一種鑒定或輔助鑒定細(xì)菌菌門的引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鑒定或輔助鑒定細(xì)菌菌種的引物及其應(yīng)用。本發(fā)明的引物是由如SEQ ID No.1中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.2中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.3中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.4中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.5中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物、如SEQ ID No.6中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物和如SEQ ID No.7中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物，結(jié)合普通PCR技術(shù)，可以快速、高覆蓋的構(gòu)建細(xì)菌高通量Illumina測序文庫。
【專利說明】一種鑒定或輔助鑒定細(xì)菌菌門的引物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鑒定或輔助鑒定細(xì)菌菌門的引物及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 高通量測序作為近年來發(fā)展起來的全新的技術(shù)手段，在生態(tài)系統(tǒng)的研究中起到了 非常重要的作用。隨著測序技術(shù)的逐漸成熟和應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)大，其重要性日益突出。目前 高通量測序已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境和人體腸道樣本的微生物群落多樣性和豐度的檢測，主 要包括土壤、動(dòng)物體表和腸道樣品等。
[0003] 盡管高通量測序技術(shù)于近年得到廣泛應(yīng)用，但測序文庫的構(gòu)建方法仍沒有明顯的 改進(jìn)。測序文庫的構(gòu)建主要包括以下步驟：元基因組提取，基因組的片斷化，DNA片斷末端 加 A，然后加 adaptor。之后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增目的片斷，最后對(duì)構(gòu)建好的文 庫進(jìn)行定量，定量合格的文庫即可用于高通量測序。建庫過程中涉及多個(gè)DNA片斷篩選和 磁珠純化的步驟。該方法對(duì)于需要了解生態(tài)系統(tǒng)中菌群的多樣性和豐度要求的樣品并不適 用，因?yàn)闇y序會(huì)產(chǎn)生大量不需要的冗余數(shù)據(jù)從而增加測序成本，而且以上的建庫方法步驟 繁瑣而耗時(shí)。故開發(fā)步驟簡單而覆蓋率高的測序文庫構(gòu)建方法就顯得尤為重要。
[0004] 目前細(xì)菌的分子鑒定普遍采用16S rRNA基因作為金標(biāo)準(zhǔn)。菌種鑒定的常規(guī)步驟 是利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增該基因全長，測序后與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對(duì)來鑒定 菌種。目前使用高通量測序方法研究生態(tài)系統(tǒng)中菌群多樣性和豐度的普遍采用的平臺(tái)是焦 磷酸測序（454pyrosequencing)，該方法準(zhǔn)確率高但成本也很高，而且通量低。但目前采用 Illumina平臺(tái)構(gòu)建文庫時(shí)僅采用單一測序引物，無法覆蓋大多數(shù)數(shù)據(jù)庫中已知的細(xì)菌菌 門，從而會(huì)丟失一部分沒有覆蓋到的菌門信息。因此設(shè)計(jì)高覆蓋率的測序引物迫在眉睫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一組用于鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門的引物。
[0006] 本發(fā)明所提供的一組用于鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門的引物，由如下 ⑴-⑵所示引物組成：
[0007] (1)如SEQ ID No. 1中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
[0008] (2)如SEQ ID No. 2中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
[0009] (3)如SEQ ID No. 3中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
[0010] (4)如SEQ ID No. 4中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
[0011] (5)如SEQ ID No. 5中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物；
[0012] (6)如SEQ ID No. 6中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物；
[0013] (7)如SEQ ID No. 7中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物。
[0014] 上述引物中，所述正向引物序列的5'端連接有adaptor序列。
[0015] 上述引物中，所述正向引物序列的5'端連接的adaptor序列如SEQ ID No. 1中第 1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No. 2中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No. 3中第 1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No. 4中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No. 5中第 1-58位核苷酸分子所不。
[0016] 上述引物中，所述反向引物序列的5'端連接有adaptor序列。
[0017] 上述引物中，所述反向引物序列的5'端連接的adaptor序列如SEQ ID No. 6中第 1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No. 7中第1-58位核苷酸分子所示。
[0018] 上述引物中，所述反向引物中還包括barcode序列。
[0019] 上述引物中，所述barcode序列加入的位置是反向引物中的adaptor序列的第 24-25位核苷酸分子之間，不同的待測樣品中加入不同的barcode序列。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌種的試 劑盒。
[0021] 上述所述試劑盒中包括上述任一所述的引物。
[0022] 上述所述的試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門的產(chǎn)品中的應(yīng)用 也是本發(fā)明的目的。
[0023] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門的方法。
[0024] 本發(fā)明所提供的一種鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門的方法包括如下步 驟：
[0025] (1)提取待測樣品中細(xì)菌基因組DNA ;
[0026] (2)以步驟（1)中提取的基因組DNA為模板，采用上述所述的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò) 增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0027] (3)利用IlluminaHiSeq2000測序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端150bp測序；
[0028] (4)對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行菌門分類，得到待測樣品中存在的細(xì)菌菌門。
[0029] 上述方法中，所述的細(xì)菌菌門包括：Actinobacteria，Bacteroidetes, Fusobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Aquificae, Caldiserica, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Marinimicrobia, Nitrospirae, Planctomycetes, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria， Thermotogae， Parcubacteria， Microgenomates， SR1， Candidatus Saccharibacteria， Latescibacteria， Armatimonadetes， Verrucomicrobia， Omnitrophica，Poribacteria，Hydrogenedentes，Nitrospinae。
