一株膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株,其培養(yǎng)方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株膠凍樣類芽胞桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)高產(chǎn)菌株KN-18，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO∶M2014321。該菌株具有極強的解硅能力和產(chǎn)芽孢能力，菌株發(fā)酵液的解硅能力可以達(dá)到26.8μg/ml，顯著優(yōu)于出發(fā)菌株和其它膠凍樣類芽胞桿菌。本發(fā)明還公開了一種培養(yǎng)所述膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株的方法，采用該方法得到的發(fā)酵液其芽胞數(shù)高達(dá)20億/ml，顯著優(yōu)于其它培養(yǎng)方法。本發(fā)明的膠凍樣類芽胞桿菌作為生物肥料用在水稻上能使水稻株高增長5％以上，稻穗長增加4％以上，實粒數(shù)增加7％以上，畝產(chǎn)量增加9％以上；用在甜瓜上能使甜瓜提前2天成熟，單株著瓜個數(shù)多0.1個，單果重量增加5％以上，畝產(chǎn)量增加9％以上。CCTCC NO∶M201432120140704
【專利說明】一株膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株，其培養(yǎng)方法及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說，本發(fā)明涉及一株膠凍樣類芽胞桿 菌高產(chǎn)菌株，還涉及所述菌株的培養(yǎng)方法及其作為生物肥料的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 土壤中硅含量不足是限制作物產(chǎn)量的一個關(guān)鍵因素，硅元素首先以硅凝膠的形式 在植物根部和葉面的表面組織上凝聚，增厚的表面增加了植物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，改善了植物 的受光角度，從而促進(jìn)植物生長，此外，硅元素在植物組織的沉淀還減少了蒸發(fā)作用，從而 減少了干旱和鹽堿的影響。硅酸鹽細(xì)菌可以分解土壤及礦物中的硅，為植物提供充足的硅 元素。
[0003] 膠凍樣類芽胞桿菌又名膠質(zhì)芽孢桿菌，國內(nèi)通常稱之為硅酸鹽細(xì)菌。它能分解正 長石和磷灰石釋放出磷、鉀元素。膠凍樣類芽胞桿菌具有轉(zhuǎn)化土壤中的云母、長石等穩(wěn)定硅 酸鹽礦物的特殊功能，不僅能提高作物的產(chǎn)量，增加抗逆性，而且還增加了土壤肥力，且當(dāng) 其在土壤中繁殖為優(yōu)勢菌群后，還可以達(dá)到抑制病原菌的效果。
[0004] 目前，在世界范圍內(nèi)限制農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的主要因素之一就是土壤貧瘠，肥力下降，補充 作物生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)元素已經(jīng)成為獲得穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)不可或缺的重要措施。土壤中含 有大量的硅，但絕大多數(shù)處于結(jié)晶體中，不能被植物吸收利用。硅酸鹽細(xì)菌能夠轉(zhuǎn)化土壤中 晶體結(jié)構(gòu)的硅成植物能利用吸收的多硅酸、單硅酸及各種易于轉(zhuǎn)化為單硅酸的硅形態(tài)。
[0005] 然而，現(xiàn)有的膠凍樣類芽胞桿菌解硅能力不強，而且產(chǎn)芽孢能力很差，從而限制了 它作為硅肥的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株具有強解硅能力和高產(chǎn)芽孢能力的膠凍樣類芽胞桿菌 菌株及其培養(yǎng)方法和用途。
