一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子標記及其應用，它涉及一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭的分子標記及其應用。本發(fā)明要解決現(xiàn)在沒有一種準確有效鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭的方法的問題。本發(fā)明的用于PCR擴增分子標記的引物對為AF346686F和AF346686R，AF346686F:5’-AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3’，AF346686R:5’-ACT ACG GCT TTC TGG GAT-3’。本發(fā)明的分子標記用于鑒別白斑紅點鮭(Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點鮭(Salvelinus fominalis)。
【專利說明】-種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子 標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物分子遺傳學領域，具體地說，本發(fā)明涉及應用微衛(wèi)星標記對 白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品進行鑒別。

【背景技術】
[0002] 美洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)和白斑紅點鮭（Salvelinus Ieucomaenis) 都隸屬于鮭形目（Salmoniformes),鮭科（Salmonidae),紅點鮭屬（Salvelinus)。美洲紅 點鮭，俗稱七彩鮭魚。主要分布于北半球的60° Ν-4Γ N范圍內(nèi)，原產(chǎn)于加拿大東部五大 湖區(qū)、明尼蘇達州的密西西比河灣、佐治亞州的北部等地。美洲紅點鮭生長快、肉質(zhì)鮮美、營 養(yǎng)豐富，自2000年左右引入我國后迅速成為一種重要淡水養(yǎng)殖鮭科魚類。白斑紅點鮭，俗 稱白點鮭，原產(chǎn)于日本，1996年由中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所引入中國，白斑紅 點鮭定居性強，繁殖期死亡率低，目前已經(jīng)發(fā)展成一個冷水性魚類的主要養(yǎng)殖品種。在我國 的人工養(yǎng)殖條件下，二者的要求較為接近，繁殖水溫為KTC左右，繁殖高峰期均在10月下 旬到11月中旬，苗種孵出至開口攝食期間最佳的培育水溫為8-KTC，飼養(yǎng)期間水溫變化在 4. 7-16. 8°C。
[0003] 兩種魚體型特征和生長速度都較為相似，由于美洲紅點鮭體色艷麗，體表斑點有 多種顏色，而白斑紅點鮭體表斑點主要呈乳白色，僅憑這項特點即可從外觀上對上述兩種 魚進行區(qū)分。中國消費者對美洲紅點鮭七彩外觀有明顯的偏好，形成了對美洲紅點鮭的選 擇性消費偏好；另外從生產(chǎn)者角度考慮，美洲紅點鮭繁殖期死亡率顯著高于白斑紅點鮭，導 致養(yǎng)殖成本高于白斑紅點鮭。上述兩個因素直接引起美洲紅點鮭的市場價格要高于白斑紅 點鮭。但是，鮭魚主要以刺身（生魚片）和熏肉的形式銷售，而這兩種方法一般都需要將魚 皮剝?nèi)ィ@兩種魚的肉色、口感非常類似，因此，魚肉制成刺身及熏肉制品后通過感官檢 查很難區(qū)分其真假。于是，一些不法商販以白斑紅點鮭冒充美洲紅點鮭，獲取超額利潤，損 害了消費者利益。
[0004] 因此，現(xiàn)在急需一種準確有效地鑒別兩種魚的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子標記及應 用，解決目前沒有一種準確有效鑒別上述兩種魚的方法的問題。
[0006] 本發(fā)明的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子標記，用于 PCR擴增分子標記的引物對為AF346686F和AF346686R，具體序列為：
[0007] AF346686F: 5 ' -AGTCGTCGGCTTGTCTTC-3 '
[0008] AF346686R: 5 ' -ACTACGGCTTTCTGGGAT-3 '。
[0009] 本發(fā)明的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子標記的 應用，它用于鑒別白斑紅點鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)ο
[0010] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0011] 采用本發(fā)明的分子標記，從基因?qū)用鎸Π装呒t點鮭和美洲紅點鮭進行區(qū)分，從而 避免了通過肉眼感官檢查兩種魚的刺身及熏肉制品存在不準確，容易混淆的問題。
[0012] 通過本發(fā)明的引物進行PCR檢測微衛(wèi)星標記基因型，若檢測得到長度為250bp單 一片段，則待檢測樣品來源于白斑紅點鮭（Salvelinus Ieucomaenis);若檢測得到長度為 252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)。
[0013] 本發(fā)明所設計的引物對虹鱒的基因組DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物擴增片段長度 介于300?500bp之間，不與白斑紅點鮭和美洲紅點鮭基因組DNA所獲得PCR擴增產(chǎn)物長 度相一致；另外，虹鱒刺身和熏肉制品外觀可以憑肉眼感官檢查直接區(qū)分。因此，雖然該引 物針對虹鱒基因組序列設計獲得，但是該引物PCR擴增產(chǎn)物對白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺 身及熏肉制品進行鑒別區(qū)分并不會與虹鱒刺身及熏肉制品相混淆。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為利用引物AF346686F和AF346686R對白斑紅點鮭和美洲紅點鮭的擴增后的 電泳圖；其中，1-10泳道為美洲紅點鮭電泳圖，11泳道為DL2000marker，12-21泳道為白斑 紅點鮭電泳圖；
[0015] 圖2為利用引物AF346686F和AF346686R對白斑紅點鮭、美洲紅點鮭和虹鱒的擴 增后的電泳圖；其中，1-6泳道為美洲紅點鮭電泳圖，7-12泳道為白斑紅點鮭電泳圖，13泳 道為DL2000marker，14-19泳道為虹鱒電泳圖。

