與薺菜抗藥性相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了與薺菜抗藥性相關(guān)的分子標(biāo)記和用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的特異性PCR引物對，包括用于特異性擴增薺菜JC-ALS基因的引物對。采用該引物的PCR檢測方法具有極好的特異性和靈敏性，能夠?qū)崿F(xiàn)對田間疑似抗ALS抑制劑薺菜的快速鑒定和突變位點的確認(rèn)，從而指導(dǎo)生產(chǎn)實踐中抗性雜草的科學(xué)治理。
【專利說明】與薺菜抗藥性相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗除草劑雜草檢測技術(shù)，具體地說，涉及與薺菜抗藥性相關(guān)的分子標(biāo) 記及其檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase,簡稱ALS)，也稱乙酰輕酸合酶 (acetohydroxyacid synthase,簡稱AHAS)，是誘導(dǎo)植物和微生物體內(nèi)繳氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸的生物合成過程中關(guān)鍵性酶，也是一種重要的除草劑靶標(biāo)。ALS抑制劑類除草劑的開發(fā) 及使用始于上世紀(jì)80年代初，由于此類除草劑有超高活性、對人及動物低毒、環(huán)境友好等 明顯的優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注，目前已有50多個品種被開發(fā)和使用。上世紀(jì)80年代開始，我 國陸續(xù)在冬小麥田推廣使用苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、雙氟磺草胺、啶磺草胺等，2009年僅苯 磺隆在我國的產(chǎn)量就達230多噸（有效成分），相當(dāng)于麥田化除面積2億多畝。苯磺隆作為 小麥田最經(jīng)濟、有效的優(yōu)秀除草劑，對控制薺菜等闊葉雜草起到了非常重要的作用。但由于 該類除草劑分子靶標(biāo)單一，長期使用易引起雜草抗藥性，近些年來，以常規(guī)劑量噴施苯磺隆 無法有效防除薺菜的問題在我國河北、陜西、山東、河南、山西、江蘇等地的一些麥田非常突 出，并且發(fā)現(xiàn)，有些麥田抗苯磺隆的薺菜對雙氟磺草胺等ALS抑制劑也產(chǎn)生了交互抗性。麥 田雜草對上述幾種ALS抑制劑產(chǎn)生交互抗性，使這些農(nóng)田不能繼續(xù)使用該類除草劑，而在 生產(chǎn)中由于農(nóng)民對雜草抗藥性的認(rèn)識上的不足，盲目增大用藥劑量，不僅增加了成本，使藥 害風(fēng)險加大，嚴(yán)重影響農(nóng)民收入和國家糧食安全。因此，目前迫切需要一個簡便，快速的抗 藥性雜草檢測鑒定方法。
[0003] 我國抗藥性雜草的研究起步較晚，傳統(tǒng)的抗藥性雜草檢測通常采用室內(nèi)生物測定 法，既對田間采集的疑似抗性的雜草的種子在室內(nèi)進行培養(yǎng)，在一定葉齡噴施除草劑后，調(diào) 查株防效和地上部分生物量來計算抗性指數(shù)。這種方法能夠客觀地評價某種雜草對相應(yīng)除 草劑的抗性情況，但也有其局限性，主要表現(xiàn)在以下兩方面：一是不能當(dāng)季、當(dāng)時進行檢測， 二是占地多、時間長、工作量大。
[0004] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)在雜草抗藥性機理研究方面的應(yīng)用，越來越多的雜草的 抗藥性機理得到明確。目前已有的研究報道顯示，對ALS抑制劑產(chǎn)生抗性的植物在其 革巴標(biāo)酶 ALS 保守區(qū)共發(fā)現(xiàn)了 8 個 SNP 位點（http: //www. weedscience. org/Mutations/ MutationDisplayAll. aspx)，這些位點的任意一個位點氨基酸突變?yōu)槠渌被岫际怪参?對相應(yīng)除草劑產(chǎn)生抗性。這8個氨基酸位點目前公認(rèn)以擬南芥ALS為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)注位點，包括 122、197、205、376、377、574、653、654位氨基酸（圖3)。其中，薺菜對苯磺隆等ALS抑制劑 類除草劑產(chǎn)生抗性的原因也已證實與編碼ALS保守區(qū)某一位點發(fā)生點突變相關(guān)。研究報道 中只克隆了薺菜的一個ALS基因，但我們在研究中發(fā)現(xiàn)，薺菜具有兩個ALS基因，分別命名 為JC-ALS-I和JC-ALS-2,這兩個基因都具有功能，任意一個基因在保守區(qū)發(fā)生突變，都能 夠引起抗藥性產(chǎn)生。因此，可以通過分子生物學(xué)手段檢測其靶標(biāo)酶ALS的保守區(qū)突變位點 來檢測薺菜是否發(fā)生抗藥性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種抗乙酰乳酸合酶抑制 劑類除草劑薺菜的檢測方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供與薺菜抗藥性相關(guān)的分子標(biāo)記，所述分 子標(biāo)記為：
[0007] (1)核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的JC-ALS-I基因；所編碼的蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No. 3所示；其中，編碼第373位氨基酸的密碼子發(fā)生GAT-GAA堿基突變，或編 碼第571位氨基酸的密碼子發(fā)生TGG-TTG堿基突變，導(dǎo)致薺菜抗藥性出現(xiàn)多態(tài)性；
[0008] 或（2)核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的JC-ALS-2基因；所編碼的蛋白的氨基酸 序列如SEQ ID No. 4所示；其中，編碼第372位氨基酸的密碼子發(fā)生GAT-GAA堿基突變，或 編碼第570位氨基酸的密碼子發(fā)生TGG-TTG堿基突變，導(dǎo)致薺菜抗藥性出現(xiàn)多態(tài)性；
[0009] 所述抗藥性具體表現(xiàn)為抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑。
