一種基于高通量測序的snp檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于高通量測序的SNP檢測方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟：探針設(shè)計、預(yù)擴(kuò)增及biotin標(biāo)記、雜交、連接、Barcode特異性引物擴(kuò)增、測序、根據(jù)測序結(jié)果來分析樣品的SNP位點(diǎn)信息。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)提高了體系的靈敏度、(2)樣品標(biāo)記簡單、(3)排除了預(yù)擴(kuò)增中的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的影響利于數(shù)據(jù)分析、(4)建庫方法簡單、(5)降低了模板隨機(jī)突變的概率、(6)極大的降低測序成本、(7)數(shù)據(jù)分析容易、(8)位點(diǎn)選擇靈活，非常適合中等數(shù)量的突變位點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模樣本篩查。
【專利說明】一種基于高通量測序的SNP檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于高通量測序的SNP檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] SNP在分子診斷、臨床檢驗(yàn)、病原檢測、法醫(yī)學(xué)、遺傳疾病研究、指導(dǎo)個體化用藥和 新藥研發(fā)等多方面具有極其重要應(yīng)用價值（GayetAgeron et al. 2009)。SNP檢測是目前基 因診斷的主要研究內(nèi)容。同時，SNP檢測所代表的基因診斷也逐漸成為新生兒或特定人群 遺傳病篩查的重要手段之一。因此，一種操作方便、成本低廉并且高通量的SNP檢測技術(shù)是 當(dāng)前基因檢測的關(guān)鍵所在。
[0003] 相比較其他高通量的基因檢測技術(shù)，二代高通量測序技術(shù)更準(zhǔn)確、靈敏、具有更高 的通量。隨著價格的不斷降低，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，已涉及生命科學(xué)研究以及醫(yī)學(xué)研究的 各個不同方面。利用高通量測序技術(shù)來進(jìn)行高通量的SNP檢測是目前的研究熱點(diǎn)之一。
[0004] 當(dāng)前，二代測序技術(shù)都需要進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建，然后使用構(gòu)建好的文庫進(jìn)行上 機(jī)測序。其一般步驟主要包括DNA提取、DNA片段化、片段選擇、文庫構(gòu)建（包括加接頭、擴(kuò) 增等步驟）、上機(jī)測序，最后完成數(shù)據(jù)分析。這些環(huán)節(jié)中，文庫構(gòu)建最為費(fèi)事費(fèi)力。而且在 建庫過程中樣本需要擴(kuò)增上千上萬倍，樣本中的基因量容易出現(xiàn)偏差。使用這種建庫方法， 所有基因組中的片段被測序的幾率相同，適合對基因組進(jìn)行測序。如果只對其中的某些基 因感興趣，或只需要對特定部分測序，這種建庫方法就會浪費(fèi)測序空間，并增加數(shù)據(jù)分析難 度。同時，這種建庫方法樣品處理步驟繁瑣，測序數(shù)據(jù)復(fù)雜龐大，需要的起始核酸量高，很難 進(jìn)行大規(guī)模樣本的同時測序。
[0005] 對特定的某些感興趣基因（如外顯子、某些單基因致病基因等）測序則需要目標(biāo) 序列富集等額外的建庫步驟。通過雜交進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲富集是目前應(yīng)用最為廣泛的方 法。應(yīng)用較為廣泛的目標(biāo)序列捕獲技術(shù)主要基于固相雜交捕獲（Choietal. 2009)或液相雜 交捕獲技術(shù)（Bainbridge et al. 2010)?，F(xiàn)在有商業(yè)化的定制捕獲試劑盒（如Niblegen sequence capture array 5? Aglient sureselect target enrichment system 等)可以 使用。這些商業(yè)化的定制序列捕獲試劑盒一般價格昂貴，一旦芯片定制后檢測目標(biāo)序列就 被固定，位點(diǎn)的選擇不靈活。除利用目標(biāo)序列捕獲技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)基因測序研究之外，同時基 于PCR技術(shù)的非雜交序列捕獲技也得到應(yīng)用。但基于多重PCR的技術(shù)有其先天不足，一些 區(qū)域會得不到有效的擴(kuò)增。同時，聚合酶本身的擴(kuò)增錯誤，以及所有片段都被混合擴(kuò)增，測 序結(jié)果難以驗(yàn)證。
