一種副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌和酵母的定量檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌和酵母的定量檢測(cè)方法，屬于微生物檢驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】。該檢測(cè)方法包括下述順序的檢驗(yàn)步驟：稱取5g副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有95g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，震蕩2min后靜置30min，制得1:20的樣品勻液；取10g樣品勻液通過(guò)孔徑1um的濾膜進(jìn)行第一次抽濾，濾膜放入20-50g無(wú)菌生理鹽水中稀釋，將稀釋后的樣品勻液全部通過(guò)孔徑1um的濾膜進(jìn)行第二次抽濾，同樣進(jìn)行第三次抽濾，最后按10倍遞增稀釋樣品并倒無(wú)菌平板28±1℃培養(yǎng)5天計(jì)數(shù)。本發(fā)明定量檢測(cè)的方法避免了直接用國(guó)標(biāo)法檢驗(yàn)由于受乳酸菌的影響，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。
【專利說(shuō)明】一種副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌和酵母的定量檢測(cè)方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌 和酵母的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 直投式酸奶發(fā)酵劑（Directed Vat Set，DVS)是指一系列高度濃縮和標(biāo)準(zhǔn)化的冷 凍干燥發(fā)酵劑菌種，可直接加入到熱處理的原料乳中進(jìn)行發(fā)酵，而無(wú)需對(duì)其進(jìn)行活化、擴(kuò)培 等其它預(yù)處理工作。直投式發(fā)酵劑的活菌數(shù)一般為l〇 1(l-l〇12CFU/g，由于直投式發(fā)酵劑的活 力強(qiáng)、類型多，生產(chǎn)廠家可以根據(jù)需要任意選擇，從而豐富了乳酸菌產(chǎn)品的品種。直投發(fā)酵 劑不需要擴(kuò)大培養(yǎng)，可直接使用，產(chǎn)品質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，成為目前大型乳品企業(yè)的首選。乳酸 菌直投式菌種基本是國(guó)外進(jìn)口，有一百多年的生產(chǎn)歷史，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，由于直投式菌種價(jià) 格相對(duì)較貴，打開(kāi)后如不及時(shí)使用，會(huì)導(dǎo)致活力下降并且容易污染，故對(duì)乳酸菌直投式菌種 進(jìn)廠檢驗(yàn)相對(duì)較少，偶爾抽檢一下活菌數(shù)，霉菌酵母含量直接用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)，沒(méi)有對(duì)直投式 菌種進(jìn)行預(yù)處理，由于乳酸菌對(duì)霉菌酵母的抑制作用，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。在實(shí)際生產(chǎn)中，偶 爾有部分批次產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)酸弱，同時(shí)伴隨保質(zhì)期過(guò)程有鼓蓋現(xiàn)象，無(wú)法查找到產(chǎn)品 出質(zhì)量問(wèn)題的原因。目前國(guó)內(nèi)對(duì)直投式菌種的研究論文有90多篇，基本圍繞乳酸菌遺傳穩(wěn) 定性、傳代培養(yǎng)、菌株選育、分離鑒定、生化特性等，而對(duì)直投式菌種純度的定量檢驗(yàn)方法沒(méi) 有相應(yīng)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種副干酪乳桿菌直投式 菌種中霉菌和酵母的定量檢測(cè)方法，主要解決直接用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)會(huì)受稀釋倍數(shù)、抑制作用 等因素的干擾而使檢測(cè)結(jié)果有很大誤差的問(wèn)題。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種副干酪乳桿菌 直投式菌種中霉菌和酵母的定量檢測(cè)方法，其特征在于：包括下述順序的檢測(cè)步驟： (1)樣品處理： A樣品制備：稱取5g副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有95g滅菌生理鹽水的錐形瓶中， 震蕩2min后靜置30min，制得1:20的樣品勻液； B第一次抽濾：固定好濾器，將IOg上述步驟A制得的樣品勻液通過(guò)孔徑Ium的濾膜過(guò) 濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入20-50g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得第一次抽 濾后的樣品勾液； C第二次抽濾：固定好濾器，將上述步驟B制得的第一次抽濾后的樣品勻液全部通過(guò) 孔徑Ium的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入20-50g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振 搖，制得第二次抽濾后的樣品勻液； D第三次抽濾：固定好濾器，將上述步驟C制得的第二次抽濾后的樣品勻液全部通過(guò) 孔徑Ium的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入計(jì)算好的滅菌生理鹽水質(zhì)量的錐形瓶中， 充分振搖，制成稀釋度為IXKT2的樣品勻液； E制備培養(yǎng)皿：取Ig上述步驟D制得的稀釋度為I X KT2的樣品勻液，注入9g滅菌生 理鹽水的試管中，充分振搖，制得稀釋度為IX KT3的樣品勻液，按此操作程序，制備10倍系 列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用一次無(wú)菌吸管；在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè) 稀釋度分別吸取Ig樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿，及時(shí)將15 - 20g冷卻至46-50°C的孟加拉紅 培養(yǎng)基傾注平皿，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻； (2) 培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平皿倒置，28±1°C培養(yǎng)5天，觀察并記錄； (3) 菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告：選取菌落數(shù)在10-150CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，一個(gè)稀釋度使用 兩個(gè)平板，取兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。
