由血清microRNA組成的肝癌診斷標志物及診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種由血清microRNA組成的肝細胞肝癌診斷組合，以及含有該組合的試劑盒。所述肝癌診斷組合包括如下microRNAs：hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-133a、hsa-miR-143、has-miR-145、hsa-miR-192以及hsa-miR-505。本發(fā)明可用于區(qū)分肝癌患者與健康人、肝炎病毒攜帶者、慢性肝炎患者或肝硬化患者。
【專利說明】由血清microRNA組成的肝癌診斷標志物及診斷試劑盒

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一個由血清microRNA組成的肝癌診斷組合，所述的血清microRNA包 括 hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192 以 及hsa-miR-505,具體涉及一個用于原發(fā)性肝細胞肝癌預警以及早期診斷試劑盒的應用，屬 于生物醫(yī)學診斷領域。

【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤，其中肝細胞肝 癌（簡稱肝癌，他口&1:〇〇61111131'〇31'(3；[1101]^，!1(]〇占原發(fā)性肝癌的90 (%以上。世界衛(wèi)生組 織發(fā)表的《全球癌癥報告2014》指出，2012年全球肝癌新發(fā)病例位列惡性腫瘤的第五位，其 致死率則位居第二位，其中中國肝癌的新發(fā)及死亡病例均約占全球病例的一半。由于缺乏 有效的篩查手段，導致60% -70%的肝癌患者診斷時已處于晚期，錯失根治性切除機會。可 見，早期診斷，早期治療是增加肝癌患者生存率，降低肝癌死亡率最有效的途徑。
[0003] 肝癌的發(fā)生發(fā)展過程是一個多因素、多階段、多步驟的過程。任何原因引起的肝硬 化是肝癌最常見的危險因素。在亞洲，慢性乙型肝炎病毒（HBV)引發(fā)的肝炎、肝硬化是誘發(fā) 肝癌最主要的風險因素。絕大多數(shù)肝癌患者伴有肝炎和肝硬化病理改變，在歷經(jīng)肝炎、肝硬 化階段后，最終發(fā)展為肝癌，人們稱之為"肝癌三部曲"。據(jù)估計，中國乙型肝炎攜帶者數(shù)量 近1. 2億，其中20%將發(fā)展成為慢性乙型肝炎患者，15% -40%的慢性乙型肝炎患者則將進 一步發(fā)展為肝硬化。因此，對肝癌高危人群進行長期監(jiān)測，及早發(fā)現(xiàn)并預警早期肝癌，便于 確定針對性的個體化防治方案，延緩甚至防止肝癌的發(fā)生，有利于改善患者生存質(zhì)量。
[0004] 美國國家癌癥研究所創(chuàng)立的早期檢測研究網(wǎng)絡（Early Detection Research Network，EDRN)明確提出篩選、評估癌癥早期標志物的五個步驟：1)篩選發(fā)現(xiàn)可能的標志 物分子；2)大規(guī)模的回顧性研究分析；3)回顧性分析候選標志物在前瞻性收集的高危人群 標本中的檢測效果；4)前瞻性觀察候選標志物對疾病的檢測效果；5)前瞻性臨床隨機試 驗，篩查普通人群。目前臨床上主要通過血清甲胎蛋白（AFP)檢測或影像學檢查篩查肝癌。 雖然AFP用于肝癌篩查已多年，但其診斷的敏感性不夠高：約35-50%肝癌患者的AFP水平 仍低于警戒值（20ng/ml) ;AFP在早期肝癌篩查中的檢出率僅22%，甚至在診斷前一年或數(shù) 個月內(nèi)低至3% (200ng/ml為閾值）。盡管超聲、CT、MRI等影像學檢查方法可以作為AFP 檢測的補充，然而用于長期隨訪篩查則費用昂貴，而且這些方法的檢出率有賴于腫瘤大小 及操作者的經(jīng)驗，因而可能出現(xiàn)誤診、漏診的情況。因此，發(fā)現(xiàn)新的高敏感性、高特異性，且 低廉又易于檢測的肝癌早期診斷標志物具有重要的臨床意義。
