[0005] 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要由宿主菌、表達(dá)載體和外源基因構(gòu)成。當(dāng)前，應(yīng)用的最廣泛 的原核表達(dá)載體主要是PET載體和PQE載體。pET系統(tǒng)是目前在E. coli中克隆表達(dá)重組蛋 白最強(qiáng)大的系統(tǒng)，它是最初利用與啟動(dòng)子配套的能高效轉(zhuǎn)錄特定基因的外源RNA聚合酶， 構(gòu)建的T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)，目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)入宿主菌，經(jīng)過(guò) 誘導(dǎo)表達(dá)可以生產(chǎn)大量的目的蛋白。人們運(yùn)用基因工程技術(shù)已在PET系統(tǒng)中成功地表達(dá)了 多酚氧化酶、漆酶、蔗糖磷酸化酶、酪氨酸酶、人胸腺素 β 4二串體蛋白、碳青霉烯酶、骨形 態(tài)發(fā)生蛋白-2等蛋白。
[0006] 多酚氧化酶是酶促合成茶黃素反應(yīng)的關(guān)鍵酶。茶黃素具有極強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤、 降血脂、抗菌殺菌和消除自由基等藥理功能。其也是紅茶滋味和湯色的主要品質(zhì)成分，紅茶 湯色的"亮"和滋味的鮮爽度等都與茶黃素的含量有密切的關(guān)系。多酚氧化酶還可以應(yīng)用 于紅茶香氣和品質(zhì)的改善，以及茶飲料穩(wěn)定性的改善。多酚氧化酶催化蛋白質(zhì)形成分子內(nèi) 或分子間交聯(lián)，可改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、乳化性、凝膠特性、保水性和流變學(xué)特性等功能 特性。也可導(dǎo)致蛋白質(zhì)過(guò)敏原性的降低，甚至完全消除。隨著人們對(duì)多酚氧化酶新功能的 不斷挖掘，多酚氧化酶在食品領(lǐng)域必定有著廣泛的應(yīng)用。但是由于PPO在自然界含量較低， 在分離純化過(guò)程中易變性失活，且分離純化步驟繁瑣，得率低，因此制約了其在茶黃素酶法 合成、蛋白交聯(lián)等食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種香蕉多酚氧化酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種上述的香蕉多酚氧化酶的重組蛋白，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種香蕉多酚氧化酶重組蛋白的制備方法，旨在利用大 腸桿菌易培養(yǎng)、繁殖快、易誘導(dǎo)、在短時(shí)間內(nèi)能廉價(jià)地大量生產(chǎn)所需酶類(lèi)的特點(diǎn)，應(yīng)用基因 工程技術(shù)，克隆香蕉PPO基因，構(gòu)建表達(dá)工程菌，獲得工程蛋白酶，拓寬工業(yè)用多酚氧化酶 的渠道。
[0010] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種香蕉多酚氧化酶重組蛋白的制備方法，具體按 照以下步驟實(shí)施：
[0011] 步驟1、提取香蕉果肉的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到反轉(zhuǎn)錄的CDNA ;
[0012] 步驟2、利用電子克隆的方法得到香蕉PPO的編碼區(qū)序列，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得 到香蕉PPO的編碼區(qū)序列；
[0013] 步驟3、構(gòu)建含有步驟2的PPO的編碼區(qū)序列的重組質(zhì)粒pQE80L-PP0 ;
[0014] 步驟4、將步驟3獲得的重組質(zhì)粒pQE80L-PP0加入到大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞中， 于冰上放置30min后于42°C水浴熱擊90s ;加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)Ih后涂布于含 氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板，37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜，得到香蕉PPO表達(dá)菌PQE80L-PP0/ M15 ；
[0015] 步驟5、培養(yǎng)香蕉PPO表達(dá)菌pQE80L-PP0/M15,使用IPTG誘導(dǎo)香蕉ΡΡ0,產(chǎn)生香蕉 PPO重組蛋白，其中IPTG誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0.6mM，誘導(dǎo)時(shí)間為6h ;
[0016] 步驟6、純化香蕉PPO重組蛋白，得到香蕉PPO重組蛋白，所述香蕉PPO重組蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0017] 進(jìn)一步地，步驟1中香蕉果肉的總RNA的提取具體按照以下步驟實(shí)施：
