一種解鳥氨酸拉烏爾菌gj-5菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株及其應(yīng)用，菌株保藏號為：CGMCC NO.9837；16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。將解鳥氨酸拉烏爾菌在固體分離培養(yǎng)基上劃線，于30℃下培養(yǎng)24h；取單菌落接入100mL LB培養(yǎng)基，30℃，150r·min-1恒溫搖床中培養(yǎng)24h；然后再接種到不同條件下的液體培養(yǎng)基，于30℃，150r·min-1恒溫搖床培養(yǎng)24h，然后測定氨氮的去除效率及OD600值。本發(fā)明菌株當C/N為6時，氨氮去除率為52.8％，在好氧的條件下具有良好的亞硝化作用和脫氮效果，易于滅活。
CGMCC No.9837
20141024
【專利說明】-種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于菌株及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株及其 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國水體富營養(yǎng)化問題日益嚴重，對水體中氮污染物的排放標準也愈加嚴格。 2012年，環(huán)保部對氨氮廢水排放量大、氨氮含量較高的行業(yè)，如：合成氨工業(yè)、紡織染整工 業(yè)、煉焦工業(yè)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)等行業(yè)的污水排放標準有一定幅度的提高，尤其是對氨氮、總氮 的要求愈發(fā)嚴格。大量氨氮廢水排入水體易導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化、引發(fā)水華赤潮，威脅飲水安 全。
[0003] 微生物吸收氨氮和硝態(tài)氮，并將這些無機氮轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)等有機氮，構(gòu)筑細胞和 組織結(jié)構(gòu)，從而達到除氮目的。硝化包含兩個氧化階段：一是氨氮氧化成亞硝態(tài)氮（氨氧 化）；二是亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化成硝態(tài)氮（亞硝酸鹽氧化）。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株及其應(yīng)用， 該菌株在好氧的條件下具有良好的亞硝化作用和脫氮效果，易于滅活，且制備方法簡單。
[0005] 本發(fā)明的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株，其特征在于：所述解鳥氨酸拉烏爾菌 (Raoultella ornithinolytica)GJ-5 菌株保藏號為：CGMCC N0. 9837 ;16SrDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 本發(fā)明的菌株經(jīng)16SrDNA序列測定和分析比較，鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌 (Raoultella ornithinolytica),其同源性達到 96%。
[0007] 解鳥氨酸拉烏爾菌菌株的菌落特征為：圓形，乳白色，不透明，濕潤，邊緣整齊，為 革蘭氏陰性菌。
[0008] 本發(fā)明的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用：將解鳥氨酸拉烏爾菌在固體 分離培養(yǎng)基上劃線，于30°C下培養(yǎng)24h ;取單菌落接入100mL LB培養(yǎng)基，30°C，150r ? mirT1 恒溫搖床中培養(yǎng)24h ;然后再接種到不同條件下的液體培養(yǎng)基，于30°C，150r 恒溫搖 床培養(yǎng)24h，然后測定氨氮的去除效率及0D6Jt。
[0009] 不同條件下的液體培養(yǎng)基為不同氨氮濃度、不同pH值、碳源或不同碳氮比（培養(yǎng) 基其他成分與亞硝化菌富集培養(yǎng)基相同）。
[0010] 所述固體分離培養(yǎng)基為（NH4) 2S042g ? L'檸檬酸三鈉5g ? I71，MgS04 ? 7H20 0? 03g ? I71，NaH2P04 ? 2H20 0? 325g ? I71，K2HP04 ? 2H20 0? 89g ? I71，MnS04 ? H20 0? 0076g ? I71， 1. 8% W/V 瓊脂，pH 7. 2。
[0011] 所述不同氨氮濃度為O-lOOOmg ? L'
[0012] 不同氨氮濃度為：0、50、100、200、300、400、600、800、1000mg ? L'
[0013] 優(yōu)選 0-200mg.L'
[0014]所述不同 pH 值為：5. 0-9. 0。優(yōu)選 5. 0-7. 5。
[0015] 所述的碳源為：葡萄糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、丁二酸鈉、甲醇、乙醇；優(yōu)選檸 檬酸三鈉。
[0016] 所述不同碳氮比為：0、3、6、9、12、15 ;優(yōu)選3-9。