[0007] 本發(fā)明是通過下述方案實現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明首先以保藏在中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC)的膠凍樣類芽胞 桿菌（保藏號為ACCC01429)菌株作為出發(fā)型菌株，通過N離子束誘變，以平板解硅圈大小 來挑選，再通過搖瓶解硅和搖瓶發(fā)酵芽胞形成率實驗進(jìn)行驗證，并在土壤中進(jìn)行解硅能力 的測定，最終獲得了這一株膠凍樣類芽胞桿菌（Paenibacillus mucilaginosus)高產(chǎn)菌株 KN-18,該菌株已于2014年7月4日在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保 藏中心（CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO : M2014321。
[0009] 所述膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)方法，它包括以下步驟：
[0010] 1)菌種活化：將上述膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株KN-18接種至斜面培養(yǎng)基，在溫 度28°C下培養(yǎng)24小時；
[0011] 所述斜面培養(yǎng)基的組成如下：蔗糖5-15%、磷酸氫二鉀0.03-2%、二氧化 硅0. 2-1. 5 %、硫酸鎂0. 01-1 %、碳酸鈣0. 05-0. 5 %、酵母抽提物0. 02-0. 1 %、瓊脂粉 I. 5-2%, pH7. 2-7. 4 ；
[0012] 2)種子培養(yǎng)：在500ml三角瓶中裝入50ml液體種子培養(yǎng)基，滅菌，然后把步驟I) 得到的活化菌種接至種子培養(yǎng)基中，在32°C、180rpm的條件下培養(yǎng)16-20小時，制得種子 液；
[0013] 所述種子培養(yǎng)基的組成如下：淀粉1.5-2. 5%，酵母抽提物0.5-1%、蔗糖 0· 1-0. 5%、磷酸氫二鉀 0· 1-0. 5%、碳酸鈣 0· 1-0. 5%、二氧化硅 0· 1-0. 5%，ρΗ7· 2-7. 5 ;
[0014] 3)發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液取2. 5-3ml接入25-30ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32°C、 180rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)40-48小時，得到發(fā)酵液；
[0015] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：淀粉1. 5-2%、酵母抽提物0. 5-1 %、蔗糖1-2%、 酵母粉〇· 5-1 %、磷酸氫二鉀0· 02-0. 05 %、硫酸鎂0· 1-0. 2 %、碳酸鈣0· 05-0. 1 %， ρΗ7· 2-7. 5〇
[0016] 本發(fā)明還涉及所述膠凍樣類芽胞桿菌菌株在制備生物肥料中的用途，特別是在制 備生物硅肥中的用途。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 1)本發(fā)明通過人工誘變和篩選得到的膠凍樣類芽胞桿菌具有極強的解硅能力，該 菌株發(fā)酵液的解硅能力可以達(dá)到26. 8 μ g/ml，顯著優(yōu)于出發(fā)菌株和其它膠凍樣類芽胞桿 菌。
[0019] 2)本發(fā)明獲得的膠凍樣類芽胞桿菌菌株具有極強的產(chǎn)芽孢能力，通過本發(fā)明的培 養(yǎng)方法得到的發(fā)酵液其芽胞數(shù)高達(dá)20億/ml，顯著優(yōu)于其它培養(yǎng)方法。
[0020] 3)本發(fā)明所獲得的膠凍樣類芽胞桿菌作為生物肥料用在水稻上能使水稻株高增 長5%以上，稻穗長增加4%以上，實粒數(shù)增加7%以上，畝產(chǎn)量增加9%以上，效果明顯優(yōu)于 其它膠凍樣類芽胞桿菌；用在甜瓜上能使甜瓜提前2天成熟，單株著瓜個數(shù)多0. 1個，單果 重量增加5%以上，畝產(chǎn)量增加9%以上，效果明顯優(yōu)于其它膠凍樣類芽胞桿菌。

【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。
[0022] 實施例1膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株的獲得