[0018] 提取緩沖液內(nèi)含2% CTAB、pH9. 0、100mM Tris-硼酸、I. 4M NaCl、pH8. 0、20mM EDTA 和2%PVP-K30,用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2%，將其預(yù)熱至60°C ;果肉用液氮速 凍后研磨成粉末，每〇. 2g果肉加入ImL提取緩沖液，渦旋混勻，于60°C放置30min，每隔 5-10min顛倒混勻1次；向提取混合液中添加0. 5M CaC12使其摩爾濃度為lOOmM，25°C放 置20min;冷至室溫，用等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提，混勻，靜置分層，室溫12000r/ min離心5min;取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提，混勻，靜置分層，室溫 12000r/min離心5min ;上清液加10M LiCl至終濃度為3M，-20°C中放置12h，4°C下12000r/ min離心20min ;小心倒掉上清，沉淀用0. 5mL3M LiCl洗漆至少3次；沉淀用0. 3mL DEPC 水溶解，再用等體積的水飽和酚，氯仿順序抽提；吸取上清液，加入1/15體積的pH5. 2、3M NaAc和1/5體積無(wú)水乙醇，冰上放置0. 5h，4°C下以12000r/min離心20min ;上清液加1/10 體積3M NaAc (pH5. 2)和3倍體積無(wú)水乙醇放在-70冰箱里沉淀2h，4°C下12000r/min離心 20min，沉淀物用0. 5mL75%乙醇洗滌2次，0. 5mL無(wú)水乙醇洗滌一次，每次都經(jīng)12000r/min 離心lmin，室溫干燥后溶于RNase-free水中；取RNA樣品通過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃 度和質(zhì)量，剩余的RNA樣品于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019] 進(jìn)一步地，步驟2中電子克隆香蕉PPO具體按照以下步驟實(shí)施：
[0020] 以步驟1中的反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用上游引物FPl :5 ' -tcgatcc tgttctcggcttc-3';下游引物 RP1:5' -cgatggtgcggcti:ttattttcc-3';進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 其中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 10s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
[0021] 進(jìn)一步地，步驟3中構(gòu)建表達(dá)載體具體按照以下步驟實(shí)施：
[0022] 根據(jù)步驟2得到的香蕉PPO基因序列，設(shè)計(jì)上游引物：含有內(nèi)切酶KpnI的 FPQE25' -CGGggtacc CCG atgactgca aat gccaagctcgac-3' ；含有內(nèi)切酶 Hind III 的下游 引物：RPQE5' -CCCAagcttGGtcaatttgggaaatcgat-3' ；利用此對(duì)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，其中， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 10s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min ;
[0023] 用凝膠回收試劑盒對(duì)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，將切膠回收后的PCR產(chǎn)物 和PQE80L載體分別用Kpn I和Hind III進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將兩個(gè)雙酶切產(chǎn)物于 16°C連接12h左右，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，于37°C培養(yǎng)過(guò)夜；挑 取出單菌落，即為重組質(zhì)粒PQE80L-PP0,在表達(dá)載體pQE80L多克隆位點(diǎn)的Kpn I和Hind III插入了不含終止密碼子的豬FTO基因⑶S區(qū)，使重組表達(dá)載體pQE80L-PP0的N端融合 了 6XHis 標(biāo)簽。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟3中表達(dá)條件為：將步驟3獲得的重組質(zhì)粒PQE80L-PP0加入到冰 預(yù)冷的大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上放置30min后于42°C水浴熱擊90s ;加入無(wú)抗生 素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)Ih后涂布于含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板，36. 8 °C下以220rpm 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到香蕉PPO表達(dá)菌PQE80L-PP0/M15,工程菌培養(yǎng)于SOB培養(yǎng)基中，用0. 6mM IPTG，0. 25mM Cu2+，37°C誘導(dǎo)表達(dá)6h，得到香蕉香蕉多酚氧化酶重組蛋白。