[0005] Mi croRNA是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，長度為 18-24個核苷酸（nt)。MicroRNA通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，調(diào)控細胞分化、增 殖、凋亡等生命活動，在胚胎發(fā)育、機體代謝、疾病發(fā)生發(fā)展等多種生理和病理過程中發(fā) 揮重要作用。近年來，研究人員在血液、唾液、尿液等多種體液中檢測到microRNA，提出 循環(huán)microRNA的概念。血液等體液標本易于獲得，臨床可操性強且創(chuàng)傷性小，而且循環(huán) microRNA穩(wěn)定性好，檢測便利，因此，循環(huán)microRNA具有作為腫瘤等疾病無創(chuàng)性生物標志 物的潛能，適用于高危人群篩查。
[0006] 新近研究指出，肝癌患者與非肝癌對照具有不同的循環(huán)microRNA表達譜。例如， miR-21、miR-122、miR-223在肝癌患者以及HBV肝炎患者血清中的水平均高于健康人；而 在肝癌患者血漿中升高的miR-21在患者切除術(shù)后下調(diào)；Li等人通過檢測513例個體血 清microRNA表達譜，確定了區(qū)分HBV肝炎患者與健康人以及肝癌患者與健康人的分類組 合；Zhou等人檢測了近千份血楽標本microRNA的水平，發(fā)現(xiàn)由miR-122, miR-192, miR-21, miR-223,miR-26a，miR_27a以及miR-801等七個循環(huán)microRNA構(gòu)成的分類模塊，能區(qū)分肝 癌與所有非肝癌群體總和（包括健康人，肝炎、肝硬化患者），并可診斷AFP陰性的肝癌。這 些研究提示循環(huán)microRNA作為肝癌診斷標志物的潛能。
[0007] 然而目前關(guān)于循環(huán)microRNA作為肝癌診斷標志物的研究仍存在以下不足：1)大 部分研究只是挑選了前人報道的在肝癌組織表達失調(diào)的microRNAs作為候選指標，可能無 法全面客觀反映循環(huán)microRNA的情況；2)部分研究樣本量少，缺乏多中心驗證；3)對照 設置不完善，難以說明確定的標志物為肝癌特異的診斷標志物；4)目前所有研究均是在已 診斷為肝癌的標本中進行的回顧性分析，缺乏在高危人群中的前瞻性研究，未能明確循環(huán) microRNA用于肝癌早期預警的價值。因此，目前仍然有必要發(fā)現(xiàn)具有臨床應用價值的肝癌 早期診斷標志物，用于肝癌高危人群的監(jiān)測，從而及早預警早期小肝癌，便于臨床醫(yī)生及 時采取恰當?shù)姆乐未胧?br>

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對以上要解決的技術(shù)問題，提供一種有效的肝癌診斷標志物。
[0009] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種肝癌診斷標志物，其由分別編碼以下 microRNA 的核酸分子組成：hsa_miR-29a、hsa_miR-29c、hsa_miR-133a、hsa-miR-143、 hsa-miR-145、hsa_miR-192 以及 hsa_miR-505〇
[0010] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述microRNA在肝癌患者血清中的水平高于健康人、 乙型肝炎攜帶者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者。優(yōu)選地，所述肝癌為原發(fā)性肝細胞肝 癌。
[0011] 另一方面，本發(fā)明還提供了 一種用于肝癌診斷的microRNA分子組合，其由 hsa_miR-29a、hsa_miR-29c、hsa_miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192 以及 hsa-miR-505 組成。
[0012] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述microRNA在肝癌患者血清中的水平高于健康人、 乙型肝炎攜帶者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者。優(yōu)選地，所述肝癌為原發(fā)性肝細胞肝 癌。
[0013] 具體而言，本發(fā)明通過以下步驟得到了上述由7個血清microRNAs組成的肝癌診 斷組合：
[0014] 1.通過高通量qPCR Array篩選肝癌患者與慢性乙型肝炎患者差異的候選血清 microRNAs ；
[0015] 2.實時熒光定量PCR驗證候選血清microRNAs ;