[0006] i Ilumina公司還提供一種不同的PCR擴(kuò)增建庫技術(shù)（Truseq coustom amplicon)。其主要原理為：在目標(biāo)序列的兩側(cè)設(shè)計一對帶有通用探針的同向探針。通過探 針與目標(biāo)特異序列雜交，將2條探針錨定在目標(biāo)序列的5'端和3'端。利用DNA聚合酶進(jìn) 行延伸填補(bǔ)兩條探針之間的空隙（即感興趣序列），然后測序。這種方法根據(jù)所測基因序列 需要設(shè)計不同的探針，其探針設(shè)計較為復(fù)雜，建庫質(zhì)量會受雜交效率的影響較大。利用這種 方法來檢測低頻突變時，因?yàn)榻^大多數(shù)的測序結(jié)果是野生型序列，需要增加測序深度來達(dá) 到符合要求的靈敏度，無形之中浪費(fèi)了測序空間。同時，利用這種方法進(jìn)行大規(guī)模的群體突 變基因篩查時，野生型序列會占去大部分測序空間，造成測序成本升高。此外，這種建庫方 法每份樣品需要高達(dá)數(shù)百ng的核酸量，不利于一些濃度較低、稀有或者難獲取的核酸樣品 進(jìn)行測序。
[0007] 基于這些建庫方法的不足，需要建立一種針對SNP檢測的多樣品、多位點(diǎn)、簡單高 效的高通量建庫測序方法。DNA連接酶對單個核苷酸變異具有很強(qiáng)的鑒別能力，它可以將與 模板完全配對的兩相鄰寡核苷酸片段連接起來，如果連接處出現(xiàn)一個堿基錯配，連接反應(yīng) 就不能進(jìn)行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供一種基于高通量測序檢測待測樣本中突變位點(diǎn)的方法。
[0009] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)針對已知突變位點(diǎn)所在的靶序列設(shè)計檢測探針和預(yù)擴(kuò)增引物對，
[0011] 所述突變位點(diǎn)為SNP位點(diǎn)、插入突變位點(diǎn)和/或缺失突變位點(diǎn)；
[0012] 所述檢測探針為1個或多個用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A和/或1個或多個用 于檢測插入或缺失突變位點(diǎn)的檢測探針B ;所述每個檢測探針A或每個檢測探針B對應(yīng)一 個所述突變位點(diǎn)；
[0013] 所述用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A由上游位點(diǎn)分型探針ASO-A和下游位點(diǎn)特異 探針LSO-A組成，且所述ASO-A探針和所述LSO-A探針的延伸方向相同；
[0014] 所述ASO-A的3'端與SNP野生型堿基所在靶序列或SNP突變位點(diǎn)堿基所在靶序 列相同或互補(bǔ)；所述ASO-A的3'末端堿基與所述SNP野生型堿基或所述SNP突變位點(diǎn)堿基 相同或互補(bǔ)；
[0015] 所述ASO-A探針的5'端游離于所述SNP野生型堿基所在靶序列或所述SNP突變 位點(diǎn)堿基所在靶序列之外，且為通用探針Pl ;
[0016] 所述SNP突變位點(diǎn)每個突變形式對應(yīng)一條ASO-A探針；具體：所述SNP突變位點(diǎn)需 設(shè)計4條ASO-A探針，4條所述ASO-A的3'末端堿基分別為A、T、C、G ;所述ASO-A探針的 5'端游離于所述靶序列之外且為通用探針Pl ;也可只使用其中3條ASO-A探針，2條所述 ASO-A的3'末端堿基分別對應(yīng)SNP的野生型堿基或突變型形式堿基，另外一條ASO-A的3' 末端堿基可選擇除SNP的野生型堿基或突變型形式堿基以外的一種堿基。所述ASO-A探針 的5'端游離于所述靶序列之外且為通用探針Pl ;也可只使用其中2條ASO-A探針，2條所 述ASO-A的3'末端堿基分別對應(yīng)SNP的野生型堿基或突變型形式堿基。所述ASO-A探針 的5'端游離于所述靶序列之外且為通用探針Pl ;當(dāng)只檢測SNP位點(diǎn)某一種堿基形式時，可 使用1條所述ASO-A探針，ASO-A探針的3'末端堿基對應(yīng)需檢測SNP的堿基形式相同或互 補(bǔ)；
[0017] 所述LSO-A探針的5'端與所述靶序列相同或互補(bǔ)，且其5'末端堿基與所述靶序 列按照探針延伸方向SNP位點(diǎn)下游第一個緊鄰堿基相同或互補(bǔ)，且5'末端堿基磷酸化，所 述LSO-A探針3'端游離于所述靶序列之外且為通用探針P2 ;
[0018] 所述用于檢測插入/缺失突變位點(diǎn)的檢測探針B由1條用于檢測插入/缺失突變 位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-BU條用于檢測野生型位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B和1 條下游位點(diǎn)特異探針LSO-B組成，且3條探針的延伸方向相同；