[0017] 亞硝化細菌富集培養(yǎng)基為：(NH4) 2S042g ? I71，檸檬酸三鈉5g ? I71，MgS04 ? 7H20 0? 03g ? I71，NaH2P04 ? 2H20 0? 325g ? I71，K2HP04 ? 2H20 0? 89g ? I71，MnS04 ? H20 0? 0076g ? I71， pH 7. 2。
[0018] 本發(fā)明的鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica)GJ_5菌株，已于2014 年10月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC NO. 9837。
[0019] 有益效果
[0020] 本發(fā)明的菌株當C/N為6時，氨氮去除率為52. 8%，在好氧的條件下具有良好的亞 硝化作用和脫氮效果，易于滅活，且制備方法簡單。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0022] 圖2解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5不同氨氮初始濃度的氨氮去除效果；
[0023] 圖3解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5不同pH條件下的氨氮去除效果；
[0024] 圖4解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5不同碳源條件下的氨氮去除效果；
[0025] 圖5解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5不同碳氮比條件下的氨氮去除效果。

【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0027] 實施例1
[0028] 高效亞硝化菌的分離篩選與鑒定：
[0029] (1)將活性污泥上清液5mL加入121°C下滅菌30min后的100mL亞硝化細菌富集 培養(yǎng)基中，于30°C、150r ? min 1的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24h。
[0030] (2)采用格里斯試劑檢測上述培養(yǎng)基中是否有亞硝酸鹽，若呈紅色則說明有亞硝 酸鹽生成。然后從上述培養(yǎng)基中取2mL培養(yǎng)液，加入新鮮的亞硝化富集培養(yǎng)基中，按上述條 件繼續(xù)培養(yǎng)并檢測是否有亞硝酸鹽生成，該過程重復(fù)3次。
[0031] (3)取三次培養(yǎng)后的菌液，采用稀釋平板涂布法轉(zhuǎn)接固體分離培養(yǎng)基，置于恒溫箱 中于30°C下恒溫培養(yǎng)，2天后挑選單菌落進行純化。
[0032] 固體分離培養(yǎng)基為：(NH4)2S042g噸'檸檬酸三鈉5g ?L'MgSC^，7H20 0. 03g噸' NaH2P04 ? 2H20 0? 325g ? I71，K2HP04 ? 2H20 0? 89g ? I71，MnS04 ? H20 0? 0076g ? I71，1. 8% W/V 瓊脂，pH 7. 2。
[0033] (4)將純化后的所有菌株富集培養(yǎng)24h后，取2mL接種于富集培養(yǎng)基中，通過測定 氨氮濃度篩選出脫氮效果最強的菌株GJ-5。
[0034] 亞硝化富集培養(yǎng)基：(NH4) 2S042g ? L-1，檸檬酸三鈉 5g ? L-1，MgS04 ? 7H20 0. 03g ? L-1， NaH2P04 ? 2H20 0? 325g ? I71，K2HP04 ? 2H20 0? 89g ? I71，MnS04 ? H20 0? 0076g ? I71，pH 7. 2。
[0035] 實施例2
[0036] 1?效亞硝化菌的最佳條件：
[0037] 挑取平板分離單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，30°C、150r ?mirT1的恒溫搖床中振蕩培 養(yǎng)24h。（1)取上述培養(yǎng)基2mL加入不同初始氨氮濃度培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基其他成分與亞硝 化菌富集培養(yǎng)基相同），于30°C、150r ? mirT1的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)基中氨 氮濃度及(?6(|(|值。當NH 4-N濃度低于lOOmg*!/1時，氨氮去除效果高于80%。尤其，當氨 氮濃度為50mg ? I71時，氨氮的去除率達100%。但隨著初始氨氮濃度的升高，該菌對氨氮 的降解效果呈下降趨勢。NH 4-N濃度在200?lOOOmg ? I71范圍內(nèi)，氨氮去除率與氨氮初始 濃度呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為〇. 886。氨氮濃度高至lOOOrng ? I71時，氨氮去除率降至最低， 為20%。不同初始氨氮濃度的0D_值測定結(jié)果顯示，氨氮濃度在0?200mg ?廠1范圍內(nèi)， 微生物的生長呈上升趨勢，但隨著氨氮濃度的持續(xù)增長，微生物生長受抑制。這表明，低濃 度的氨氮能夠為微生物提供生長所需的氮源，但是高濃度氨氮對微生物有一定的影響，且 都不及無氮源對微生物生長繁殖的影響大。