[0005] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果有： 1、本發(fā)明根據(jù)乳酸菌與霉菌酵母不同的形態(tài)大小，通過(guò)抽濾的微過(guò)濾形式，避免了 乳酸菌抑制霉菌酵母生長(zhǎng)的干擾因素，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。酵母細(xì)胞的大小是（1-5) umX (5-30)um、霉菌孢子的大小是（2-10) um，副干酪乳桿菌直投式菌種由于采用冷凍真空 干燥工藝，菌株寬度一般小于lum。根據(jù)不同菌株分子大小不同的特性，通過(guò)Ium微膜抽濾 將副干酪乳桿菌和霉菌酵母分離開(kāi)，即霉菌和酵母留在濾膜上，副干酪乳桿菌分離在濾液 中。
[0006] 2、本發(fā)明通過(guò)定量檢驗(yàn)，首次將直投式菌種中是否有霉菌和酵母檢測(cè)出來(lái)，避免 了副干酪乳桿菌對(duì)檢測(cè)過(guò)程的干擾。
[0007] 3、本發(fā)明的實(shí)施將有效的控制國(guó)外進(jìn)口直投式菌種的產(chǎn)品質(zhì)量，保證乳酸菌發(fā)酵 產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中的穩(wěn)定性，同時(shí)避免了產(chǎn)品保質(zhì)期發(fā)生鼓蓋的質(zhì)量問(wèn)題。

【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不限于該實(shí)施例。
[0009] 實(shí)施例1 一種副干酪乳桿菌直投式菌種樣品中霉菌和酵母的檢測(cè)方法，其特征在于：包括下述 順序的工藝步驟： A樣品制備：稱取5g副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有95g滅菌生理鹽水的錐形瓶中， 先用拍擊式震蕩器震蕩2min，后在無(wú)菌環(huán)境中靜置30min，制得質(zhì)量比為1:20的樣品勻 液； B第一次抽濾：首先用無(wú)菌鑷子夾起滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌 的濾床上，固定好濾器，取IOg上述步驟A制得的樣品勻液，通過(guò)孔徑Ium的濾膜過(guò)濾，然后 將過(guò)濾好的濾膜放入20g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得第一次抽濾后的樣品 勻液； C第二次抽濾：固定好濾器，取上述步驟B制得第一次抽濾后的樣品勻液，通過(guò)孔徑 Ium的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入20g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得 第二次抽濾后的樣品勻液； D第三次抽濾：固定好濾器，取上述步驟C制得第二次抽濾后的樣品勻液，通過(guò)孔徑 Ium的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入49. 2g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制 得稀釋度為IX 1(Γ2的樣品勻液； E制備培養(yǎng)皿：取Ig上述步驟D制得的稀釋度為IX KT2的樣品勻液，注入9g滅菌生 理鹽水的試管中，充分振搖，制得IX KT3稀釋度的樣品勻液，按此操作程序，制備10倍系列 稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用一次無(wú)菌吸管；在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀 釋度分別吸取Ig樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿，同時(shí)分別取Ig樣品稀釋液加入2個(gè)無(wú)菌平皿 作空白對(duì)照，及時(shí)將15 - 20g冷卻至46-50°C的孟加拉紅培養(yǎng)基傾注平皿，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混 合均勻； (2 )培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平皿倒置，28 ± I °C培養(yǎng)5天，觀察并記錄。
[0010] (3)菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告：肉眼觀察，必要時(shí)可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉 菌和酵母數(shù)目，以菌落形成單位CFU表示；選取菌落數(shù)在10-150CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)， 一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，取兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)計(jì)數(shù)結(jié) 果見(jiàn)表1。
[0011] 對(duì)比例A 一種副干酪乳桿菌直投式菌種樣品中霉菌和酵母的國(guó)標(biāo)檢測(cè)法，包括下述順序的步 驟： (1)在100級(jí)的潔凈工作臺(tái)進(jìn)行過(guò)濾操作，稱取IOg副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有 90g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，用拍擊式震蕩器震蕩2min，后在無(wú)菌環(huán)境中靜置30min，制 得質(zhì)量比為1:10的樣品勻液。
[0012] (2)取Ig步驟（1)制得的1:10樣品勻液，注入9g滅菌生理鹽水的試管中，充分振 搖，制得1:100的稀釋液，按此操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換 用一次無(wú)菌吸管；根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇IX 1〇_2、IX 1〇_3、IX 1〇_4、IX 1〇_5稀釋 度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別吸取Ig樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿，同時(shí)分別取Ig稀釋液加 入2個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照，及時(shí)將15 - 20g冷卻至46-50°C的孟加拉紅培養(yǎng)基傾注平皿， 轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。