[0019] 所述用于檢測插入/缺失突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B為用于檢測插入 突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針A S 0 -B或用于檢測插缺失突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針 ASO-B ；
[0020] 所述用于檢測插入突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B的3'端與插入突變位點(diǎn) 所在的靶序列相同或互補(bǔ)，且其3'末端堿基與所述插入突變位點(diǎn)序列的最后一位堿基相同 或互補(bǔ)；
[0021] 所述用于檢測缺失突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B的3'端與缺失突變位點(diǎn) 所在的靶序列相同或互補(bǔ)，且其3'末端堿基與所述野生型位點(diǎn)所在靶序列上缺失突變位點(diǎn) 序列中第一位堿基的上游緊鄰堿基相同或互補(bǔ)；
[0022] 所述插入/缺失突變位點(diǎn)所在的靶序列為所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列的第η個 堿基前插入或者缺失突變位點(diǎn)得到的序列；
[0023] 所述用于下游位點(diǎn)特異探針LSO-B的5'端與所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列相同 或互補(bǔ)，且其5'末端堿基與所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列沿探針延伸方向第η位堿基相同 或互補(bǔ)；
[0024] 所述LSO-B探針的3'端游離于所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列之外且為通用探針 Ρ2 ；
[0025] 每個突變位點(diǎn)的每條所述上游位點(diǎn)分型探針ASO與其對應(yīng)的下游位點(diǎn)特異探針 LSO均可無間隙、非重疊拼接為該突變位點(diǎn)對應(yīng)的目的靶序列反向互補(bǔ)序列；
[0026] 所述預(yù)擴(kuò)增引物對為1個或多個預(yù)擴(kuò)增引物對，所述預(yù)擴(kuò)增引物對為能夠擴(kuò)增出 1個或多個突變位點(diǎn)所在靶序列的引物對；且每個所述預(yù)擴(kuò)增引物對中的一條引物的5'端 標(biāo)記 biotin ;
[0027] 2)用1個所述預(yù)擴(kuò)增引物對或多個所述預(yù)擴(kuò)增引物對待測樣本進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到 biotin標(biāo)記核酸；
[0028] 3)用一個所述檢測探針A、多個所述檢測探針A的混合物、一個所述檢測探針B和 /或多個所述檢測探針B的混合物與所述biotin標(biāo)記核酸雜交，得到雜交產(chǎn)物；
[0029] 4)用DNA連接酶連接所述雜交產(chǎn)物，得到測序靶序列；
[0030] 5)用Barcode特異性引物和Common primer引物對測序祀序列進(jìn)行擴(kuò)增、高通量 測序，得到測序靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果；
[0031] 所述Barcode特異性引物和Common primer弓丨物的3'端20個堿基分別與所述通 用探針Pl和所述通用探針P2互補(bǔ)；
[0032] 所述Barcode特異性引物中含有用于區(qū)分樣本的Barcode序列XXXXXX，該序列為 A、T、C和G隨機(jī)組合的6堿基，根據(jù)不同的組合方式確定不同的樣本；
[0033] 6)分析所述測序結(jié)果，確定待測樣本是否含有該突變位點(diǎn)或確定該突變位點(diǎn)的基 因型。
[0034] 所述分析所述測序結(jié)果確定待測樣本是否含有該突變位點(diǎn)或確定該突變位點(diǎn)的 基因型包括如下步驟：
[0035] 將某個突變位點(diǎn)對應(yīng)的目的靶序列反向互補(bǔ)序列與所述測序結(jié)果進(jìn)行比對，相同 序列的個數(shù)為該突變位點(diǎn)數(shù)目；計算該突變位點(diǎn)占總位點(diǎn)的比例，得到該突變位點(diǎn)比例； 根據(jù)該突變位點(diǎn)占總位點(diǎn)的比例來判該位點(diǎn)的基因型信息。所述位點(diǎn)基因型信息的判斷， 需要根據(jù)對已知信息的各位點(diǎn)所占比例進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，設(shè)定合適的閾值，并通過閾值來 判斷所檢測位點(diǎn)的信息。
[0036] 所述總位點(diǎn)由突變位點(diǎn)和野生型位點(diǎn)總和；