【具體實施方式】

【具體實施方式】 [0016] 一：本實施方式的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制 品的分子標記，用于PCR擴增分子標記的引物對為AF346686F和AF346686R，具體序列為：
[0017] AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3'
[0018] AF346686R:5, -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3，。
[0019] 本實施方式中的AF346686F和AF346686R序列如序列表Seq ID No : 1和Seq ID No :2所示。
[0020] 本實施方式的引物是依據(jù)虹鱒（Oncorhyncus mykiss)微衛(wèi)星（Genbank NO.AF346686)序列片段（詳見序列表Seq ID No:3所示）設計而成的。

【具體實施方式】 [0021] 二：本實施方式的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制 品的分子標記的應用，它用于鑒別白斑紅點鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點鮭 (Salvelinus fominalis)〇
[0022]

【具體實施方式】三：本實施方式與【具體實施方式】二不同的是：鑒別白斑紅點鮭 (Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)的方法如下：米用 PCR-LP方法，利用權利要求1的引物對，檢測待測樣品的微衛(wèi)星標記基因型，若檢測得到 長度為250bp單一片段，則待檢測樣品來源于白斑紅點鮭（Salvelinus Ieucomaenis); 若檢測得到長度為252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲紅點鮭 (Salvelinus fominalis),從而完成對白斑紅點鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美洲紅點 鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別。其它與【具體實施方式】二相同。

【具體實施方式】 [0023] 四：本實施方式與二或三不同的是：所述的采用 PCR-LP方法，利用權利要求1的引物對，檢測待測樣品的微衛(wèi)星標記基因型的具體操作如 下：
[0024] 一、提取待測樣品的基因組DNA，備用；
[0025] 二、以步驟一提取的基因組DNA為模板，利用AF346686F和AF346686R引物，進行 PCR反應；
[0026] 三、待步驟二的PCR反應結(jié)束后，收集PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，觀察電泳條帶，若 電泳得到長度為250bp的單一片段，則表明待檢測樣品來源于白斑紅點鮭（Salvelinus leucomaenis);若電泳得到長度為252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲 紅點鮭（Salvelinus fominalis)，從而完成對白斑紅點鮭（Salvelinus Ieucomaenis)和美 洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別；
[0027] 其中，所述的AF346686F和AF346686R引物序列為：
[0028] AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3'
[0029] AF346686R:5'-ACT ACG GCT TTC TGG GAT-3'。其它與【具體實施方式】二或三相同。
[0030] 【具體實施方式】五：本實施方式與【具體實施方式】二至四之一不同的是：所述的PCR 反應體系為：

【權利要求】
1. 一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子標記，其特征在于用于 PCR擴增分子標記的引物對為AF346686F和AF346686R，具體序列為： AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3' AF346686R:5' -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3'。
2. 權利要求1所述的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子標 記的應用，其特征在于它用于鑒別白斑紅點鮭（Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點鮭 (Salvelinus fominalis)〇
3. 根據(jù)權利要求2所述的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分 子標記的應用，其特征在于鑒別白斑紅點鮭（Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點鮭 (Salvelinus fominalis)的方法如下：采用PCR-LP方法，利用權利要求1的引物對，檢 測待測樣品的微衛(wèi)星標記基因型，若檢測得到長度為250bp單一片段，則待檢測樣品來源 于白斑紅點鮭（Salvelinus leucomaenis);若檢測得到長度為252bp和999bp兩條目的 片段，則待檢測樣品來源于美洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)，從而完成對白斑紅點鮭 (Salvelinus leucomaenis)和美洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別。
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分 子標記的應用，其特征在于所述的采用PCR-LP方法，利用權利要求1的引物對，檢測待測樣 品的微衛(wèi)星標記基因型的具體操作如下： 一、 提取待測樣品的基因組DNA，備用； 二、 以步驟一提取的基因組DNA為模板，利用AF346686F和AF346686R引物，進行PCR 反應； 三、 待步驟二的PCR反應結(jié)束后，收集PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，觀察電泳條帶，若電 泳得到長度為250bp的單一片段，則表明待檢測樣品來源于白斑紅點鮭（Salvelinus leucomaenis);若電泳得到長度為252bp和999bp兩條目的片段，則待檢測樣品來源于美洲 紅點鮭（Salvelinus fominalis)，從而完成對白斑紅點鮭（Salvelinus leucomaenis)和美 洲紅點鮭（Salvelinus fominalis)的鑒別； 其中，所述的AF346686F和AF346686R引物序列為： AF346686F:5' -AGT CGT CGG CTT GTC TTC-3' AF346686R:5' -ACTACG GCT TTC TGG GAT-3'。
5. 根據(jù)權利要求4所述的一種鑒別白斑紅點鮭和美洲紅點鮭刺身及熏肉制品的分子 標記的應用，其特征在于所述的PCR反應體系為： 體系 ）im 50 ng/μ丨待檢_樣品DN Α Ι,ΟμΙ 腫 μη? 丨'.游》j| 物 0·5μ1 ΙΟμηιοΙ/L 卜'游引物 0,5μΙ i〇x PCR Buflcr 1·5μ1 2 nimol/L dNTP 1·5μ1 25 mraol/L MgCl? 1 ·2μ1 5 U/ul Taq Si 0.18μ1 ddH20 8.62μ1 ?〇?擴增條件為：941：預變性51^11;941：變性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸3〇8，共30 個循環(huán)，再72°C延伸5min，4°C保溫。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293972SQ201410631874
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權日:2014年11月11日
【發(fā)明者】戶國, 郭媛, 王炳謙, 谷偉, 孫鵬 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所