一種里氏木霉突變菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明利用輻射誘變技術(shù)獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉突變菌株LA2-7，其保藏編號為CCTCC NO:,2014564。該突變株LA2-7發(fā)酵上清液酶活為3282U/mL，比出發(fā)菌提高了276％，蛋白含量為12.2g/L，比出發(fā)菌提高了237％。此外，突變株LA2-7的菌落明顯小于出發(fā)菌，且菌絲比出發(fā)菌的菌絲粗、短，分枝多，有利于在生產(chǎn)過程中降低發(fā)酵菌液的粘度，進(jìn)而可以降低攪拌速度，提高溶氧，能有效降低生產(chǎn)成本，應(yīng)用前景廣泛。
CCTCC NO：M2014564
20141112
【專利說明】一種里氏木霉突變菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種里氏木霉突變菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 里氏木霉（Trichoderma reesei)是一種絲狀真菌，屬于多細(xì)胞的真核微生物，是 紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina)的無性型，分類上隸屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢 梗孢目、木霉屬。里氏木霉廣泛分布于自然界，在腐木、種籽、植物殘體、有機(jī)肥、土壤和甚至 是空氣中（Montenecourt& Eveleigh, 1979, Adv Chem Ser.)。
[0003] 里氏木霉能表達(dá)多種胞外纖維素酶和半纖維素酶，包括外切纖維素酶（CBHl和 CBH2)、內(nèi)切纖維素酶（EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等）、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露 聚糖酶等。通過這些纖維素酶和半纖維素酶的協(xié)同作用，將纖維素徹底分解為單糖（Biely & Tenkanen. 1998, In Trichoderma and Gliocladium)，因此，木霉產(chǎn)纖維素酶已經(jīng)是二代 纖維素生物乙醇的主要酶制劑來源。
[0004] 但成本過高已經(jīng)成為限制纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的關(guān)鍵，尤其纖維素酶的成本。 當(dāng)前，每噸纖維素的成本中，纖維素酶的成本超過了 2000元。因此篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌 株是降低生產(chǎn)乙醇成本的關(guān)鍵因素之一。而影響木霉纖維素酶表達(dá)的因素很多。首先，培 養(yǎng)碳源的影響：纖維素，乳糖和槐糖用來誘導(dǎo)木霉產(chǎn)纖維素酶；葡萄糖和甘油等阻遏纖維 素酶的表達(dá)。碳源的誘導(dǎo)作用是調(diào)控因子來影響表達(dá)的，如與誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)的正調(diào)控因子 是 ACEII 和 XYR1，而負(fù)調(diào)控因子是 CREl 和 ACEI (Ilme' n et al·，1997, Mol. Gen. Genet.; Foreman et al.，2003, J. Biol. Chem.)。其次，菌體（菌絲）形態(tài)也是影響分泌表達(dá)的關(guān)鍵 因素之一。一般認(rèn)為，絲狀真菌是通過頂端分泌來輸出胞外蛋白的。因此，高效分泌菌株形 態(tài)上往往是多分枝的。
[0005] 然而從自然界中直接篩選到的木霉菌株產(chǎn)酶水平往往很低，不適合商業(yè)生產(chǎn)。因 此，如何通過現(xiàn)有技術(shù)改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生產(chǎn)成本就成為本領(lǐng)域 的研究熱點(diǎn)之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種里氏木霉突變菌株及其在產(chǎn)纖維素酶方 面的應(yīng)用。所述突變菌株是通過輻射誘變的方法獲得的，能高產(chǎn)纖維素酶，進(jìn)而有效降低纖 維素酶的生產(chǎn)成本，有利于其廣泛應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明一方面提供了一株里氏木霉（Trichoderma reesei)突變菌株LA2-7,已于 2014年11月12日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO ：M2014564〇