[0037] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，若該突變位點(diǎn)比例大于90 %，則所述待測樣本含有或候選 含有該突變位點(diǎn)或所述待測樣本的基因型為或候選為突變位點(diǎn)純合型；若該突變位點(diǎn)比例 為20-90 %，則所述待測樣本含有或候選含有該突變位點(diǎn)或所述待測樣本的基因型為或候 選為突變位點(diǎn)雜合型；若該突變位點(diǎn)比例為小于20 %，則所述待測樣本不含有或候選不含 有該突變位點(diǎn)或所述待測樣本的基因型為或候選為野生型。
[0038] 上述野生型位點(diǎn)為將某個突變位點(diǎn)對應(yīng)野生型位點(diǎn)的目的靶序列反向互補(bǔ)序列 與所述測序結(jié)果進(jìn)行比對，相同序列的個數(shù)為野生型位數(shù)位點(diǎn)；
[0039] 上述方法中，步驟1)中，所述突變位點(diǎn)為SNP位點(diǎn)和插入/缺失突變位點(diǎn)；
[0040] 所述檢測探針為多個用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A和多個用于檢測缺失或插入 突變位點(diǎn)的檢測探針B ;
[0041] 所述檢測探針中的每條探針均為等摩爾混合；
[0042] 步驟2)中，所述多個所述預(yù)擴(kuò)增引物對混合物為多個所述預(yù)擴(kuò)增引物對等摩爾 比混合；
[0043] 所述待測樣本為一個或多個，每一種Barcode特異性引物對應(yīng)一種待測樣本；
[0044] 步驟3)中，所述多個所述檢測探針A的混合物為多個所述檢測探針A等摩爾比混 合；
[0045] 所述多個所述檢測探針B的混合物為多個所述檢測探針B等摩爾比混合。
[0046] 上述方法中，步驟2)中，在所述預(yù)擴(kuò)增的步驟后，還包括如下步驟：向所述預(yù)擴(kuò) 增的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入核酸外切酶I和堿性磷酸酶去除預(yù)擴(kuò)增體系中的引物和dNTP，得到 biotin標(biāo)記核酸。
[0047] 上述方法中，在步驟3)所述雜交中，用磁珠吸附捕獲所述雜交產(chǎn)物。
[0048] 上述方法中，在步驟5)中，所述測序采用二代測序儀器進(jìn)行。
[0049] 上述方法中，所述檢測探針為2個用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A和3個用于檢 測缺失或插入突變位點(diǎn)的檢測探針B組成；
[0050] 所述 SNP 位點(diǎn)為 14940T 和 IVS7-2A>G ;
[0051] 所述缺失或插入突變位點(diǎn)為235delC、176DEL16和299delAT ;
[0052] 所述1494C>T對應(yīng)的檢測探針A由序列表中序列21所示的ASO-A探針、序列表中 序列22所示的ASO-A探針、序列表中序列23所示的ASO-A探針、序列表中序列24所示的 ASO-A探針和序列表中序列25所示的LSO-A探針組成；
[0053] 所述IVS7-2A>G對應(yīng)的檢測探針A由序列表中序列7所示的ASO-A探針、序列表 中序列8所示的ASO-A探針、序列表中序列9所示的ASO-A探針、序列表中序列10所示的 ASO-A探針和序列表中序列11所示的LSO-A探針組成；
[0054] 所述235delC對應(yīng)的檢測探針B由序列表中序列15所示的ASO-B探針、序列表中 序列16所示的ASO-A探針和序列表中序列17所示的LSO-B探針組成；
[0055] 所述176DEL16對應(yīng)的檢測探針B由序列表中序列12所示的ASO-B探針、序列表 中序列13所示的ASO-A探針和序列表中序列14所示的LSO-B探針組成；
[0056] 所述299delAT對應(yīng)的檢測探針B由序列表中序列18所示的ASO-B探針、序列表 中序列19所示的ASO-A探針和序列表中序列20所示的LSO-B探針組成；
[0057] 所述預(yù)擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增176dell6、299delAT、235delC三個突變位點(diǎn)的引物對 1、用于擴(kuò)增1494CXT位點(diǎn)的引物對2和用于擴(kuò)增IVS7-2A>G位點(diǎn)的引物對3組成；
[0058] 所述引物對1由序列表中序列28所示的單鏈DNA分子和序列表中序列29所示的 單鏈DNA分子組成；
[0059] 所述引物對2由序列表中序列26所示的單鏈DNA分子和序列表中序列27所示的 單鏈DNA分子組成；
[0060] 所述引物對3由序列表中序列30所示的單鏈DNA分子和序列表中序列31所示的 單鏈DNA分子組成。
[0061] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測突變位點(diǎn)的試劑盒。