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用香蕉基因組信息進(jìn)行電子克隆得到香蕉PPO基 因，并利用RT-PCR技術(shù)從香蕉果肉中克隆了香蕉PPO基因的序列，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌 中的高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物香蕉PPO重組蛋白具有生物學(xué)活性。該方法具有技術(shù)簡(jiǎn)單、成本 低、操作快速、蛋白表達(dá)量高等特點(diǎn)，并且制備的重組蛋白易于純化和具有生物學(xué)活性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是本發(fā)明提取緩沖液對(duì)RNA完整性的影響的電泳圖片，其中，M:200bp Marker ;1 :RT-PCR 產(chǎn)物；
[0027] 圖2是本發(fā)明香蕉PPO PCR產(chǎn)物膠回收電泳圖，其中，M:200bp Marker ;1 :膠回收 PCR產(chǎn)物；
[0028] 圖3是藍(lán)白斑篩選；
[0029] 圖4是本發(fā)明菌液PCR鑒定結(jié)果，其中，M:200bp Marker ; 1-3 :菌液PCR產(chǎn)物；
[0030] 圖5是本發(fā)明帶有酶切位點(diǎn)香蕉PPO基因擴(kuò)增結(jié)果，其中，M:200bp Marker ; l-4:BXPP02(Kpn I/HindIII)；
[0031] 圖6是本發(fā)明帶有酶切位點(diǎn)香蕉PPO基因擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收結(jié)果，其中，M:200bp Marker ；1 ：BXPP02(Kpn I/HindIII)；
[0032] 圖 7 是本發(fā)明菌液 PCR 鑒定結(jié)果，其中，M:200bp Marker ;7-8 :BXPP02(Kpn I/ HindIII)；
[0033] 圖8是本發(fā)明雙酶切PQE80L及PP0-pMD19-T產(chǎn)物膠回收結(jié)果，其中，M: Ikb Marker ；1:PQE80L ；2:BXPP02(Kpn I/HindIII) ；3:ΒΧΡΡ01(Κρη I/HindIII)；
[0034] 圖 9 是本發(fā)明菌液 PCR 鑒定結(jié)果，其中，M:200bp Marker ;1-2:ΒΧΡΡ02(Κρη I/ HindIII)；
[0035] 圖10是本發(fā)明BXPP0-PQE80L重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果，其中，M: Ikb Marker ; 1:BXPP02-PQE80L ；2:BXPP01-PQE80L ；
[0036] 圖11是本發(fā)明pQE80L-PP0重組表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜；
[0037] 圖12是本發(fā)明BXPP02_pQE801重組蛋白包涵體分析，M :Protein Marker ;1:菌體 超聲破碎后全液；2:菌體超聲破碎后離心上清；3 :菌體超聲破碎后離心沉淀；
[0038] 圖13是本發(fā)明香蕉PPO包涵體純化結(jié)果，其中，M :Protein Marker ;1:菌體超聲 破碎后全液；2:變性I懸浮PPO包涵體后離心上清；3 :變性II處理PPO包涵體的變性蛋白 液；4-5 :純化的香蕉PPO ;
[0039] 圖14是本發(fā)明香蕉PPO包涵體電泳圖，其中，M :Protein Marker ;l_4:5ul、10ul、 15ul、20ul香蕉PPO包涵體；
[0040] 圖15是本發(fā)明重組蛋白的質(zhì)譜分析。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0042] 實(shí)施例1香蕉果肉總RNA的提取及擴(kuò)增
[0043] 1. 1、香蕉果肉總RNA的提取
[0044] 氯化鋰沉淀法具體操作過(guò)程：提取緩沖液內(nèi)含2% CTAB，100mM Tris-硼酸 (pH9. 0)，I. 4MNaCl，20mMEDT(pH8. 0)，2% PVP-K30,用前加入 β -巰基乙醇至終濃度為 2%， 將其預(yù)熱至60°C ;果肉用液氮研磨成粉末，每0.2g果肉加入Iml提取緩沖液，渦旋混勻， 于60°C放置30min，每隔5-10min顛倒混勻1次；向提取混合液中添加0. 5M CaC12使其摩 爾濃度分別為100mM，25°C放置20min ;冷至室溫，用等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提，混 勻，靜置分層，室溫12000rpm離心5min ;取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提， 混勻，靜置分層，室溫12000rpm離心5min ;上清液加 IOM LiCl至終濃度為3M，-20°C中放 置12h，4°C下12000rpm離心20min ;小心倒掉上清，沉淀用0. 5ml3M LiCl洗滌至少3次； 沉淀用〇. 3ml DEPC處理水溶解，再用等體積的水飽和酚，氯仿順序抽提；吸取上清液，加入 1/15體積的3MNaAc(pH5. 2)和1/5體積無(wú)水乙醇，冰上放置0. 5h，4°C下以12000rpm離心 20min ;上清液加1/10體積3MNaAc(pH5. 2)和3倍體積無(wú)水乙醇放在-70冰箱里沉淀2h， 4°C下12000rpm離心20min，沉淀物用0. 5ml75%乙醇洗滌2次，0. 5ml無(wú)水乙醇洗滌一次， 每次都12000rpm離心lmin，室溫干燥后溶于RNase-free水中，得到純度高、得率高和完整 性好的總RNA。