[0030] 上述方法中，所述待測樣品為含有細(xì)菌的樣品；所述具體為人體腸道樣本、動(dòng)植物 或環(huán)境；更具體為人糞便。
[0031] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建細(xì)菌高通量Illumina測序文庫的方法。
[0032] 本發(fā)明所提供的一種構(gòu)建細(xì)菌高通量Illumina測序文庫的方法包括如下步驟：
[0033] (1)提取待測樣品中細(xì)菌基因組DNA ;
[0034] (2)以步驟（1)中提取的基因組DNA為模板，采用上述所述的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò) 增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物即為所述細(xì)菌高通量Illumina測序文庫；
[0035] 上述所述的方法在鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門中的應(yīng)用也是本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0036] 本發(fā)明提供了一種鑒定或輔助鑒定細(xì)菌菌門的引物及其應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明：利用本 發(fā)明設(shè)計(jì)的引物，結(jié)合普通PCR技術(shù)，可以快速、高覆蓋的構(gòu)建細(xì)菌高通量Illumina測序文 庫。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為18個(gè)糞便樣本PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M:marker ;N:陰性對(duì)照； 1-18:樣本號(hào)。
[0038] 圖2為人體腸道樣本的Illumina和454焦磷酸測序結(jié)果在菌門水平上的比對(duì)。 圖2A為18個(gè)人體腸道（糞便）樣品Illumina測序結(jié)果分析；圖2B為18個(gè)人體腸道（糞 便）樣品454焦磷酸測序結(jié)果分析。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)與合成
[0042] 本發(fā)明使用了 5條正向引物（長度為17bp)和2條反向引物（長度為17bp)。5 條正向引物分別命名為338F、339F、340F、341F和342F，2條反向引物分別命名為518R和 519R，引物序列見表1。在表1中，match%為在核糖體數(shù)據(jù)庫（RDP)中細(xì)菌比對(duì)的百分比 (%)，比對(duì)序列為'Good' quality且序列長度大于1200nt，7條引物可以覆蓋核糖體數(shù)據(jù) 庫項(xiàng)目中已知的35個(gè)菌門。
[0043] 表1、構(gòu)建文庫使用的16S rRNA基因 V3區(qū)特異引物序列
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一組用于鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門的引物，由如下（1)-(7)所示引物組 成： (1) 如SEQ ID No. 1中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物； (2) 如SEQ ID No. 2中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物； (3) 如SEQ ID No. 3中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物； (4) 如SEQ ID No. 4中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物； (5) 如SEQ ID No. 5中第59-75位核苷酸分子所示的正向引物； (6) 如SEQ ID No. 6中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物； (7) 如SEQ ID No. 7中第59-75位核苷酸分子所示的反向引物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物序列的5'端連接有adaptor 序列； 所述正向引物序列的5'端連接的adaptor序列如SEQ ID No. 1中第1-58位核苷酸分 子所示或SEQ ID No. 2中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No. 3中第1-58位核苷酸分 子所示或SEQ ID No. 4中第1-58位核苷酸分子所示或SEQ ID No. 5中第1-58位核苷酸分 子所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述反向引物序列的5'端連接有 adaptor 序列； 所述反向引物序列的5'端連接的adaptor序列如SEQ ID No. 6中第1-58位核苷酸分 子所示或SEQ ID No. 7中第1-58位核苷酸分子所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的引物，其特征在于，所述反向引物中還包括barcode序 列； 所述barcode序列加入的位置是反向引物中的adaptor序列的第24-25位核苷酸分子 之間，不同的待測樣品中加入不同的barcode序列。
5. -種用于鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌種的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求 1-4任一所述的引物。
6. 權(quán)利要求5所述的試劑盒在制備鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)囷囷門的廣品中的 應(yīng)用。
7. -種鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測樣品中細(xì)菌基因組DNA; (2) 以步驟⑴中提取的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1-4任一所述的引物進(jìn)行多 重PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； (3) 利用IlluminaHiSeq2000測序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端150bp測序； (4) 對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行菌門分類，得到待測樣品中存在的細(xì)菌菌門。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)菌菌門包括： Actinobacteria， Bacteroidetes， Fusobacteria， Proteobacteria， Firmicutes， Aquificae， Caldiserica， Chlamydiae， Chlorobi， Chloroflexi， Chrysiogenetes， Deferribacteres， Deinococcus-Thermus， Elusimicrobia， Fibrobacteres， Gemmatimonadetes， Lentisphaerae， Marinimicrobia， Nitrospirae， Planctomycetes， Spirochaetes， Synergistetes， Tenericutes， Thermodesulfobacteria， Thermotogae， Parcubacteria，Microgenomates，SR1，CandidatusSaccharibacteria，Latescibacteria， Armatimonadetes， Verrucomicrobia， Omnitrophica， Poribacteria， Hydrogenedentes， Nitrospinae。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述待測樣品為含有細(xì)菌的樣品；具 體為人體腸道樣本、動(dòng)植物或環(huán)境；更具體為人糞便。
10. -種構(gòu)建細(xì)菌高通量Illumina測序文庫的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測樣品中細(xì)菌基因組DNA; (2) 以步驟⑴中提取的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1-4任一所述的引物進(jìn)行多 重PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物即為所述細(xì)菌高通量Illumina測序文庫； 或，權(quán)利要求10所述的方法在鑒定或輔助鑒定待測樣品中細(xì)菌菌門中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104372091SQ201410641915
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】朱寶利, 欒春光, 苗慧芳, 楊犀, 張瑞芬 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所