[0023] 1.制備出發(fā)型菌株的菌體
[0024] 挑選出發(fā)菌（膠凍樣類芽胞桿菌ACCC01429)單菌落，接入含有淀粉1%、酵母抽提 物0. 5%，氯化鈉0. 5%，pH7. 2-7. 5的簡單培養(yǎng)基中，在32°C與180rpm的恒溫?fù)u床上培養(yǎng) 16-24h，然后，取50ml發(fā)酵液離心收集菌體待用。
[0025] 2. N離子束誘變強解硅性能及高產(chǎn)芽胞菌株的篩選
[0026] 取步驟1制備的菌體用5ml無菌水溶解震蕩均勻，取0. 5ml涂于在無菌培養(yǎng)皿 并吹干，采用TITAN離子束注入機對菌體進(jìn)行N離子束注入，能量為30keV，注入劑量為 I X 1016ion/cm2，注入后再用5ml無菌水清洗培養(yǎng)皿上的菌體，稀釋IO3倍后取50 μ 1涂布固 體含硅培養(yǎng)基平板，在溫度28°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5-7d。
[0027] 所述固體含硅培養(yǎng)基的組成是：蔗糖5-10%、酵母抽提物0. 1-0. 5%、二氧化 硅 0. 2-1 %、氯化鈉 0. 02-0. 05 %、硫酸鎂 0. 02-0. 05 %、碳酸鈣 0. 05-0. 2 %、瓊脂粉 2 %， ρΗ7· 2-7. 5〇
[0028] 膠凍樣類芽胞桿菌其重要特性是能夠分解出長石、云母等礦物中的鉀、硅，也能分 解出磷灰石中的磷合成出有機酸、氨基酸、多糖等各種代謝產(chǎn)物。搖瓶試驗表明，這些有機 酸、氨基酸、多糖代謝產(chǎn)物具有絡(luò)合礦物中各種金屬離子的有機基團，并且它們本身也具有 一定的酸溶作用，因此它們均能夠破壞高嶺石晶體結(jié)構(gòu)，釋放出其晶體中存在的硅。所以在 初篩固體平板培養(yǎng)基中加入二氧化硅，經(jīng)過培養(yǎng)后，平板上會出現(xiàn)明顯的解硅透明圈。
[0029] 經(jīng)過5-7d的培養(yǎng)后，平板上出現(xiàn)明顯的環(huán)狀解硅圈透明帶，根據(jù)N離子束誘變 效果差異，解硅圈透明帶寬度l-6mm，經(jīng)過三十多次反復(fù)實驗，終于發(fā)現(xiàn)一株透明帶寬約 12_、芽胞形成率高的菌株，于2014年7月4日在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典 型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)進(jìn)行保藏，保藏編號為CCTCC N0:M2014321。
[0030] 3.搖瓶芽孢形成能力和解硅能力的驗證
[0031] 取保藏好的菌種，解凍后接入種子培養(yǎng)基中，同時取原始菌株和其它透明帶較窄 的菌株（3株）做對照試驗，使用恒溫?fù)u床在溫度32°C與180rpm的條件下培養(yǎng)16-24h，然 后取種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵搖瓶，在恒溫?fù)u床，32°C，ISOrpm的條件下培養(yǎng)40-48h。然后取發(fā)酵 液10ml，稀釋2倍，在12000-18000rpm的條件下離心5min，去除菌體。取上清液，然后采用 本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員熟知的鉬藍(lán)比色法（參見"土壤農(nóng)化分析第三版"，中國農(nóng)業(yè)出版社出 版，2000年）測定該上清液中的可溶性硅。根據(jù)在該上清液中可溶性硅含量可以判斷這些 菌的解硅能力大??；取搖瓶發(fā)酵液，常規(guī)涂片，用堿性石炭酸復(fù)紅染色，用奧林巴斯顯微鏡 油鏡（16X100倍）觀察發(fā)酵芽胞形成率，采用本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員熟知的飼料中細(xì)菌總數(shù) 的測定方法（參見GB/T13093-2006)，測定該發(fā)酵液中芽胞的含量，從而判斷這些菌的芽胞 形成率高低。
