玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法，特點是LAMP的兩對引物如下MCMV2-F3、MCMV2--B3、MCMV2-FIP、MCMV2-BIP，其RT-LAMP反應(yīng)體系如下：2μL MCMV2-FIP溶液，2μL MCMV2-BIP溶液，0.25μL MCMV2-F3溶液，0.25μL MCMV2-B3 溶液，12.5μL 2×反應(yīng)緩沖液，1μL Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶混合液，1μL鈣黃綠素，2.5μL RNA模板，無RNA酶的水補至25 μL，檢測方法包括總RNA的提??；RT-LAMP引物的設(shè)計和合成；配制 RT-LAMP 反應(yīng)體系；MCMV的RT-LAMP目視檢測，優(yōu)點是靈敏度高，特異性強且簡便快速。
【專利說明】玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組、檢測試 劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及玉米褪綠斑駁病毒的檢測技術(shù)，尤其是涉及玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介 導(dǎo)等溫擴增檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 玉米裡綠斑駁病毒（Maize chlorotic mottle virus，MCMV)屬番爺叢矮病毒科 (Tombusviridae)玉米褪綠斑駁病毒屬（Machlomovirus)，1974年首次在秘魯發(fā)現(xiàn)，1976年 美國相繼報道該病毒的發(fā)生，現(xiàn)在主要分布于美國、阿根廷、墨西哥及秘魯?shù)鹊?。該病毒?要通過昆蟲、種子攜帶、機械傳播等方式蔓延擴散。其中種子帶毒是遠距離傳播的重要途 徑，且種子傳毒率與種子的質(zhì)量無相關(guān)關(guān)系。甲蟲和薊馬等昆蟲是該病毒擴散的主要介體， 世界范圍廣泛分布的甲蟲和薊馬為其快速傳播提供了便利條件。該病毒侵染玉米所引發(fā)的 病害可導(dǎo)致玉米減產(chǎn)1〇°/『15%，若與玉米褪綠斑駁病毒、甘蔗花葉病毒或玉米矮花葉病毒復(fù) 合侵染，有可能造成平均高達75%的產(chǎn)量損失。鑒于MCMV的高風(fēng)險性，我國在2007年頒布 的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》將其列為檢疫性病毒。2009年，龔海 燕等從青島口岸進境的美國大豆種子種混雜的玉米粒上檢出該病毒，2011年，劉洪義等從 黑龍江口岸郵寄進境的德國玉米種子也檢出該病毒。
[0003] 目前，玉米褪綠斑駁病毒的檢測主要采用生物學(xué)、血清學(xué)和RT-PCR方法，這些方 法的弊端在于耗時長，依賴昂貴的檢測設(shè)備。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)是Notomi等2000年首先提出來的一種新的核酸擴增技術(shù)，該 技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一個具有鏈置換特性的DNA聚合酶 (fci DNA polymerase),在等溫條件下高效擴增祀基因，靈敏度和特異性高。該方法已應(yīng)用 于病毒、類病毒、細菌、真菌及轉(zhuǎn)基因的檢測。而迄今尚無應(yīng)用該技術(shù)檢測玉米褪綠斑駁病 毒的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有靈敏度高，特異性強且簡便快速的玉 米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為： 1、一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組，LAMP的兩對引物序列如 下： 外側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。
[0006] 2、一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括2X 反應(yīng)緩沖液，由fei DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液，濃度均為20 μ mol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、內(nèi)側(cè)下游引物溶液、外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游引物溶 液，I丐黃綠素突光染料(購自Eiken公司，商品名為Fluorescent Detection Reagent),所述 的2X反應(yīng)緩沖液、所述的聚合酶混合液、所述的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、所述的內(nèi)側(cè)下游引物 溶液、所述的外側(cè)上游引物溶液、所述的外側(cè)下游引物溶液、所述的鈣黃綠素熒光染料的體 積比為12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列為 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 外側(cè)上游引物 MCMV2-FIP :GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGAITTTGAITTGG。
[0007] 所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、L 6 M 的甜菜堿和每種 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ μ L。