[0062] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的14940T對應(yīng)的檢測探針A、所述IVS7-2A>G對 應(yīng)的檢測探針A、所述235delC對應(yīng)的檢測探針B、所述176DEL16對應(yīng)的檢測探針B、所述 299delAT對應(yīng)的檢測探針B、所述用于擴(kuò)增176dell6、299delAT、235delC三個突變位點(diǎn)的 引物對1、所述用于擴(kuò)增1494CXT位點(diǎn)的引物對2和所述用于擴(kuò)增IVS7-2A>G位點(diǎn)的引物對 3 ；
[0063] 所述突變位點(diǎn)為 1494C>T、IVS7-2A>G、235delC、176DEL16 和 299delAT。
[0064] 所述Barcode primer的核苷酸序列為序列表中序列32 ;
[0065] 所述Common primer的核苷酸序列為序列表中序列33。
[0066] 檢測多個突變位點(diǎn)是可以用多個預(yù)擴(kuò)增引物對混合擴(kuò)增，用多個檢測探針混合檢 測；
[0067] 所述突變位點(diǎn)為 235delC (缺失 C)、176dell6(缺失 16bp)、299delAT (缺失 AT)、 IVS7-2A>G(A 突變?yōu)?G)和 / 或 1494C>T(C 突變?yōu)?T);
[0068] 所述步驟3)的雜交和雜交產(chǎn)物磁珠捕獲的方法如下：將適當(dāng)濃度的檢測探針 ASO、LSO及上述處理檢測樣品加入反應(yīng)體系中，加入適當(dāng)鹽離子濃度的雜交液binding buffer。高溫變性，然后進(jìn)行低溫退火，使得探針ASO和LSO與檢測位點(diǎn)周圍序列充分雜 交。退火完成以后，加入磁珠，以合適溫度溫育。溫育完成以后，使用washing buffer和 Taq ligation buffer洗漆磁珠，除去未雜交的探針。
[0069] 所述步驟4)洗滌完成后，使用DNA連接酶，在合適溫度下進(jìn)行連接。連接反應(yīng)完 成，去連接反應(yīng)液，用適量CldH2O重懸磁珠，加熱解離下連接好的探針。
[0070] 所述步驟5)使用Barcode Primer/Common primer引物對解離產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0071] 對技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：步驟3)進(jìn)行樣品雜交反應(yīng)時，把樣品分為2份，一份 樣品只加入野生型探針。而另一份樣品中加入其余3種探針或突變型探針。按所述方法 步驟4)，步驟5)繼續(xù)制備測序樣品。獲得目的片段后，2管分別進(jìn)行步驟6)所述Barcode Primer/Common primer引物擴(kuò)增。擴(kuò)增后定量，按照比例將2管樣品混合然后進(jìn)行高通量 測序。這樣進(jìn)行大規(guī)模SNP突變基因篩查或檢測低頻率的突變時，可只使用特異性突變探 針檢測突變型SNP位點(diǎn)，有效利用測序空間，節(jié)約測序成本。
[0072] 本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0073] (1)引入預(yù)擴(kuò)增步驟，極大提高了體系的靈敏度，可以檢測低至50copy的核酸；
[0074] (2)樣品標(biāo)記簡單，在預(yù)擴(kuò)增的同時完成樣品標(biāo)記不需要額外的標(biāo)記步驟；
[0075] (3)預(yù)擴(kuò)增完成后利用特異性探針對產(chǎn)物進(jìn)行檢測及富集，相比較于擴(kuò)增子測序 等方法排除了預(yù)擴(kuò)增中的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的影響，有利于數(shù)據(jù)分析；
[0076] (4)建庫方法簡單，不需要進(jìn)行基因組片段化和人工接頭等繁瑣步驟；
[0077] (5)利用DNA連接酶直接進(jìn)行SNP堿基區(qū)分，避免了延伸過程中造成的隨機(jī)突變， 提1? 了測序的精確度；
[0078] (6)可以只使用突變探針對大規(guī)模樣本進(jìn)行篩查，極大的降低測序成本；
[0079] (7)所有測序序列均已知，數(shù)據(jù)分析容易；
[0080] (8)位點(diǎn)選擇靈活，非常適合中等數(shù)量的突變位點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模樣本篩查。