[0016] 3.在由健康人、肝炎、肝硬化、肝癌患者組成的訓練組中確立可區(qū)分肝癌與非癌對 照（包括健康人、肝炎及肝硬化患者）的血清microRNA組合；
[0017] 4.在兩個獨立驗證組驗證步驟3確立的血清microRNA組合診斷肝癌的效果；
[0018] 5.分析步驟3確立的血清microRNA組合在小肝癌、?M早期及AFP陰性的肝癌患 者中的診斷效果。
[0019] 對實驗結(jié)果進行分析及相關(guān)統(tǒng)計顯示：上述步驟1中，發(fā)明人通過高通量qPCR Array篩選確定了 19個候選microRNAs，并在步驟2中驗證了 19個候選microRNAs在肝癌 患者血清中的水平均升高。進一步檢測了候選microRNAs在訓練組（樣本量為257份）中 的水平，并確立了區(qū)分肝癌與非癌對照的最優(yōu)血清microRNA組合。進而在獨立的驗證組1 及驗證組2 (樣本量分別為352、139份）中驗證了該血清microRNA組合可以區(qū)分肝癌與非 癌對照。與此同時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相較傳統(tǒng)的肝癌篩查手段，如AFP，血清microRNA組合在小 肝癌、?M早期及AFP陰性的肝癌患者中具有更好的診斷效果。
[0020] 發(fā)明人進一步在前瞻性收集的高危人群（包括慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者） 標本中進行巢式對照病例研究。通過長期監(jiān)控1484位慢性乙型肝炎或肝硬化患者病情發(fā) 展，發(fā)明人在驗證組3中發(fā)現(xiàn)27例新發(fā)肝癌病例，收集每個病例肝癌診斷（定為零點，MO) 及其診斷前12、9、6、3個月（M-12, -9, -6, -3)的序列血清標本，同時收集135個性別年齡匹 配的慢性肝炎/肝硬化患者相應時間點的序列血清標本作為對照。
[0021] 對實驗結(jié)果進行分析及相關(guān)統(tǒng)計顯示：血清microRNA組合在肝癌早期診斷中具 有很好的預測效果，表現(xiàn)在：該組合預測肝癌的敏感性在每個時間點均高于AFP，并隨著時 間的推移逐漸提升；此外，血清microRNA組合的曲線下面積（AUC)均大于AFP。
[0022] 在另一個方面，本發(fā)明還公開了一種肝癌診斷的試劑盒，其包含用于檢測以 下 microRNA 分子在血清中水平的試劑：hsa_miR-29a、hsa_miR-29c、hsa_miR-133a、 hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa_miR-192 以及 hsa_miR-505〇
[0023] 在一個實施方案中，所述用于檢測microRNA分子在血清中水平的試劑為實時熒 光定量PCR相關(guān)試劑。
[0024] 在再一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包括血清RNA提取系統(tǒng)和反轉(zhuǎn)錄系 統(tǒng)。在優(yōu)選的實施方案中，該試劑盒還包括用于評估是否罹患肝癌的分析方法。在一個優(yōu) 選的實施方案中，所述試劑盒包括7對可用于檢測以下microRNA水平的LNA修飾引物： hsa_miR-29a、hsa_miR-29c、hsa_miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192、 hsa-miR-505。更優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括檢測外源參照NC67的LNA修飾引物。通 過外源參照NC67校準，得到上述7個目標基因在待檢血清標本中的水平2^ et (ACt = Cttaget-CtreferenJ。根據(jù)microRNAs閾值將檢測標本microRNAs 7jC平分別賦值為1或〇,實 現(xiàn)離散化。進一步根據(jù)邏輯回歸方法分析血清microRNA組合評估待測者是否罹患肝癌： Logit(p = HCC) =-〇. 356-0. 264*hsa-miR-29a_0. 081*hsa-miR-29c_0. 518*hsa_miR-133 a_0. 250*hsa-miR-143_0· 489*hsa_miR-145-〇· 466*hsa_miR-192-〇· 417*hsa_miR-505,其 中 hsa_miR-29a、hsa_miR-29c、hsa_miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192、 hsa-miR-505為相應血清microRNA檢測水平離散化后的數(shù)值，并以0. 5為診斷閾值，高于 〇. 5則診斷為肝癌，低于0. 5則診斷為非肝癌。由此，所述的診斷試劑盒可應用于肝癌預警。