[0045] 實(shí)施例2香蕉多酚氧化酶基因的電子克隆及RT-PCR驗(yàn)證
[0046] 2. 1、香蕉PPO基因的PCR擴(kuò)增
[0047] 以香蕉果肉總RNA為模板，合成cDNA第一鏈。然后以cDNA第一鏈為模板，用設(shè)計(jì) 的特異性引物（上游引物 FPl :5' -tcgatcc tgttctcggcttc-3' (SQE N0.4) ;RP1 :5' -C gatggtgcggcttttattttcc-3' (SQE NO. 5))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，得到了 2100bp和1050bp的2個(gè)條帶，且2100bp條帶比1050條帶片段更亮（圖1)。 2100bp的條帶與預(yù)期片段大小一致。
[0048] 2. 2、香蕉PPO基因的PCR產(chǎn)物克隆與鑒定
[0049] 將21OObp大小的片段切膠回收，采用TIANGEN普通型瓊脂糖DNA回收試劑盒 (DP209)純化回收，得到單一的條帶（圖2)。膠回收PCR產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn) 化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩 選，結(jié)果如圖3所示。平板上有很多白色的菌落，說(shuō)明克隆重組質(zhì)粒成功的轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)白色菌落，接種于LBA液體培養(yǎng)基中。挑取3管菌液做 菌液PCR鑒定。圖4顯示，在2100bp處擴(kuò)增出條帶非常亮的產(chǎn)物，證明克隆子為陽(yáng)性克隆。 將3個(gè)克隆子送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
[0050] 2. 3、香蕉PPO基因的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果分析
[0051] 3個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序得到一致的cDNA序列，序列長(zhǎng)2116bp。通過(guò)ORF Finder工具 對(duì)所獲得的cDNA序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框架分析，發(fā)現(xiàn)其有兩個(gè)完整的閱讀框架。較長(zhǎng)的閱 讀框架位于第350-2116位之間，推測(cè)編碼588個(gè)aa。較短的閱讀框架位于第470-2116位 之間，推測(cè)編碼533個(gè)aa。在cDNA5'端第350位和第470位存在起始密碼子ATG，3'端的 2116處存在終止密碼子TGA。測(cè)序得到香蕉PPO的cDNA長(zhǎng)短兩個(gè)完整的閱讀框架分別記 為 BXPPOl和 BXPP02。
[0052] 從 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到 Musa acuminataAAA Group Cavendish banana polyphenol oxidase mRNA的部分序列EU880277. 1。用此序列作為探針在NCNI數(shù) 據(jù)庫(kù)進(jìn)行香蕉EST數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast檢索，只有ES436966. 1與基因探針有96 %的匹 配率。將ES436966. 1序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行香蕉WGS數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast檢索得 到 contig_1794(CAIC01022631. 1)。序列分析表明 contig_1794(CAIC01022631. 1)長(zhǎng) 度為5643 Ibp，與ES436966. 1在24483bp-25362bp之間有99 %的一致性，表明新香蕉 PPO基因可能存在于c〇ntig_1794(CAIC01022631. 1)之中。用FGENESH軟件在線(xiàn)分析 contig_1794(CAIC01022631. 1)，得到可能的香蕉PPO基因 CDS序列NBPP02。序列通過(guò) Blasx檢索后，能夠檢索到PPO同源蛋白，具有PP01_DWL和PP01_KFDV兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，可以確 定NBPP02是香蕉PPO基因序列。NBPP02通過(guò)Blast新穎性檢測(cè)，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)與 NBPP02完全一致的基因序列，可以判斷NBPP02是新的香蕉PPO基因。
[0053] 實(shí)施例3原核表達(dá)載體PQE80L-PP0的構(gòu)建
[0054] 3. 1、香蕉PPO基因擴(kuò)增