[0081] 基于DNA連接酶的這個特點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計了一種新的建庫方法，根據(jù)SNP位點(diǎn)序 列信息設(shè)計兩條相鄰探針，其中一條探針的3'末端對應(yīng)SNP位點(diǎn)。當(dāng)兩條相鄰探針與SNP 位點(diǎn)序列完全互補(bǔ)時，就會被DNA連接酶連接，否則就不會被連接。利用探針上所帶通用探 針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增建庫。然后利用二代測序技術(shù)進(jìn)行高通量測序，分析SNP位點(diǎn)信息。通過 不同探針組合可以實(shí)現(xiàn)多個位點(diǎn)的檢測。利用Barcode引物，可以將不同樣品按照一定比 例混合，一起上機(jī)測序，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)、多樣品、高通量檢測。在進(jìn)行大規(guī)模的群體突變基因篩 查時，可只使用突變型探針進(jìn)行檢測，可以更有效的利用測序空間，節(jié)約成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0082] 圖1為本發(fā)明檢測方法示意圖
[0083] 圖2為質(zhì)粒組I檢測結(jié)果
[0084] A為1494位點(diǎn)野生型質(zhì)粒檢測結(jié)果
[0085] B為IVS7-2位點(diǎn)野生型質(zhì)粒檢測結(jié)果
[0086] C為176位點(diǎn)野生型質(zhì)粒檢測結(jié)果
[0087] D為235位點(diǎn)野生型質(zhì)粒檢測結(jié)果
[0088] E為299位點(diǎn)野生型質(zhì)粒檢測結(jié)果
[0089] 圖3為質(zhì)粒組II檢測結(jié)果
[0090] A為1494位點(diǎn)（C:T = 1 :1)的檢測結(jié)果
[0091] B為IVS7-2位點(diǎn)（A:G = 1:1)的檢測結(jié)果
[0092] C為176位點(diǎn)（WT:MT = 3:1)的檢測結(jié)果
[0093] D為235位點(diǎn)（WT:MT = 3:1)的檢測結(jié)果
[0094] E為299位點(diǎn)（WT:MT = 3:1)的檢測結(jié)果
[0095] 圖4為質(zhì)粒組III檢測結(jié)果
[0096] A為1494位點(diǎn)突變型質(zhì)粒的檢測結(jié)果
[0097] B為IVS7-2位點(diǎn)突變型質(zhì)粒的檢測結(jié)果
[0098] C為176位點(diǎn)（WT:MT = 2:1)的檢測結(jié)果
[0099] D為235位點(diǎn)（WT:MT = 2:1)的檢測結(jié)果
[0100] E為299位點(diǎn)（WT:MT = 2:1)的檢測結(jié)果
[0101] 圖5為235野生型基因組DNA和235delC純合突變型基因組DNA檢測結(jié)果

【具體實(shí)施方式】
[0102] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0103] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0104] 以下具體實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。以下實(shí)施例中的定 量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0105] 圖1為本發(fā)明檢測方法示意圖
[0106] 實(shí)施例1、基于高通量測序技術(shù)的SNP檢測5個耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)混合質(zhì)粒樣本
[0107] 本實(shí)例檢測所有耳聾位點(diǎn)，采用的所有耳聾位點(diǎn)相關(guān)質(zhì)粒均由博奧生物集團(tuán)有限 公司構(gòu)建，所有質(zhì)粒均經(jīng)過測序驗(yàn)證其序列正確，相關(guān)質(zhì)粒序列信息如下表1，突變類型有 SNP突變或者缺失/插入突變：
[0108] 表1為耳聾位點(diǎn)相關(guān)質(zhì)粒序列信息
[0109]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于高通量測序檢測待測樣本中突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟： 1)針對已知突變位點(diǎn)所在的靶序列設(shè)計檢測探針和預(yù)擴(kuò)增引物對， 所述突變位點(diǎn)為SNP位點(diǎn)、插入突變位點(diǎn)和/或缺失突變位點(diǎn)； 所述檢測探針為1個或多個用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A和/或1個或多個用于檢 測插入或缺失突變位點(diǎn)的檢測探針B ;所述每個檢測探針A或每個檢測探針B對應(yīng)一個所 述突變位點(diǎn)； 所述用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A由上游位點(diǎn)分型探針ASO-A和下游位點(diǎn)特異探針 LSO-A組成，且所述ASO-A探針和所述LSO-A探針的延伸方向相同； 所述ASO-A的3'端與SNP野生型堿基所在靶序列或SNP突變位點(diǎn)堿基所在靶序列相 