[0010] 需要指出的是，JC-ALS-I基因發(fā)生堿基突變，導(dǎo)致翻譯的氨基酸發(fā)生變化的第 373位和第571位氨基酸位點，若以擬南芥ALS氨基酸順序，則分別為376位和574位。同 樣，JC-ALS-2基因發(fā)生堿基突變，導(dǎo)致翻譯的氨基酸發(fā)生變化的第372位和第570位氨基 酸位點，若以擬南芥ALS氨基酸順序，則分別為376位和574位。
[0011] 因此，本發(fā)明所述分子標(biāo)記翻譯的氨基酸序列，相對于擬南芥ALS氨基酸順序來 說，由于在編碼第376位氨基酸的密碼子發(fā)生GAT-GAA堿基突變，使得該位置氨基酸由Asp 變?yōu)镚lu ;或由于在編碼第574位氨基酸的密碼子發(fā)生TGG-TTG堿基突變，使得該位置氨基 酸由Trp變?yōu)長eu。
[0012] 為了敘述簡潔，本發(fā)明在后文中將利用擬南芥ALS氨基酸順序，對所述分子標(biāo)記 導(dǎo)致的氨基酸突變位點進行描述。
[0013] 本發(fā)明還提供了用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的特異性PCR引 物對，包括用于特異性擴增薺菜JC-ALS-I基因和JC-ALS-2基因的引物對，引物對的核苷酸 序列如下：
[0014] 正向引物 JC-ALS-F : 5' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3，；
[0015] 反向引物 JC-ALS-R : 5' -GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
[0016] 本發(fā)明還進一步提供了用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的試劑盒， 所述試劑盒含有前述引物對。
[0017] 作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的 至少一種。
[0018] 更為優(yōu)選，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0019] 本發(fā)明還提供一種抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的PCR檢測方法，利用前 述引物對或試劑盒檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑的薺菜。
[0020] 進一步地，所述PCR檢測方法具體包括以下步驟：
[0021] 1)提取樣品中的DNA ;
[0022] 2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用前述引物對或試劑盒進行PCR擴增反應(yīng)；
[0023] 3)分析PCR產(chǎn)物。
[0024] PCR反應(yīng)體系以20 μ 1計為：
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 與莽菜抗藥性相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記為： (1)核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的JC-ALS-I基因；所編碼的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 3所示；其中，編碼第373位氨基酸的密碼子發(fā)生GAT-GAA堿基突變，或編碼第 571位氨基酸的密碼子發(fā)生TGG-TTG堿基突變； 或（2)核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的JC-ALS-2基因；所編碼的蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID No. 4所示；其中，編碼第372位氨基酸的密碼子發(fā)生GAT-GAA堿基突變，或編碼 第570位氨基酸的密碼子發(fā)生TGG-TTG堿基突變； 所述抗藥性具體表現(xiàn)為抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑。
2. 用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的特異性PCR引物對，其特征在于， 包括用于特異性擴增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物對，引物對的核苷酸序列如下： 正向引物 JC-ALS-F :5' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3，； 反向引物 JC-ALS-R :5' -GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
3. 用于檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 含有權(quán)利要求2所述引物對。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
6. 抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑薺菜的PCR檢測方法，其特征在于，利用權(quán)利要求 2所述引物對或權(quán)利要求3-5任一項所述試劑盒檢測抗乙酰乳酸合酶抑制劑類除草劑的薺 菜。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣品中的DNA ; 2) 以步驟1)中提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述引物對或權(quán)利要求3-5任一項 所述試劑盒進行PCR擴增反應(yīng)； 3) 分析PCR產(chǎn)物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以20 μ 1計為：
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3分鐘； 94°C變性1分鐘，55. 3°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。
【文檔編號】C12N15/11GK104388559SQ201410643602
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】崔海蘭, 李香菊, 張宏軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所