[0013] (3)培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告均同實(shí)施例1，菌落數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0014] 對(duì)比例B 一種副干酪乳桿菌直投式菌種樣品中霉菌和酵母的對(duì)照檢測(cè)法，包括下述順序的步 驟： (1)在100級(jí)的潔凈工作臺(tái)進(jìn)行過(guò)濾操作，稱取IOg副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有 90g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，用拍擊式震蕩器震蕩2min，后在無(wú)菌環(huán)境中靜置30min，制 得質(zhì)量比為1:10的樣品勻液。
[0015] (2)第一次抽濾：首先用無(wú)菌鑷子滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅 菌的濾床上，固定好濾器，取IOg上述步驟（1)制得的樣品勻液通過(guò)孔徑Ium的濾膜過(guò)濾， 然后將過(guò)濾好的濾膜放入99. Ig滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得第一次抽濾后 稀釋度為IX KT2的樣品勻液。
[0016] (3)第二次抽濾：同樣固定好濾器，取IOg上述步驟（2)制得的第一次抽濾后的樣 品勻液，通過(guò)孔徑Ium的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入99. 3g滅菌生理鹽水的錐形瓶 中，充分振搖，制得第二次抽濾后釋度為IX KT3的樣品勻液。
[0017] (4)固定好濾器，取IOg上述步驟（3)制得第二次抽濾后的樣品勻液通過(guò)孔徑Ium 的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入99. 4g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得釋 度為IXKT4的樣品勻液。
[0018] (5)取Ig上述步驟（4)制得稀釋度為I X KT4的樣品勻液，注入9g滅菌生理鹽水 的試管中，充分振搖，制得IX 1〇_5稀釋度的樣品勻液，按此操作程序，制備10倍系列稀釋樣 品勻液，每遞增稀釋1次，換用一次無(wú)菌吸管；選擇IX 1〇_2、IX 1〇_3、IX 1〇_4、IX 1〇_5稀釋度 的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別吸取Ig樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿，同時(shí)分別取Ig樣品稀釋液 加入2個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照，及時(shí)將15 - 20g冷卻至46-50°C的孟加拉紅培養(yǎng)基傾注平 皿，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。
[0019] (6)培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)、結(jié)果報(bào)告都同實(shí)施例1，菌落數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。 表1 :不同稀釋度樣品培養(yǎng)出的霉菌和酵母菌落數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌和酵母的定量檢測(cè)方法，其特征在于：包括下 述順序的檢測(cè)步驟： (1) 樣品處理： A樣品制備：稱取5g副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有95g滅菌生理鹽水的錐形瓶中， 震蕩2min后靜置30min，制得1:20的樣品勻液； B第一次抽濾：固定好濾器，將IOg上述步驟A制得的樣品勻液通過(guò)孔徑Ium的濾膜過(guò) 濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入20-50g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得第一次抽 濾后的樣品勾液； C第二次抽濾：固定好濾器，將上述步驟B制得的第一次抽濾后的樣品勻液全部通過(guò) 孔徑Ium的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入20-50g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振 搖，制得第二次抽濾后的樣品勻液； D第三次抽濾：固定好濾器，將上述步驟C制得的第二次抽濾后的樣品勻液全部通過(guò) 孔徑Ium的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾好的濾膜放入計(jì)算好的滅菌生理鹽水質(zhì)量的錐形瓶中， 充分振搖，制成稀釋度為IXKT 2的樣品勻液； E制備培養(yǎng)皿：取Ig上述步驟D制得的稀釋度為I X KT2的樣品勻液，注入9g滅菌生 理鹽水的試管中，充分振搖，制得稀釋度為I X KT3的樣品勻液，按此操作程序，制備10倍系 列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用一次無(wú)菌吸管；在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè) 稀釋度分別吸取Ig樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿，及時(shí)將15 - 20g冷卻至46-50°C的孟加拉紅 培養(yǎng)基傾注平皿，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻； (2)培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平皿倒置，28±1°C培養(yǎng)5天，觀察并記錄； (3)菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告：選取菌落數(shù)在10-150CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，一個(gè)稀釋度使用 兩個(gè)平板，取兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK104313113SQ201410639028
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】董雪鳳, 楊子彪, 趙旭燕 申請(qǐng)人:云南皇氏來(lái)思爾乳業(yè)有限公司