[0008] 3、一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法，包括以下步驟： (1) 總RNA的提取 將玉米待測樣本使用RNeasy Plant Mini Kit進行植物總RNA提取，具體操作見試劑 盒說明書； (2) RT-LAMP引物的設(shè)計和合成 從GenBank調(diào)出所有玉米褪綠斑駁病毒外殼蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40 軟件進行比對分析，找出MCMV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)，利用LAMP引物設(shè)計軟件 PrimerExplorer V4設(shè)計特異性引物并通過引物篩選獲得RT-LAMP檢測的最佳引物： 外側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-BIP ：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG ； (3) 配制RT-LAMP反應(yīng)體系 濃度為20 μ mol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液和內(nèi)側(cè)下游引物溶液各2 μ L，濃度為20 μ mol/L的外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游引物溶液各0.25 yL，12. 5 yL 2Χ反應(yīng)緩沖液， 由DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液1. 0 μ L，鈣黃綠素熒光染料 1.0 μ?，樣品總 RNA2.5 yL，無 RNase 的水補至25 yL; (4) MCMV的RT-LAMP目視檢測 將上述反應(yīng)體系進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：61°C 70 min，95°C 2 min;RT-LAMP擴增 結(jié)束后，在正常光照條件下，通過裸眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化來準確判定結(jié)果，若擴增產(chǎn) 物呈黃綠色，則樣品感染玉米褪綠斑駁病毒。
[0009] 所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、I. 6 M 的甜菜堿和每種 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ μ L。
[0010] 原理說明：鈣黃綠素是一種螯合劑，反應(yīng)前與試劑中的錳離子結(jié)合處于淬滅狀態(tài)， LAMP擴增反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結(jié)合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠 色熒光，通過觀察熒光的有無可判斷是否有擴增。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明首次公開了玉米褪綠斑駁病毒的環(huán) 介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法，根據(jù)玉米褪綠斑駁病毒（MCMV)外殼 蛋白基因序列的保守區(qū)設(shè)計RT-LAMP特異性引物，該引物組具有特異性強，靈敏度高達20 pg，與RT-PCR相當，而反應(yīng)時間明顯縮短，整個檢測1小時內(nèi)可完成，提高了擴增效率，這與 引物本身的質(zhì)量(如長度、GC含量)、退火溫度、反應(yīng)體系中金屬離子的濃度、酶的活性等因 素直接有關(guān)。通過在反應(yīng)體系中預(yù)先加入螯合劑--I丐黃綠素，可實現(xiàn)肉眼觀察判定結(jié)果， 尤其適合設(shè)備資源配置簡單的口岸實驗室開展現(xiàn)場快速篩查，具有較強的推廣價值，其優(yōu) 點如下： 1、 操作簡單。RT-LAMP在60°C ~65°C恒溫條件下進行，不需要復(fù)雜儀器設(shè)備，只需維持 恒溫的水浴鍋或金屬浴就可完成。且可通過在反應(yīng)液中加入鈣黃綠素，反應(yīng)結(jié)束后裸眼觀 察顏色變化，判定結(jié)果，不需電泳儀和紫外觀測； 2、 特異性高。該技術(shù)通過4條引物識別靶基因6段不同的序列，在很大程度上提高了 檢測的特異性； 3、 高效靈敏。該技術(shù)在恒溫條件下進行，不需通過溫度循環(huán)實現(xiàn)基因擴增，且反轉(zhuǎn)錄可 與PCR-步進行，節(jié)約了時間。60分鐘內(nèi)DNA能擴增到10 9~101(1倍。其靈敏度與PCR相當。 因此，采用RT-LAMP技術(shù)檢測MCMV非常適合基層實驗室應(yīng)用，有很好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為MCMVl弓丨物組的MCMV RT-LAMP檢測的反應(yīng)時間與濁度的關(guān)系圖； 圖2為MCMV2引物組的MCMV RT-LAMP檢測的反應(yīng)時間與濁度的關(guān)系圖； 圖3為MCMV3引物組的MCMV RT-LAMP檢測的反應(yīng)時間與濁度的關(guān)系圖； 圖4為MCMV2引物組的RT-LAMP特異性試驗結(jié)果； 圖5為MCMV2組引物的RT-LAMP靈敏度試驗結(jié)果； 圖 6 為 MCMV2 組引物的 RT-PCR 相對靈敏度試驗，M:DL2000 ;l-7:20ng、2ng、200pg、 20pg、2pg、200fg、20fg 總 RNA ;8:水。

【具體實施方式】
[0013] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0014] 具體實施例1 玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組，LAMP的兩對引物序列如下： 外側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。
[0015] 具體實施例2 玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括2X反應(yīng)緩沖液 (配方如下：40mM 的 ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、20mM 的 KCl、16mM 的 MgS04、20mM 的（NH4)2 S04、0. 2% 的Tween20、I. 6 M的甜菜堿和每種2. 8mM的dNTPs)，由DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合 酶組成的聚合酶混合液(聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為 8 U/μ L)，濃度20 μ mol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、濃度20 μ mol/L的內(nèi)側(cè)下游引物溶液、 濃度20 μ mol/L的外側(cè)上游引物溶液和濃度20 μ mol/L的外側(cè)下游引物溶液，鈣黃綠素 突光染料(購自Eiken公司，商品名為Fluorescent Detection Reagent)，2X反應(yīng)緩沖液、 聚合酶混合液、內(nèi)側(cè)上游引物溶液、內(nèi)側(cè)下游引物溶液、外側(cè)上游引物溶液、外側(cè)下游引物 溶液、鈣黃綠素熒光染料的體積比為12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列為 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 外側(cè)上游引物 MCMV2-FIP :GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGAITTTGAITTGG。