同或互補(bǔ)；所述ASO-A的3'末端堿基與所述SNP野生型堿基或所述SNP突變位點(diǎn)堿基相同 或互補(bǔ)； 所述ASO-A探針的5'端游離于所述SNP野生型堿基所在靶序列或所述SNP突變位點(diǎn) 堿基所在靶序列之外，且為通用探針P1 ; 所述SNP突變位點(diǎn)每個突變形式對應(yīng)一條ASO-A探針； 所述LSO-A探針的5'端與所述SNP野生型堿基所在靶序列或SNP突變位點(diǎn)堿基所在 靶序列相同或互補(bǔ)，且其5'末端堿基與所述SNP野生型堿基所在靶序列或SNP突變位點(diǎn)堿 基所在靶序列按照探針延伸方向SNP位點(diǎn)下游第一個緊鄰堿基相同或互補(bǔ)，且5'末端堿基 磷酸化，所述LSO-A探針3'端游離于所述靶序列之外且為通用探針P2 ; 所述用于檢測插入/缺失突變位點(diǎn)的檢測探針B由1條用于檢測插入/缺失突變位點(diǎn) 的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B、1條用于檢測野生型位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B和1條下 游位點(diǎn)特異探針LSO-B組成，且3條探針的延伸方向相同； 所述用于檢測插入/缺失突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B為用于檢測插入突變位 點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B或用于檢測插缺失突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B ; 所述用于檢測插入突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B的3'端與插入突變位點(diǎn)所在 的靶序列相同或互補(bǔ)，且其3'末端堿基與所述插入突變位點(diǎn)序列的最后一位堿基相同或互 補(bǔ)； 所述用于檢測缺失突變位點(diǎn)的上游位點(diǎn)分型探針ASO-B的3'端與缺失突變位點(diǎn)所在 的靶序列相同或互補(bǔ)，且其3'末端堿基與所述野生型位點(diǎn)所在靶序列上缺失突變位點(diǎn)序列 中第一位堿基的上游緊鄰堿基相同或互補(bǔ)； 所述插入/缺失突變位點(diǎn)所在的靶序列為所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列的第n個堿基 前插入或者缺失突變位點(diǎn)得到的序列； 所述用于下游位點(diǎn)特異探針LSO-B的5'端與所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列相同或互 補(bǔ)，且其5'末端堿基與所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列沿探針延伸方向第n位堿基相同或互 補(bǔ)； 所述LSO-B探針的3'端游離于所述野生型位點(diǎn)所在的靶序列之外且為通用探針P2 ; 每個突變位點(diǎn)的每條所述上游位點(diǎn)分型探針ASO與其對應(yīng)的下游位點(diǎn)特異探針LSO均 可無間隙、非重疊拼接為該突變位點(diǎn)對應(yīng)的目的靶序列反向互補(bǔ)序列； 所述預(yù)擴(kuò)增引物對為1個或多個預(yù)擴(kuò)增引物對，所述預(yù)擴(kuò)增引物對為能夠擴(kuò)增出1個 或多個突變位點(diǎn)所在靶序列的引物對；且每個所述預(yù)擴(kuò)增引物對中的一條引物的5'端標(biāo) 記 biotin ; 2) 用1個所述預(yù)擴(kuò)增引物對或多個所述預(yù)擴(kuò)增引物對待測樣本進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，得到 biotin標(biāo)記核酸； 3) 用一個所述檢測探針A、多個所述檢測探針A的混合物、一個所述檢測探針B和/或 多個所述檢測探針B的混合物與所述biotin標(biāo)記核酸雜交，得到雜交產(chǎn)物； 4) 用DNA連接酶連接所述雜交產(chǎn)物，得到測序靶序列； 5) 用Barcode特異性引物和Common primer引物對測序祀序列進(jìn)行擴(kuò)增、高通量測序， 得到測序靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果； 所述Barcode特異性引物和Common primer引物的3'端20個堿基分別與所述通用探 針P1和所述通用探針P2互補(bǔ)； 所述Barcode特異性引物中含有用于區(qū)分樣本的Barcode序列XXXXXX，該序列為A、T、 C和G隨機(jī)組合的6堿基，根據(jù)不同的組合方式確定不同的樣本； 6) 分析所述測序結(jié)果，確定待測樣本是否含有該突變位點(diǎn)或確定該突變位點(diǎn)的基因 型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 