[0032] 經(jīng)解硅能力測定，本發(fā)明的菌株在搖瓶中的解硅能力可以達(dá)到26.8yg/ml，而所 述的出發(fā)菌株ACCC01429其搖瓶解硅能力為6. 3 μ g/ml，本發(fā)明是它的4. 25倍；對照菌株 如解硅圈為3_的單菌落其搖瓶解硅能力為15. 2 μ g/ml，本發(fā)明是它的1. 76倍；解硅圈為 4mm的單菌落其搖瓶解娃能力17. 9 μ g/ml，本發(fā)明是它的1. 5倍；解娃圈為5mm的單菌落其 搖瓶解硅能力22. 1 μ g/ml，本發(fā)明是它的L 21倍。
[0033] 經(jīng)過芽胞計數(shù)測定，本發(fā)明的膠凍樣類芽胞桿菌菌株在搖瓶中的芽胞數(shù)達(dá)到20 億/ml，比所述的出發(fā)菌株提高了 167%，比其它三株對照菌株分別提高了 74%、81%和 88%〇
[0034] 4.菌株鑒定
[0035] 所獲膠凍樣類芽胞桿菌（Paenibacillus mucilaginosus)菌株具有如下特征：
[0036] 1)菌體形態(tài)特征：菌體粗、稍彎曲長桿狀有厚莢膜，菌體著色均勻，菌體大小為 (I. 0 ?I. 2) X (2. 5 ?7. 0) μ-- ;
[0037] 2)芽胞形態(tài)特征：芽胞囊微膨大，橢圓形中生，芽胞內(nèi)不著色。
[0038] 3)菌落形態(tài)特征：在硅酸鹽細(xì)菌專用培養(yǎng)基平板上菌落為圓形，如半粒玻璃球， 凸起，凸起度大于45度；無色透明，5-6d中部有淡黃色的渾濁點，邊緣透明，表面光滑；粘 稠，彈性大，可拉成絲狀；好氧或兼性厭氧生長。
[0039] 4)生理生化特征：革蘭氏染色陰性，在植物根際具有解磷、解鉀、解硅礦物作用， 有一定固氮作用。
[0040] 5)微生物學(xué)特性：好氧或兼性厭氧生長，接觸酶反應(yīng)陽性，氧化酶或卵磷脂酶反 應(yīng)陰性，在無氮培養(yǎng)基上生長良好，能很好地利用葡萄糖、蔗糖作為碳源，在酵母浸膏粉、蛋 白胨、氯化鈉培養(yǎng)基中略弱，只能形成很薄的莢膜，能水解淀粉，生長溫度l〇-45°C。
[0041] 實施例2菌株的培養(yǎng)
[0042] 本發(fā)明膠凍樣類芽孢桿菌的培養(yǎng)方法步驟如下：
[0043] 1)菌種活化：將保藏編號為CCTCC N0:M2014321的膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株接 種至斜面培養(yǎng)基，在溫度28°C下培養(yǎng)24小時；
[0044] 所述斜面培養(yǎng)基的組成如下：蔗糖5-15%、磷酸氫二鉀0.03-2%、二氧化 硅0. 2-1. 5 %、硫酸鎂0. 01-1 %、碳酸鈣0. 05-0. 5 %、酵母抽提物0. 02-0. 1 %、瓊脂粉 1. 5-2%, pH7. 2-7. 4 ；
[0045] 2)種子培養(yǎng)：在500ml三角瓶中裝入50ml液體種子培養(yǎng)基，滅菌，然后把步驟1) 得到的活化菌種接至種子培養(yǎng)基中，在32°C、180rpm的條件下培養(yǎng)16-20小時，制得種子 液；
[0046] 所述種子培養(yǎng)基的組成如下：淀粉1.5-2. 5%，酵母抽提物0.5-1 %、蔗糖 0· 1-0. 5%、磷酸氫二鉀 0· 1-0. 5%、碳酸鈣 0· 1-0. 5%、二氧化硅 0· 1-0. 5%，ρΗ7· 2-7. 5 ;
[0047] 3)發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液取2. 5-3ml接入25-30ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32°C、 180rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)40-48小時，得到發(fā)酵液；
[0048] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：淀粉1. 5-2%、酵母抽提物0. 5-1%、蔗糖1-2%、酵母 粉 0· 5-1%、磷酸氫二鉀(λ 02-0. 05%、硫酸鎂 0· 1-0. 2%、碳酸鈣(λ 05-0. 1%，ρΗ7· 2-7. 5。
[0049] 得到的發(fā)酵液中活芽胞數(shù)達(dá)到了 20億/ml。
[0050] 實施例3田間應(yīng)用試驗
[0051] 下面對保藏編號為CCTCC N0:M2014321的膠凍樣類芽胞桿菌進(jìn)行了水稻和甜瓜的 田間應(yīng)用試驗。
[0052] -.膠凍樣類芽胞桿菌的水稻田間應(yīng)用試驗