[0055] 根據(jù)實(shí)施例2得到的香蕉PPO基因序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，其中，上游引物： FPQE25，-CGGggtacc CCG atgactgca aat gccaagctcgac-3，（K pn I) (SQE NO. 6);下游引 物：RPQE5'-CCCAagcttGGtcaatttgggaaatcgat-3'（Hind III)(SQE N0.7)。利用此對(duì)引物 進(jìn)行？0?擴(kuò)增，其中沖0?擴(kuò)增反應(yīng)條件為951：51^11;941：3〇8,551：3〇8,721：1〇8,30個(gè)循 環(huán)；72°C 5min，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到1600bp大小的BXPP02片段（帶有Kpn I和Hind III限 制性酶切位點(diǎn)），如圖5所示。
[0056] 其中，25ul反應(yīng)體系為：2XES Master Mixl2. 5ul，上游引物（IOuM) lul，下游引物 (IOuM) Iul，質(zhì)粒 0· 5ul，RNase-Free WaterlOul。
[0057] 3. 2、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pQE80L-PP0
[0058] 采用TIANGEN普通型瓊脂糖DNA回收試劑盒（DP209)對(duì)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純 化回收，將1600bp大小的片段切膠回收，得到單一的條帶（如圖6所示），膠回收PCR產(chǎn)物 與PMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp、X-gal和IPTG 的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)白色菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中。 挑取2管菌液做菌液PCR鑒定。圖7顯示，都擴(kuò)增出相應(yīng)大小片段產(chǎn)物，證明克隆子為陽(yáng)性 克隆。
[0059] 將切膠回收后的PP0-pMD19-T質(zhì)粒和pQE80L載體分別用Kpn I和Hind III進(jìn) 行雙酶切，其酶切體系采用Fermentas FastDigest enzymes進(jìn)行雙酶切，具體操作步驟如 下：
[0060] 表1質(zhì)粒PP0-PQE80L雙酶切體系
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種香蕉多酚氧化酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種如權(quán)利要求1所述的香蕉多酚氧化酶的重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 3 所示。
3. -種香蕉多酚氧化酶重組蛋白的制備方法，其特征在于，具體按照以下步驟實(shí)施： 步驟1、提取香蕉果肉的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA ; 步驟2、利用電子克隆的方法得到香蕉PP0的編碼區(qū)序列，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得到香 蕉PP0的編碼區(qū)序列； 步驟3、構(gòu)建含有步驟2的PP0的編碼區(qū)序列的重組質(zhì)粒pQE80L-PP0 ; 步驟4、將步驟3獲得的重組質(zhì)粒pQE80L-PP0加入到大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞中，于 冰上放置30min后于42°C水浴熱擊90s ;加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)lh后涂布于含 氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板，37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜，得到香蕉PP0表達(dá)菌PQE80L-PP0/ M15 ； 步驟5、培養(yǎng)香蕉PP0表達(dá)菌pQE80L-PP0/M15,使用IPTG誘導(dǎo)香蕉PP0,產(chǎn)生香蕉PP0 重組蛋白，其中IPTG誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0. 6mM，誘導(dǎo)時(shí)間為6h ; 步驟6、純化香蕉PP0重組蛋白，得到香蕉PP0重組蛋白，所述香蕉PP0重組蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟1中香蕉果肉的總RNA的提取具體按照以下步驟實(shí)施： 提取緩沖液內(nèi)含 2% CTAB、pH9. 0、100mM Tris-硼酸、1.4M NaCl、pH8. 0、20mM EDTA 和 2% PVP-K30,用前加入0 -巰基乙醇至終濃度為2%，將其預(yù)熱至60°C ;果肉用液氮速凍后 研磨成粉末，每〇. 2g果肉加入lmL提取緩沖液，潤(rùn)旋混勻，于60°C放置30min，每隔5-10min 顛倒混勻1次；向提取混合液中添加0. 5M CaC12使其摩爾濃度為100mM，25°C放置20min ; 冷至室溫，用等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提，混勻，靜置分層，室溫12000r/min離心 5min ;取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提，混勻，靜置分層，室溫12000r/min 離心5min ;上清液加lOMLiCl至終濃度為3M，-20°C中放置12h，4°C下12000r/min離心 20min ;小心倒掉上清，沉淀用0. 