[0016] 具體實施例3 玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立 1、實驗材料 (1)樣本來源本發(fā)明共收集不同來源的3份玉米褪綠斑駁病毒、1份番茄環(huán)斑病毒、1 份玉米褪綠矮縮病毒、1份燕麥花葉病毒、1份小麥線條花葉病毒和1份玉米粗縮病毒陽性 樣品(表1)， 表1樣品來源

【權(quán)利要求】
1. 一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組，LAMP的兩對引物序列如 下： 外側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACAITTCCATGGCAITCCT ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。
2. -種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：該檢測試劑盒 包括2 X反應(yīng)緩沖液，由DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液，濃度均 為20 ymol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、內(nèi)側(cè)下游引物溶液、外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游引 物溶液，I丐黃綠素突光染料(購自Eiken公司，商品名為Fluorescent Detection Reagent), 所述的2X反應(yīng)緩沖液、所述的聚合酶混合液、所述的內(nèi)側(cè)上游引物溶液、所述的內(nèi)側(cè)下游 引物溶液、所述的外側(cè)上游引物溶液、所述的外側(cè)下游引物溶液、所述的鈣黃綠素熒光染料 的體積比為12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列為 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACAITTCCATGGCAITCCT ; 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 外側(cè)上游引物 MCMV2-FIP :GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGITGCCAG ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-BIP :GTAITCCCCCGGACGAITCATTAGTACGAGAITITGAITTGG。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒，其特 征在于：所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、1. 6 M 的甜菜堿和每種 2. 8mM 的 dNTPs，聚合酶 混合液中DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ y L。
4. 一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法，包括以下步驟： (1) 總RNA的提取 將玉米待測樣本使用RNeasy Plant Mini Kit進行植物總RNA提??； (2) RT-LAMP引物的設(shè)計和合成 從GenBank調(diào)出所有玉米褪綠斑駁病毒外殼蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40 軟件進行比對分析，找出MCMV外殼蛋白基因序列的保守區(qū)，利用LAMP引物設(shè)計軟件 PrimerExplorer V4設(shè)計特異性引物并通過引物篩選獲得RT-LAMP檢測的最佳引物： 外側(cè)上游引物 MCMV2-F3 :TACAITTCCATGGCAITCCT ; 外側(cè)下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 內(nèi)側(cè)上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 內(nèi)側(cè)下游引物 MCMV2-BIP ：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG ； (3) 配制RT-LAMP反應(yīng)體系 濃度為20 iimol/L的內(nèi)側(cè)上游引物溶液和內(nèi)側(cè)下游引物溶液各2 iiL，濃度為20 ymol/L的外側(cè)上游引物溶液和外側(cè)下游引物溶液各0. 25 iiL，12. 5 iiL 2X反應(yīng)緩沖液， 由DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶組成的聚合酶混合液1. 0 y L，鈣黃綠素熒光染料 1.0 ML，樣品總 RNA2.5 iiL，無 RNase 的水補至 25 iiL; (4) MCMV的RT-LAMP目視檢測 將上述反應(yīng)體系進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：61°C 70 min，95°C 2 min;RT-LAMP擴增 結(jié)束后，在正常光照條件下，通過裸眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化來準確判定結(jié)果，若擴增產(chǎn) 物呈黃綠色，則樣品感染玉米褪綠斑駁病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種玉米褪綠斑駁病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法，其特征 在于所述的反應(yīng)緩沖液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KC1、16mM的MgS04、 20mM的（NH4) 2 S04、0. 2%的Tween20、1. 6 M的甜菜堿和每種2. 8mM的dNTPs，聚合酶混合液 中DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的濃度均為8 U/ ii L。
【文檔編號】C12N15/11GK104498617SQ201410634403
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】徐穎, 鄭煒, 徐亞飛, 劉永豐, 黃世杰, 邱志君 申請人:中華人民共和國北侖出入境檢驗檢疫局