[0025] 血清microRNA組合用于肝癌檢測及早期診斷的優(yōu)越性在于：（1)標本易于獲得， 臨床可操性強且創(chuàng)傷性小，而且血清microRNA穩(wěn)定性好，檢測便利。（2)實驗方法非常成 熟，檢測過程簡便、易于重復，由普通的技術(shù)員均可以完成。（3)本發(fā)明采用高通量篩選、 多中心驗證以及在前瞻性收集的高危人群標本中進行研究，對血清microRNA組合的效果 以及診斷試劑盒進行了全面評估，以上方法和策略的應用保證了本發(fā)明在肝癌臨床診斷 中的潛在應用價值，并為其他疾病生物標志物的研制提供可借鑒的方法策略。（4)血清 microRNA診斷肝癌試劑盒能夠及時反映肝癌患者的疾病狀態(tài)，避免既往繁雜檢測，節(jié)約時 間人力成本，便于臨床醫(yī)生及時采取個性化的防治方案。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例4、5在訓練組、驗證組中的ROC曲線圖。訓練組（A)，驗證組 I(B)以及驗證組2 (C)中血清microRNA組合及AFP區(qū)分肝癌與非癌對照（上圖）及高危人 群（下圖）的ROC曲線圖。
[0027] 圖2為本發(fā)明實施例5在巢式對照病例研究中的ROC曲線圖。肝癌患者診斷前 12 (A)，9⑶，6 (C)或3 (D)個月以及診斷時（E)血清microRNA組合及AFP區(qū)分肝癌與肝炎 /肝硬化對照的ROC曲線圖。
[0028] 圖3為本發(fā)明實施例6在小肝癌患者（腫瘤彡3cm)中的ROC曲線圖。訓練組（A)， 驗證組1〇)，驗證組2 (C)以及訓練組與所有驗證組（D)中血清microRNA組合及AFP區(qū)分 小肝癌患者與非癌對照（左圖）及高危人群（右圖）的ROC曲線圖。
[0029] 圖4為本發(fā)明實施例7在不同--!分期肝癌患者中的ROC曲線圖。血清microRNA 組合及AFP區(qū)分TW I期（A)，TW II期（B)或TW III/IV期（C)肝癌患者與非癌對照 (上圖）及高危人群（下圖）的ROC曲線圖。
[0030] 圖5為本發(fā)明實施例8在AFP陰性肝癌患者（AFP彡20ng/ml)中的ROC曲線圖。 訓練組（A)，驗證組1〇)，驗證組2 (C)以及訓練組與所有驗證組（D)中血清microRNA組合 區(qū)分AFP陰性肝癌患者與非癌對照（左圖）及高危人群（右圖）的ROC曲線圖。

【具體實施方式】
[0031] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理 解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍；所描述的附圖也僅是示意 性的，被認為是非限制性的。
[0032] 實施例1 :血清標本的采集及制備
[0033] 發(fā)明人于2009年8月至2014年8月采集了健康人（HC)、乙型肝炎攜帶者（IHC)、 慢性乙型肝炎患者（CHB)、肝硬化患者（LC)及肝癌患者（HCC)的血液標本，這些人群滿足入 組標準（表1)，并根據(jù)性別、年齡匹配的原則，設定肝癌及其對照組標本。
[0034] 訓練組：2009年8月至2012年3月采集的健康人（51例）、慢性乙型肝炎患者（51 例）、肝硬化患者（47例）以及肝癌患者（108例）的257份血清標本。
[0035] 驗證組I :2012年4月至2013年4月采集的健康人（60例）、慢性乙型肝炎患者 (68例）、肝硬化患者（71例）以及肝癌患者（153例）的352份血清標本。
[0036] 驗證組2 :2013年5月至2013年8月采集的健康人（48例）、乙型肝炎攜帶者（42 例）以及肝癌患者（49例）的139份血清標本。