5mL3MLiCl洗滌至少3次；沉淀用0. 3mL DEPC水溶解， 再用等體積的水飽和酚，氯仿順序抽提；吸取上清液，加入1/15體積的pH5. 2、3MNaAc和 1/5體積無(wú)水乙醇，冰上放置0. 5h，4°C下以12000r/min離心20min ;上清液加1/10體積 3MNaAc(pH5. 2)和3倍體積無(wú)水乙醇放在-70冰箱里沉淀2h，4°C下12000r/min離心20min， 沉淀物用〇. 5mL75 %乙醇洗滌2次，0. 5mL無(wú)水乙醇洗滌一次，每次都經(jīng)12000r/min離心 lmin，室溫干燥后溶于RNase-free水中；取RNA樣品通過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和 質(zhì)量，剩余的RNA樣品于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> 5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟2中電子克隆香蕉PP0具體按照以下步驟實(shí)施： 以步驟1中的反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用上游引物FP1 :5 ' -tcgatcc tgttctcggcttc-3';下游引物 RP1:5' -cgatggtgcggcttttattttcc-3';進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 其中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 10s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟3中構(gòu)建表達(dá)載體具體按照以下步驟實(shí)施： 根據(jù)步驟2得到的香蕉PPO基因序列，設(shè)計(jì)上游引物：含有內(nèi)切酶Kpn I的 FPQE25' -CGGggtacc CCG atgactgca aat gccaagctcgac-3' ；含有內(nèi)切酶 Hind III 的下游 引物：RPQE5' -CCCAagcttGGtcaatttgggaaatcgat-3' ；利用此對(duì)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，其中， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為 95°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 10s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min ; 用凝膠回收試劑盒對(duì)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，將切膠回收后的PCR產(chǎn)物和 PQE80L載體分別用Kpn I和Hind III進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將兩個(gè)雙酶切產(chǎn)物于16°C 連接12h左右，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，于37°C培養(yǎng)過(guò)夜；挑取出 單菌落，即為重組質(zhì)粒PQE80L-PP0,在表達(dá)載體pQE80L多克隆位點(diǎn)的Kpn I和Hind III 插入了不含終止密碼子的豬FTO基因CDS區(qū)，使重組表達(dá)載體pQESOL-PPO的N端融合了 6XHis標(biāo)簽。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的香蕉多酚氧化酶重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟3中表達(dá)條件為：將步驟3獲得的重組質(zhì)粒pQE80L-PP0加入到冰預(yù)冷的大腸桿菌M15感 受態(tài)細(xì)胞中，于冰上放置30min后于42°C水浴熱擊90s ;加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) lh后涂布于含氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板，36.8°C下以220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到香 蕉PPO表達(dá)菌PQE80L-PP0/M15,工程菌培養(yǎng)于SOB培養(yǎng)基中，用0. 6mM IPTG，0. 25mM Cu2+， 37°C誘導(dǎo)表達(dá)6h，得到香蕉香蕉多酚氧化酶重組蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104404007SQ201410620945
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】袁德保, 李奕星, 李芬芳, 王朝政, 周婭, 金志強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站