[0008] 本發(fā)明還提供了上述里氏木霉突變菌株在纖維素酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)纖維素酶的方法，是用上述的里氏木霉突變菌株發(fā)酵來制 備的；
[0010] 用于發(fā)酵的培養(yǎng)基的組成為葡萄糖15. Og/L、乳糖16. Og/L，玉米楽25. 0ml/L， (NH4)2SO4 5. Og/L，MgSO4 l.Og/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2 0.4g/L，吐溫-80 0.2ml/L，微量元 素 0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，Na0H 1.0g/L，pH 值 5.0。其中微量元素溶液（g/ U 的組成為：CuSO4 · 5Η200· 048mol/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 18mol/L，CoCl2 · 6H20 0· 034mol/L， MnCl2 · 4H20 0. 08mol/L〇
[0011] 本發(fā)明利用輻射誘變技術(shù)獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉突變菌株LA2-7,該 突變株LA2-7發(fā)酵上清液酶活為3282U/mL，比出發(fā)菌提高了 276%，蛋白含量為12. 2g/L，比 出發(fā)菌提高了 237%。此外，突變株LA2-7的菌落明顯小于出發(fā)菌，且菌絲比出發(fā)菌的菌絲 粗、短，分枝多，有利于在生產(chǎn)過程中降低發(fā)酵菌液的粘度，進(jìn)而可以降低攪拌速度，提高溶 氧，能有效降低生產(chǎn)成本，應(yīng)用前景廣泛。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1 :出發(fā)菌和突變菌的菌落形態(tài)比較，其中：A為出發(fā)菌L-10，B為突變菌LA2-7 ;
[0013] 圖2 :出發(fā)菌和突變菌的菌絲形態(tài)比較，其中：A為出發(fā)菌L_10，B為突變菌LA2-7。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體的實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。但本發(fā)明并不受所述實(shí)施 例的限制。提供實(shí)施方案的目的是為了使說明書全面而透徹，并向本領(lǐng)域的技術(shù)人員全面 傳達(dá)發(fā)明的范圍。除另定義外，本發(fā)明所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有作為本發(fā)明所 屬【技術(shù)領(lǐng)域】中普通技術(shù)人員通常理解的同樣的含義。
[0015] 實(shí)施例1里氏木霉菌株的誘變篩選
[0016] 1、菌種處理：
[0017] 將出發(fā)菌株里氏木霉L-10 (該菌株是本申請的發(fā)明人黃亦鈞于2010年從青島市 嶗山區(qū)林場土壤中篩選到的）接種于PDA瓊脂平板（馬鈴薯200-300克，葡萄糖20克，瓊脂 15-20克，自來水1000毫升，自然pH)上，28-30°C恒溫培養(yǎng)1周至穩(wěn)定期。待孢子成熟后， 往平板上加入5-10ml無菌水洗刷孢子，吸取孢子懸液并計(jì)數(shù)，依據(jù)孢子含量用調(diào)整其濃度 至KT 6個/ml，然后進(jìn)行后續(xù)誘變處理。
[0018] 2、核輻射誘變篩選：
[0019] 取上述孢子懸液50ul加入無菌I. 5ml離心管中，共100管，送山東省農(nóng)科院原子 能所進(jìn)行60C〇輻射處理，照射劑量分別為l，2,4kGy。誘變后的懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋涂平板，在 28 - 37°C下倒置避光培養(yǎng)7 - 20天。待平板上呈現(xiàn)肉眼可見的菌落是開始第一次篩選，長 出菌落轉(zhuǎn)移到另外的平板劃線；最后，挑取菌落形態(tài)明顯小于出發(fā)菌的突變體菌分別接種 到PDA瓊脂平板。
[0020] 實(shí)施例2高產(chǎn)纖維素酶突變菌株的篩選
[0021] 1、利用24深孔板篩選：
[0022] 在24深孔板的孔中各加入3_4ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基（誘導(dǎo)培養(yǎng)基（--Μ)的組成為葡萄 糖 15. 0g/L、乳糖 16. 0g/L，玉米漿 25. 0ml/L，（NH4)2S045. 0g/L，MgS04 I. 0g/L，KH2P04 20g/L， CaCl2 0.4g/L，吐溫-80 0.2ml/L，微量元素 0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，Na0H LOg/ L，pH 值 5· 0。其中微量元素溶液（g/L)的組成為：CuSO4 · 5H20 0· 048mol/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 18mol/L，CoCl2 ·6Η20 0· 034mol/L，MnCl2 ·4Η20 0· 08mol/L)。