[0038] (2)取上述培養(yǎng)基2mL加入不同初始pH值的培養(yǎng)基中（初始氨氮濃度為 212mg ? I71)，于30°C、150r ? mirT1的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)基中氨氮濃度及 〇D6Jt。該菌在初始pH條件為5. 0?7. 0的環(huán)境下0D6 ^值明顯高于7. 5?9. 0。pH范 圍為5. 0?7. 5時，氨氮去除率隨pH值的升高呈上升趨勢，且在pH為7. 0和7. 5時，氨氮 去除率最高，為57. 5%。當pH由7. 5上升至9. 0時，氨氮去除率下降，且在pH為9. 0時最 低，為34%。結(jié)果表明：中性偏酸性的環(huán)境有利于該亞硝化細菌的生長繁殖，同時也有利于 其對氨氮的去除。
[0039] (3)取上述培養(yǎng)基2mL加入不同碳源（葡萄糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、丁二酸 鈉、甲醇、乙醇）的培養(yǎng)基中（初始氨氮濃度為212mg ? I71)，于30°C、150r ? mirT1的恒溫搖 床中振蕩培養(yǎng)24h，測定培養(yǎng)基中氨氮濃度及0D6Jt。結(jié)果顯示：檸檬酸三鈉為外加碳源 時，該亞硝化菌的0D600值和氨氮去除率明顯高于其它碳源作為該微生物的外加碳源。此 時，氨氮的去除率為55. 2%。其余六種碳源作為外加碳源時的氨氮去除效果優(yōu)劣順序為： 葡萄糖>蔗糖>丁二酸鈉>蔗糖=乙酸鈉>甲醇。
[0040] (4)取上述培養(yǎng)基2mL加入不同初始C/N的培養(yǎng)基中（初始氨氮濃度為 212mg ? I71，碳源為朽1檬酸三鈉），于30°C、150r ? mirT1的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24h，測定培 養(yǎng)基中氨氮濃度及〇D6Jt。隨著C/N的升高，氨氮去除率和0D _呈上升趨勢，且當C/N高 于6后，氨氮去除率上升平緩。當C/N為6時，氨氮去除率為52.8%，C/N為15時，氨氮去 除率為64. 6%。從經(jīng)濟角度來說，利用該菌降解高氨氮廢水時，投加碳源，使得C/N控制在 6左右為宜。
【權(quán)利要求】
1. 一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株，其特征在于：所述解鳥氨酸拉烏爾菌 (Raoultella ornithinolytica)GJ_5 菌株的保藏號為：CGMCC N0.9837;16SrDNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -種如權(quán)利要求1所述的解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：將解 鳥氨酸拉烏爾菌在固體分離培養(yǎng)基上劃線，于30°C下培養(yǎng)24h ;取單菌落接入100mL LB培 養(yǎng)基，30°C，150r ? mirT1恒溫搖床中培養(yǎng)24h ;然后再接種到不同條件下的液體培養(yǎng)基，于 30°C，150r ? mirT1恒溫搖床培養(yǎng)24h，然后測定氨氮的去除效率及OD 6(IQ值。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：所 述固體分離培養(yǎng)基為：(NH4)2S042g ? L-1，檸檬酸三鈉 5g ? L-1，MgS04 ? 7H20 0. 03g ? L-1， NaH2P04 ? 2H20 0? 325g ? I71，K2HP04 ? 2H20 0? 89g ? I71，MnS04 ? H20 0? 0076g ? I71，1. 8% W/V 瓊脂，pH 7. 2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述 LB培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g，，酵母提取物5g，氯化鈉10g，調(diào)pH 7. 0,用去離子水定容至 lL〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述 不同條件下的液體培養(yǎng)基為：不同氨氮濃度、pH值、碳源或碳氮比。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述 氨氮濃度為：〇?200mg ? I71。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述 pH值為5. 0?7. 5。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述 的碳源為：葡萄糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、丁二酸鈉、甲醇、乙醇中的一種或幾種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種解鳥氨酸拉烏爾菌GJ-5菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述 碳氮比為：〇?15。
【文檔編號】C12R1/01GK104450563SQ201410641838
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】趙曉祥, 龔娟, 張弛, 陳淑麗 申請人:東華大學(xué)