[0037] 驗證組3 :2009年8月至2014年8月采集的慢性乙型肝炎或肝硬化患者（135例 共568份）以及肝癌患者（27例共100份）的668份序列血清標本，用于巢式對照病例研 究。具體情況為：招募1484位慢性乙型肝炎或肝硬化患者進行長期追蹤，每3個月進行一 次肝癌篩查，檢測AFP、AST、ALT等生化指標以及B超等影像學檢查，同時采集血清標本儲存 于-80°C。至2014年8月，1484位追蹤患者中新發(fā)肝癌27例，其中15例為組織病理確診， 12例為影像學診斷。
[0038] 上述參與人群的臨床特征見表2和表3。
[0039] 表1.參與人群的入組標準
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種肝癌診斷標志物，其由分別編碼以下microRNA的核酸分子組成：hsa-miR-29a、 hsa-miR-29c、hsa-miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192 以及 hsa_miR-505〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的肝癌診斷標志物，其中所述microRNA在肝癌患者血清中的水平高 于健康人、肝炎病毒攜帶者、慢性肝炎患者或肝硬化患者。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的肝癌診斷標志物，其中所述肝癌為原發(fā)性肝細胞肝癌。
4. 一種用于肝癌診斷的microRNA分子組合，其由hsa-miR_29a、hsa-miR_29c、 hsa_miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192 以及 hsa-miR-505 組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的microRNA分子組合，其中所述microRNA在肝癌患者血清中的水 平高于健康人、肝炎病毒攜帶者、慢性肝炎患者或肝硬化患者。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5的microRNA分子組合，其中所述肝癌為原發(fā)性肝細胞肝癌。
7. -種用于肝癌診斷的診斷試劑盒，其包含用于檢測以下microRNA分子在血清中 水平的試劑：hsa_miR-29a、hsa_miR-29c、hsa_miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、 hsa-miR-192以及hsa-miR-505。優(yōu)選地，所述用于檢測microRNA分子在血清中水平的試 劑為實時熒光定量PCR相關(guān)試劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的診斷試劑盒，其邏輯回歸公式為： Logit (p = HCC) =-〇. 356-0. 264*hsa-miR-29a_0. 081*hsa-miR-29c_0. 518*hsa_miR- 133a_0. 250*hsa-miR-143_0. 489*hsa_miR-145-〇. 466*hsa_miR-192-〇. 417*hsa_miR-505， 其中 hsa_miR-29a、hsa_miR-29c、hsa_miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、 hsa-miR-192、hsa-miR-505為相應血清microRNA檢測水平離散化后的數(shù)值，并以0. 5為診 斷閾值，高于〇. 5則診斷為肝癌，低于0. 5則診斷為非肝癌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的診斷試劑盒，其特征在于，所述的診斷試劑盒應用于肝癌預 警。優(yōu)選地，所述的肝癌預警的群體為慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群，優(yōu)選地，所述 的肝癌為原發(fā)性肝細胞肝癌。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項的診斷試劑盒在肝癌診斷中的應用。
【文檔編號】C12N15/113GK104372087SQ201410623463
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】莊詩美, 崇雨田, 林雪嘉, 郭智偉, 元云飛, 楊曉靜, 曾春賢, 方堅鴻 申請人:中山大學