然后將實(shí)施例 1 中篩選到的 突變株分別接種于各個孔中，置于搖床上，培養(yǎng)方法為發(fā)酵溫度為28°C，搖床轉(zhuǎn)速為200r/ min，培養(yǎng)2天；然后25°C培養(yǎng)2天。培養(yǎng)結(jié)束后，分別離心取上清進(jìn)行酶活檢測和SDS-PAGE 電泳檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，篩選出酶活和胞外蛋白含量顯著高于出發(fā)菌的突變菌共7株，分 別命名為 LA2-1，LA2-2, LA2-3, LA2-4, LA2-5, LA2-6 和 LA2-7。
[0023] (1)酶活測定的方法：CMC法
[0024] (2)測定的原理：纖維素酶能將羧甲基纖維素降解成寡糖和單糖。具有還原性末 端的寡糖和單糖在沸水浴條件下可以與3, 5-二硝基水楊酸（DNS)試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反 應(yīng)液顏色的深度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中纖維素酶 的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，可以計(jì)算反應(yīng)液中纖維素酶的 活力。
[0025] (3)測定過程：取三支試管各加入0. 5mlCMC底物，與待測酶液一起50°C水浴預(yù)熱 5min。在第一、二試管中各加入0. 5ml待測液，并計(jì)時，50°C水浴中反應(yīng)15min。反應(yīng)完后在 三支試管中各加入I. 5ml的DNS試劑，并在第三支試管中補(bǔ)加0. 5ml的待測酶液。取出并 搖勻三支試管后，在沸水浴中反應(yīng)5min。迅速冷卻至室溫，用水定容至5. 0ml。以第三支試 管液為對照在540nm波長條件下測得第一、二試管液的吸光度。根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算出酶活力值。
[0026] (4)酶活力計(jì)算：
[0027] 酶活力（IU/ml 或 IU/g)=(葡萄糖等量值 /180/15/0. 5) Xn
[0028] 式中：180-葡萄糖從微克換算成微摩爾
[0029] 15-待測液與底物的反應(yīng)時間
[0030] 0. 5一加入反應(yīng)的待測酶液量
[0031] η-酶樣的稀釋倍數(shù)
[0032] 2、搖瓶篩選：
[0033] 將上述出發(fā)菌株 L-IO 和 7 株突變菌（LA2-1，LA2-2, LA2-3, LA2-4, LA2-5, LA2-6 和 LA2-7)分別接種于500ml三角瓶中（含50ι?1--Μ誘導(dǎo)培養(yǎng)基），置于搖床上，28°C，200rpm， 培養(yǎng)5-7天。培養(yǎng)結(jié)束后，分別離心取上清，進(jìn)行酶活檢測（CMC酶活檢測法）和蛋白含量 測定（考馬斯亮藍(lán)檢測法），結(jié)果如表1所示。
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種里氏木霉，其特征在于，所述的里氏木霉的保藏編號為CCTCC N0:M2014564。
2. 權(quán)利要求1所述的里氏木霉在纖維素酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
3. -種生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述的方法，是將權(quán)利要求1所述的里氏木 霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中來發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為葡萄糖15. Og/ L、乳糖 16. Og/L，玉米漿 25. Oml/L，（NH4)2S045. Og/L，MgS04l. Og/L，KH2P0420g/L，CaCl20. 4g/ L，吐溫-800. 2ml/L，微量元素 0? 2ml/L，聚丙二醇-20000. 2ml/L，NaOH 1. Og/L, pH 值 5. 0。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的微量元素溶液的組成為：CuS04*5H20 0. 048mol/L, FeS04 ? 7H20 0. 18mol/L, CoCl2 ? 6H20 0. 034mol/L, MnCl2 ? 4H20 0. 08mol/L〇
【文檔編號】C12R1/885GK104371934SQ201410640307
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】黃亦鈞, 許韋, 吳佳鵬, 許麗紅, 李 瑞, 王華明 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司