[0053] 1.試驗田選擇：試驗田為沙泥田，質(zhì)地中壤，肥力中等，前茬為油菜，試驗前對耕 層進(jìn)行了取土分析，有機質(zhì)16. 501g/kg，堿解氮85mg/kg，有效磷7. 2mg/kg，速效鉀76mg/ kg，PH值為5. 2,供試作物為雜交中稻揚兩優(yōu)6號；
[0054] 2.試驗設(shè)計：
[0055] 處理1 :常規(guī)施肥+膠凍樣類芽孢桿菌CCTCC NO:M2014321菌肥；
[0056] 膠凍樣類芽孢桿菌CCTCC N0:M2014321菌肥的制備：云母粉與膠凍樣類芽胞桿菌 菌粉混合成10億芽胞數(shù)/g粉末；
[0057] 處理2 :常規(guī)施肥+同處理1等量的膠凍樣類芽胞桿菌ACCC01429 ;
[0058] 處理3:常規(guī)施肥處理；
[0059] 試驗小區(qū)面積20平方米，隨機排列，四次重復(fù)。
[0060] 試驗主要操作：移栽前常規(guī)施肥畝施N-P-K為16 : 5 : 9的復(fù)合肥50 kg外；另處 理1加畝施10公斤膠凍樣類芽孢桿菌CCTCC N0:M2014321菌肥，處理2加畝施等量的膠凍 樣類芽胞桿菌ACCC01429菌肥，處理3加畝按常規(guī)施肥，其他管理按常規(guī)。
[0061] 3.試驗結(jié)果及分析
[0062] 1)中稻試驗考種結(jié)果
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一株膠凍樣類芽胞桿菌（Paenibacillus mucilaginosus)高產(chǎn)菌株KN-18,保藏在 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO : M2014321。
2. -種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于包括以下 步驟： 1) 菌種活化：將權(quán)利要求1所述膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株接種至斜面培養(yǎng)基，在溫 度28°C下培養(yǎng)24小時； 所述的斜面培養(yǎng)基的組成如下：蔗糖5-15%、磷酸氫二鉀0.03-2%、二氧化硅 0. 2-1. 5 %、硫酸鎂0. 01-1 %、碳酸鈣0. 05-0. 5 %、酵母抽提物0. 02-0. 1 %、瓊脂粉 1. 5-2%, pH7. 2-7. 4 ； 2) 種子培養(yǎng)：在500ml三角瓶中裝入50ml液體種子培養(yǎng)基，滅菌，然后把步驟1)得到 的活化菌種接至種子培養(yǎng)基中，在32°C、180rpm的條件下培養(yǎng)16-20小時，制得種子液； 所述種子培養(yǎng)基的組成如下：淀粉1.5-2. 5%，酵母抽提物0.5-1 %、蔗糖0. 1-0. 5%、 磷酸氫二鉀 〇? 1-0. 5%、碳酸鈣 0? 1-0. 5%、二氧化硅 0? 1-0. 5%，pH7. 2-7. 5 ; 3) 發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液取2. 5-3ml接入25-30ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32°C、 180rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)40-48小時，得到發(fā)酵液； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：淀粉1. 5-2%、酵母抽提物0. 5-1%、蔗糖1-2%、酵母粉 0? 5-1%、磷酸氫二鉀 0? 02-0. 05%、硫酸鎂 0? 1-0. 2%、碳酸鈣 0? 05-0. 1%，pH7. 2-7. 5。
3. 權(quán)利要求1所述的膠凍樣類芽胞桿菌高產(chǎn)菌株在制備生物肥料中的用途。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述生物肥料為生物硅肥。
【文檔編號】C12R1/01GK104480035SQ201410647069
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】余娜, 程治國, 劉華梅, 周莉, 唐緯坤, 鄒偉, 楊克華, 王曉輝, 姚金伍, 顧志勝, 李青 申請人:武漢科諾生物科技股份有限公司