步驟1)中， 所述檢測探針為多個用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A和多個用于檢測缺失或插入突變 位點(diǎn)的檢測探針B ; 所述檢測探針中的每條探針均為等摩爾混合； 步驟2)中，所述多個所述預(yù)擴(kuò)增引物對混合物為多個所述預(yù)擴(kuò)增引物對等摩爾比混 合； 所述待測樣本為一個或多個，每一種Barcode特異性引物對應(yīng)一種待測樣本； 步驟3)中，所述多個所述檢測探針A的混合物為多個所述檢測探針A等摩爾比混合； 所述多個所述檢測探針B的混合物為多個所述檢測探針B等摩爾比混合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 步驟2)中，在所述預(yù)擴(kuò)增的步驟后，還包括如下步驟：向所述預(yù)擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物中加 入核酸外切酶I和堿性磷酸酶去除預(yù)擴(kuò)增體系中的引物和dNTP，得到biotin標(biāo)記核酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 在步驟3)中，在所述雜交中，用磁珠吸附捕獲所述雜交產(chǎn)物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于： 在步驟5)中，所述測序采用二代測序儀器進(jìn)行。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述檢測探針為2個用于檢測SNP位點(diǎn)的檢測探針A和3個用于檢測缺失或插入突變 位點(diǎn)的檢測探針B組成； 所述 SNP 位點(diǎn)為 1494C>T 和 IVS7-2A>G ; 所述缺失或插入突變位點(diǎn)為235delC、176DEL16和299delAT ; 所述1494C>T對應(yīng)的檢測探針A由序列表中序列21所示的AS0-A探針、序列表中序列 22所示的AS0-A探針、序列表中序列23所示的AS0-A探針、序列表中序列24所示的AS0-A 探針和序列表中序列25所示的LS0-A探針組成； 所述IVS7-2A>G對應(yīng)的檢測探針A由序列表中序列7所示的ASO-A探針、序列表中序 列8所示的AS0-A探針、序列表中序列9所示的AS0-A探針、序列表中序列10所示的AS0-A 探針和序列表中序列11所示的LS0-A探針組成； 所述235delC對應(yīng)的檢測探針B由序列表中序列15所示的AS0-B探針、序列表中序列 16所示的AS0-A探針和序列表中序列17所示的LS0-B探針組成； 所述176DEL16對應(yīng)的檢測探針B由序列表中序列12所示的AS0-B探針、序列表中序 列13所示的AS0-A探針和序列表中序列14所示的LS0-B探針組成； 所述299delAT對應(yīng)的檢測探針B由序列表中序列18所示的AS0-B探針、序列表中序 列19所示的AS0-A探針和序列表中序列20所示的LS0-B探針組成； 所述預(yù)擴(kuò)增引物由用于擴(kuò)增176dell6、299delAT、235delC三個突變位點(diǎn)的引物對1、 用于擴(kuò)增1494CXT位點(diǎn)的引物對2和用于擴(kuò)增IVS7-2A>G位點(diǎn)的引物對3組成； 所述引物對1由序列表中序列28所示的單鏈DNA分子和序列表中序列29所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對2由序列表中序列26所示的單鏈DNA分子和序列表中序列27所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對3由序列表中序列30所示的單鏈DNA分子和序列表中序列31所示的單鏈 DNA分子組成。
7. -種用于檢測突變位點(diǎn)的試劑盒,包括權(quán)利要求6中所述的1494C>T對應(yīng)的檢測探 針A、所述IVS7-2A>G對應(yīng)的檢測探針A、所述235delC對應(yīng)的檢測探針B、所述176DEL16 對應(yīng)的檢測探針B、所述299delAT對應(yīng)的檢測探針B、所述用于擴(kuò)增176dell6、299delAT、 235delC三個突變位點(diǎn)的引物對1、所述用于擴(kuò)增1494C>T位點(diǎn)的引物對2和所述用于擴(kuò)增 IVS7-2A>G位點(diǎn)的引物對3 ; 所述突變位點(diǎn)為 1494C>T、IVS7-2A>G、235delC、176DEL16 和 299delAT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372093SQ201410643497
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】王棟, 王輝, 張巖, 項(xiàng)光新, 孫義民, 邢婉麗, 程京 申請人:博奧生物集團(tuán)有限公司, 清華大學(xué)